AMPK在肝臟生理和病理過程中的作用

劉書東

(山東省榮軍總醫(yī)院,山東 濟南 250013)

AMPK在肝臟生理和病理過程中的作用

劉書東

(山東省榮軍總醫(yī)院,山東 濟南 250013)

腺苷酸激活蛋白激酶；葡萄糖代謝；脂代謝；2型糖尿病

肝臟是維持機體穩(wěn)態(tài)和進行物質(zhì)代謝的重要器官，可根據(jù)機體生理環(huán)境的變化而變化物質(zhì)代謝方式，如饑餓時肝細胞通過糖異生途徑維持血糖相對恒定，飽食時則促進糖原、三酰甘油合成。而腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase，AMPK) 是細胞和機體關鍵的能量感受器，在應激情況下，AMPK磷酸化后激活，通過限制合成代謝減少ATP的消耗和促進分解代謝增加ATP的生成來維持機體穩(wěn)態(tài)。近年來AMPK在肝臟能量代謝中的作用逐漸被人們所認識，現(xiàn)就目前研究所取得的進展做一綜述。

1 AMPK的結(jié)構(gòu)和活性調(diào)節(jié)

AMPK是廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合體，在多種代謝過程中具有廣泛作用。AMPK是一個異源αβγ三聚體,由具有催化作用的α亞基和具有調(diào)節(jié)作用的β和γ亞基構(gòu)成，β亞基作為一個支架連接α、γ亞基，同時其豆蔻?；纱龠MAMPK激活[1]。哺乳動物AMPK亞基分別有7個基因編碼，2個α亞基(α1和α2)，2個β亞基(β1和β2)，3個γ亞基(γ1，γ2和γ3)，因此在細菌及哺乳動物細胞中AMPK存在12種可能異構(gòu)體。AMPKα1亞基的氮端含一個典型的絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域，α1催化亞基的172位蘇氨酸殘基磷酸化常被用作AMPK激活的生物標志，激活后AMPK活性可增加1 000倍，碳端則負責與β、γ亞基結(jié)合成復合體。

AMPK上游激酶主要有肝激酶蛋白(liver kinase protein 1，LKB1)、鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶激酶(Ca2+/calmodulin-activated protein kinase kinases，CaMKK),可直接磷酸化α1亞基的172位蘇氨酸[2]。其次，AMPK還受到AMP、ADP的變構(gòu)調(diào)節(jié)，AMPK的變構(gòu)調(diào)節(jié)主要與γ亞基有關，γ亞基的腺嘌呤核苷酸結(jié)合位點包含4個串聯(lián)重復的CBS (cystathione-synthase，CBS)結(jié)構(gòu)域，其中兩個可與ATP、ADP或AMP結(jié)合，第四個與AMP因結(jié)合緊密，不發(fā)生交換，第二個常處于無結(jié)合狀態(tài)。在正常生理條件下，γ亞基與2個ATP、1個AMP分子結(jié)合，AMPK無活性。當機體ATP消耗增加或者代謝應激導致AMP/ATP、ADP/ATP比值升高時，AMP或ADP可與γ亞基的CBS結(jié)構(gòu)域結(jié)合促使AMPK構(gòu)象改變， AMPKα1 172位蘇氨酸被磷酸化激活或者抑制其去磷酸化(磷酸酶)，AMP作為AMPK變構(gòu)激活劑能使AMPK活性增加2～5倍，ADP增加1.6倍，單獨ADP并不能激活AMPK，但ADP可保護AMPK阻止其去磷酸化失活[3-4]。而Gowans 報道AMP和ADP均可以抑制蛋白磷酸酶2Cα(protein phosphotases 2C，PP2C)對AMPK的去磷酸化，AMP拮抗ATP抑制AMPK去磷酸化作用超過ADP的10倍；另一方面，即使ATP濃度在正常生理范圍內(nèi)，在適宜條件下AMP變構(gòu)激活AMPK的活性能力可大于13倍[5]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator1，SIRT1)是一種保守的煙酰胺腺嘌呤依賴的組蛋白/非組蛋白去乙酰化酶，在基因組穩(wěn)定性、能量調(diào)節(jié)、細胞壽命等方面具有重要作用。SIRT1可通過脫乙?；疞KB1激活LKB1，增加其細胞漿內(nèi)定位進而磷酸化激活AMPK[6]。

2 AMPK分布

AMPK亞基的表達分別呈現(xiàn)組織特異性，AMPKα1分布廣泛，如心臟、肝臟、腎臟、腦、脾臟、肺、骨骼肌，定位于細胞漿中，AMPKα2主要分布于骨骼肌的細胞核中，較小程度分布于心臟、肝臟、腦、腎臟。AMPKβ1亞基分布同α1，β2則主要于骨骼肌分布。γ1亞基廣泛分布于各組織細胞，γ2亞基廣泛分布在心臟、腦、胎盤、骨骼肌，γ3僅在骨骼肌中表達。AMPK在不同組織細胞中以不同亞型的復合體存在和不同亞細胞定位，暗示AMPK作用于不同的底物，呈現(xiàn)不同的代謝調(diào)節(jié)方式，在胞漿主要磷酸化失活代謝酶蛋白，在細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[7]。

3 AMPK在肝臟中的作用

肝臟是機體的代謝工廠，維持機體能量需求，肝臟能量代謝隨著營養(yǎng)狀態(tài)的改變而改變，空腹時，肝臟加強糖原分解、葡萄糖異生增加葡萄糖輸出；同時抑制脂肪合成，激活脂肪酸氧化提供能量維持整個機體穩(wěn)態(tài)。AMPK在代謝性疾病的病理生理變化中起重要作用。在肥胖、2型糖尿病、脂肪肝、動脈硬化患者及相應的動物模型試驗中發(fā)現(xiàn)，肝臟、脂肪和肌肉等外周組織中的AMPK活性均下降。

3.1調(diào)節(jié)肝葡萄糖代謝 機體在處于缺氧、葡萄糖耗竭、代謝毒物等代謝應激狀態(tài)下，肝臟AMPK可被激活。另外，短時間的運動鍛煉亦可增強肝臟AMPK活性，而長時間運動不僅能增加AMPK活性，還能促進AMPKα亞基的表達。AMPK激活后首先直接影響涉及碳水化合物、脂類、蛋白合成過程中酶的活性，其次參與調(diào)節(jié)這些代謝通路的關鍵酶的轉(zhuǎn)錄。

肝臟AMPK主要通過抑制糖異生關鍵酶的基因表達，減少葡萄糖生成維持血糖穩(wěn)態(tài)。AMPKα2基因敲除小鼠呈現(xiàn)高血糖、糖耐量減低和葡萄糖生成增加的表現(xiàn)，在肝臟特異性過表達AMPKα1轉(zhuǎn)基因小鼠較野生小鼠雖然血糖無明顯下降，但給予9周高脂飲食后轉(zhuǎn)基因小鼠空腹血糖水平降低，胰島素敏感性增加。AMPK通過減少L型丙酮酸激酶(L-type pyruvate kinase，L-PK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenol-pyruvate carboxykinase，PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatas，G-6-Pase)的基因表達來調(diào)控肝臟葡萄糖穩(wěn)態(tài)。

AMPK磷酸化肝細胞核因子-4α(hepatic nuclear factor 4α，HNF4α)的304絲氨酸位點降低了HNFα形成同源二聚體及其結(jié)合DNA的能力，降低了其轉(zhuǎn)錄活性，L-PK、葡萄糖轉(zhuǎn)運體2表達減少。cAMP反應元件結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄共激活因子2(CREB-regulated transcription coactivator 2，CRTC2)，叉頭盒O1(forkhead box O1，F(xiàn)OXO1)是AMPK調(diào)控PEPCK和G-6-Pase的關鍵轉(zhuǎn)錄因子。AMPK磷酸化CRTC2的171絲氨酸位點，阻止CRTC2進入核內(nèi)，減少過氧化物酶增殖物受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC1α)表達，進而抑制糖異生關鍵酶PEPCK和G-6-Pase的表達，減少葡萄糖生成。組蛋白去乙?；窱Ia(Class IIa histone deacetylases，HDAC)包括HDAC4,5,7和9，主要存在于肝細胞胞漿中，胰高血糖素可促進其進入細胞核，脫乙?；疐OXO1 、FOXO3，招募HDAC3結(jié)合于PEPCK和G-6-Pase的啟動子區(qū)域促進其表達，糖異生增加出現(xiàn)明顯高血糖，敲除HDAC4/5/7后導致肝臟糖原堆積、空腹血糖水平降低和糖耐量改善。AMPK可直接磷酸化HDAC4/5/7，抑制HDAC入核發(fā)揮作用[8]。

碳水化合物反應元件結(jié)合蛋白(carbohydrate response element binding protein，ChREBP)是一種可被葡萄糖激活的高表達于肝臟的轉(zhuǎn)錄因子，主要通過與丙酮酸激酶、脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶啟動子區(qū)域相結(jié)合調(diào)控葡萄糖分解和脂肪合成酶類的表達。AMPK磷酸化ChREBP的568絲氨酸位點抑制其與靶基因的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性。

二甲雙胍是治療2型糖尿病的一線經(jīng)典藥物，可通過增加組織葡萄糖利用和減少葡萄糖輸出和改善胰島素敏感性降低血糖[9]。但是，目前二甲雙胍具體的作用機制尚不完全清楚，有研究顯示二甲雙胍的降糖效應與AMPK通路有關，敲除小鼠肝臟LKB1對總AMPK數(shù)量沒有影響，而AMPK活性明顯缺失，伴隨著嚴重高血糖血癥和代償性的胰島素水平增加，二甲雙胍可降低高脂誘導野生型小鼠和肥胖小鼠的血糖水平，但對肝臟敲除LKB1小鼠無降糖效應，說明二甲雙胍依賴于LKB1-AMPK通路起作用[10]；二甲雙胍可通過抑制線粒體呼吸鏈復合體1(mitochondrial respiratory-chain complex 1)，呈現(xiàn)劑量和時間依賴性的方式增加大鼠和人肝細胞內(nèi)AMP:ATP比率進而激活AMPK[11]；近來，在低濃度二甲雙胍(門靜脈濃度≤80 μm)處理小鼠肝原代細胞和低劑量二甲雙胍(50 mg/kg)飼養(yǎng)高脂誘導的小鼠肝臟中，糖異生關鍵酶PEPCK1和G-6-Pase催化亞單位的表達水平降低，胰高血糖素刺激的葡萄糖輸出減少，而并不影響細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷水平，在RNA干擾AMPKα1和α2后二甲雙胍的這種效應被抑制了，說明二甲雙胍抑制肝糖輸出的作用是或者至少部分是AMPK通路介導的[12]。

A-769662是AMPK的特異性激活劑，在大鼠肝原代細胞中可抑制脂肪酸的合成。給予Sprague-Dawley大鼠A-769662短期治療明顯減少了丙二酰輔酶A水平和呼吸交換比率，增加了全身脂肪酸氧化比率。經(jīng)A-769662治療的肥胖小鼠，PEPCK、G6Pase和脂肪酸合成酶表達明顯減少，血糖降低40%，體質(zhì)量減輕，血漿及肝中三酰甘油水平降低。

水楊酸鹽(salicylate)是水楊酸的衍生物，臨床常用藥物阿司匹林是乙酰水楊酸，是水楊酸合成衍生物之一，在體內(nèi)可水解為水楊酸。研究表明，水楊酸鹽在肝臟可變構(gòu)激活AMPK，其結(jié)合位點與AMPK激活劑A-769662相同，且可抑制Thr172 位點的去磷酸化，這種效應不依賴于AMP或ADP的改變，但AMPKβ亞基S108A位點突變后這種效應就取消了。水楊酸鹽還可解偶聯(lián)氧化磷酸化，升高細胞內(nèi)ADP/ATP比值，進而激活AMPK，減少碳水化合物利用而增加脂類利用[13]。

3.2調(diào)節(jié)肝脂代謝 乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)是一種生物素依賴的變構(gòu)酶，有兩種亞型，ACC1和ACC2，ACC1存在于胞液中，是脂肪酸合成的限速酶，ACC2存在于線粒體上催化脂肪酸氧化，因此，ACC在脂肪酸的代謝過程中起著重要作用。肝臟中存在兩種ACC。AMPK即可磷酸化ACC1的79，1200，1215絲氨酸位點，抑制脂肪酸的合成，又可磷酸化ACC2的212絲氨酸位點，使ACC2線性多聚體不能形成，活性降低，體內(nèi)丙二酰輔酶A合成減少，激活脂肪酸氧化限速酶肉毒脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ，促進長鏈脂肪酸進入線粒體氧化供能。ACC1的79絲氨酸位點突變?yōu)楸彼峄蚯萌胄∈?，ACC2的212絲氨酸突變?yōu)楸彼峄蚯萌胄∈蠹半p突變小鼠肝臟基線AMPK活性、ACC表達無明顯變化，雙突變小鼠較野生小鼠ACC1和ACC2活性升高，丙二酰輔酶A增多，脂肪酸合成增加，脂肪酸氧化降低，導致出現(xiàn)胰島素抵抗、糖耐量減低和非酒精性脂肪肝。雙突變小鼠高脂飲食易致肥胖，二甲雙胍治療6周，代謝參數(shù)同高脂飲食野生型小鼠無明顯差異，因此AMPK通過磷酸化ACC可以改善胰島素抵抗和血脂代謝[14]。AMPK還通過增加丙二酰輔酶A脫羧酶活性減少細胞內(nèi)丙二酰輔酶A水平。

3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR)是膽固醇合成限速酶，體內(nèi)膽固醇合成70%-80%在肝臟合成，HMGCR存在于肝、腸及其他組織細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，它是由887個氨基酸殘基構(gòu)成的糖蛋白，其N端結(jié)構(gòu)域含疏水氨基酸較多，跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜固定在膜上，C端親水結(jié)構(gòu)域伸向胞液，具有催化活性，AMPK可磷酸化人HMGCR的872絲氨酸位點抑制其活性減少膽固醇合成，而胞液中的蛋白磷酸酶可催化HMGCR脫磷酸而恢復活性。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(Sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)是調(diào)節(jié)脂肪合成的關鍵核轉(zhuǎn)錄因子，屬于固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白家族(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)成員中的一員。SREBP-1c在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以前體形式合成，與SREBPs裂解激活蛋白(SREBP cleavage activating protein，SCAP)結(jié)合為復合物，在細胞內(nèi)膽固醇水平降低時經(jīng)歷蛋白酶的順序裂解過程變成一個68 kD具有轉(zhuǎn)錄活性的氮端片段，轉(zhuǎn)位進入核內(nèi)與相應靶基因啟動子區(qū)域的固醇調(diào)節(jié)元件(sterol regulatory element，SRE)結(jié)合促進脂肪合成靶基因的表達，如ATP檸檬酸裂解酶、乙酰CoA羧化酶、脂肪酸合成酶、硬脂酰CoA去飽和酶及蘋果酸酶。肝臟特異性表達SREBP-1c活性成熟體小鼠的肝臟中總脂肪量增加～2倍，血漿三酰甘油和游離脂肪酸分別增加～2倍，胰島素水平增加～3倍，肝臟質(zhì)量及內(nèi)臟脂肪量增加[15]。觀察肝臟特異性表達持續(xù)激活AMPKα1的轉(zhuǎn)基因小鼠正常飲食10周的SREBP-1C的表達沒有明顯變化，但在20周SREBP-1c的mRNA水平降低達50%，伴隨著乙酰CoA羧化酶、蘋果酸酶、ATP檸檬酸裂解酶表達下降30%～60%，脂肪酸合成酶降低23%，胰島素敏感性增加。近來，Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)SREBP-1c是AMPK的一個直接靶蛋白，AMPK可直接磷酸化SREBP-1c的372絲氨酸位點，并可通過影響蛋白裂解成熟和核內(nèi)轉(zhuǎn)位過程來抑制SREBP-1c活性，抑制固醇調(diào)節(jié)元件依賴的促脂靶蛋白脂肪酸合成酶的表達。

甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(Glycerol-3-phosphate acyl-transferase，GPAT)是三酰甘油和磷脂合成的限速酶，存在于肝臟、脂肪組織、腎臟的線粒體(mitochondrial GPAT，mtGPAT)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，肝臟中mtGPAT活性占總活性的30%～50%，其他組織的活性少于10%[17-18]。GPAT基因敲除小鼠肝臟中三酰甘油容量減少，血漿三酰甘油降低，磷脂合成減少。肝臟過表達mtGPAT使脂肪酸氧化降低，甘油二酯和磷脂合成增加。AMPK激活后可磷酸化并抑制肝臟mtGPAT活性，減少三酰甘油合成。

脂聯(lián)素(adiponectin)是脂肪細胞分泌的肽類激素，可通過激活AMPK改善胰島素敏感性、促進脂肪酸氧化。脂聯(lián)素敲除小鼠AMPK活性降低，葡萄糖調(diào)節(jié)受損。非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)被認為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，與肥胖、胰島素抵抗密切相關，呈現(xiàn)出一系列肝臟代謝異常譜，包括簡單的肝脂肪變性和嚴重的非酒精性肝炎、肝硬化、肝功能衰竭。而在NAFLD患者中血漿脂聯(lián)素濃度明顯減少。NAFLD中，SREBP-2成熟體增加，磷酸化HMGCR減少和AMPK活性降低[19]。脂聯(lián)素激活肝臟AMPK減少脂肪酸生物合成和增加線粒體脂肪酸氧化，降低肥胖小鼠肝臟中的三酰甘油，進而改善胰島素敏感性和減輕肝脂肪變性。酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)中，AMPK活性亦降低，SREBP-1c及其靶基因均表達增加，但給予AMPK激活劑AICAR或者二甲雙胍可阻斷SREBP-1c的水平增加。乳清酸(orotic acid)誘導的脂肪肝中三酰甘油水平增加2～4倍，SREBP-1c成熟體及其靶基因脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶等均明顯增加，AMPK上游激酶LKB1降解增加，導致AMPK活性降低，而AICAR或二甲雙胍等激活AMPK可減少SREBP-1c和其靶基因的mRNA水平，改善肝細胞內(nèi)脂肪堆積[20]。

3.3調(diào)節(jié)肝線粒體生物合成和功能 糖、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)在生物體內(nèi)氧化功能的過程稱為生物氧化，主要在線粒體內(nèi)膜氧化呼吸鏈中進行，而AMPK在調(diào)節(jié)線粒體的生物合成和功能中具有重要作用。

AMPK 主要通過直接或間接調(diào)節(jié)過氧化物酶增殖物激活受體γ輔助激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor- coactivator-1α，PGC-1α)的功能促進線粒體的合成。PGC-1α作為一個共轉(zhuǎn)錄激活因子, 通過與過氧化物酶增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα)、核呼吸因子1(nuclear respiratory factors-1，NRF-1)、核呼吸因子2(nuclear respiratory factors-2，NRF2)及雌激素相關受體α(estrogen-related receptor α，ERRα)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用,進而激活線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，mtTFA)的表達，mtTFA直接引起線粒體DNA的復制和轉(zhuǎn)錄。NRFs同時會誘導氧化磷酸化(OXPHOS) 基因的轉(zhuǎn)錄，使細胞核編碼的蛋白轉(zhuǎn)移至線粒體上而促進線粒體的合成。AMPK還可通過直接磷酸化PGC-1α的Ser538 和Thr177 殘基促進線粒體的合成。

白藜蘆醇是一種多酚類化合物，主要來源于葡萄皮中，可改善代謝性疾病的參數(shù)，在AMPKα亞基敲除的小鼠中，白藜蘆醇不能改善胰島素敏感性、糖耐量和線粒體生物合成，不能減少脂肪量，說明白藜蘆醇依賴于AMPK，而這種作用是白藜蘆醇通過增加細胞內(nèi)NAD+/NADH比例，激活SIRT1來實現(xiàn)的。白藜蘆醇增強AMPK和SIRT1活性，進而激活PGC-1α，改善胰島素敏感性和增加肝臟線粒體數(shù)目。在肝臟敲除AMPKα1α2催化亞基的小鼠肝細胞中，AMPK表達、活性不能被檢測到，而線粒體容量、PGC-1α表達明顯減少，伴隨著氧化呼吸鏈組成成分細胞色素c氧化酶Ⅰ(COX Ⅰ)、細胞色素c氧化酶Ⅳ(COX Ⅳ)，解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)、細胞色素c的表達減少。

4 小 結(jié)

肝臟是機體最重要的代謝器官之一，主要是維持機體能量穩(wěn)態(tài)，涉及葡萄糖、脂類、蛋白質(zhì)代謝等多個方面。AMPK是調(diào)節(jié)細胞能量穩(wěn)態(tài)的關鍵感受器，AMPK在應激情況下被激活，開啟產(chǎn)生ATP的分解代謝通路，關閉消耗ATP過程，如生物合成通路。AMPK功能的實現(xiàn)涉及大量代謝酶類和調(diào)節(jié)蛋白。隨著AMPK在肝臟糖脂代謝調(diào)節(jié)方面研究的不斷深入，將為治療肥胖、2型糖尿病和代謝綜合征提供廣闊前景。

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2015-05-22