土香薷總黃酮的含量測(cè)定及體外抗氧化作用研究

黃馨瑩，朱文瑞，陳 高，吳巧鳳

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310053）

土香薷總黃酮的含量測(cè)定及體外抗氧化作用研究

黃馨瑩，朱文瑞，陳 高，吳巧鳳

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310053）

采用鋁鹽比色法，對(duì)土香薷藥材的總黃酮含量進(jìn)行了研究；以VC為陽(yáng)性對(duì)照，采用DPPH法、Fent on法和FRAP法，對(duì)土香薷總黃酮對(duì)DPPH自由基、羥基自由基的清除能力和對(duì)Fe2+離子的還原能力進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：土香薷總黃酮含量為52.2 mg/g。土香薷總黃酮對(duì)DPPH自由基和羥基自由基具有較好的清除能力，其清除率的IC50分別為102.14 μg/mL和26.33 μg/mL；對(duì)Fe2+離子具有較強(qiáng)的還原能力。土香薷總黃酮含量較高，且具有較好的抗氧化活性。

土香薷；總黃酮；含量測(cè)定；體外抗氧化

土香薷Origanum vulgare L.為唇形科牛至屬植物，又名小葉薄荷、野荊芥等，全草入藥[1]，其性味辛而微溫，具有清熱解表、理氣化濕等功效；臨床用于治療傷風(fēng)感冒、發(fā)熱、嘔吐、急性胃腸炎及腹瀉等癥[2]?，F(xiàn)代研究表明，土香薷主含揮發(fā)油、黃酮類、脂肪酸及多糖等化學(xué)成分[3]，且具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎止瀉等藥理作用[2]。

黃酮類化合物為廣泛存在于植物中的多酚性成分，具有較強(qiáng)的清除自由基能力，能抑制細(xì)胞氧化損傷[4]。土香薷的研究當(dāng)前主要集中于揮發(fā)油部位[5-7]，土香薷另含槲皮素、山奈酚、木犀草素等黃酮類成分[5]，但有關(guān)土香薷總黃酮的含量及抗氧化作用研究未見(jiàn)報(bào)道。故本文擬采用鋁鹽比色法，測(cè)定土香薷總黃酮的含量，進(jìn)一步考察其對(duì)DPPH自由基、OH自由基的清除能力和對(duì)Fe2+離子還原能力，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，為土香薷的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

尤尼柯(上海)有限公司UV-2600a型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；北京賽多利斯天平有限公司BSA124S-CW電子天平。

1.2 試藥

土香薷(產(chǎn)地：廣西，批號(hào):131022)，購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，并經(jīng)本校中藥資源與鑒定教研室俞冰副教授鑒定為唇形科植物土香薷的干燥地上部分；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào): 100080-200707)，1,1-二苯基-2-苦肼基(Sigma公司，批號(hào):S44112-089)；維生素C(浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):20120333)，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 土香薷總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 土香薷總黃酮提取液的制備

取土香薷藥材，粉碎，過(guò)40目篩，50℃烘至恒量。稱取土香薷藥材粗粉10.0 g，加20倍量60%乙醇溶液，于85℃加熱回流提取3次，每次2 h。合并3次濾液，濃縮，提取液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加60%的乙醇定容至刻度，得土香薷總黃酮提取液，備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取烘至恒量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品9.96 mg，以60%乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，定容，搖勻，得濃度為0.1992 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2.1.3 線性關(guān)系考察

根據(jù)文獻(xiàn)[8]的方法，準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇至8.0 mL，加10%NaNO3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%NaOH溶液10.0 mL，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置10 min，于510 nm處分別測(cè)定吸光度，同行試劑空白。得吸光度Y與濃度X(mg/mL)的回歸方程為：Y=12.149X+0.003 4(r=0.999 4)。表明：在0.015 9～0.055 8 mg/mL濃度范圍內(nèi)吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液4.0 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.1.3”操作，連續(xù)測(cè)定6次吸光度，計(jì)算得RSD為1.02%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液1.0 mL，入25 mL容量瓶中，按“2.1.3”操作，分別在顯色后0、5、15、30、45、60、90min時(shí)測(cè)定吸光度，計(jì)算得RSD為1.79%，說(shuō)明樣品在顯色后1.5h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批土香薷藥材粗粉，按“2.1.1”平行制備6份供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算得RSD為1.20%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn)[9]

精密稱取9份已知總黃酮含量的土香薷粗粉，每份1.0 g，分別精密加入總黃酮含量的80%、100%、120%的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品各3份，按“2.1.1”制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算總黃酮含量，計(jì)算得平均回收率為99.95%（RSD=1.94%）。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，如下圖。

表1 加樣回收率試驗(yàn)（n=9）Tab.1 Recovery test（n=9）

2.1.8 總黃酮的含量測(cè)定

取同一批土香薷藥材粗粉，按“2.1.1”平行制備3份供試品溶液，測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算得到土香薷中總黃酮含量為52.2 mg/g。

2.2 體外抗氧化能力測(cè)定

2.2.1 清除羥基自由基(·OH)能力測(cè)定

將土香薷提取液稀釋成含總黃酮濃度為20、30、40、50、60、120、150 μg/mL的溶液，分別取稀釋液1 mL，置具塞試管中，依次加1 mL 6 mmol/ L FeSO4溶液和1 mL 6 mmol/L H2O2溶液，混勻，靜置10 min；再各加1 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，混勻，靜置30 min，于510 nm處測(cè)定吸光度。以相同濃度的抗壞血酸(Vc)溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。按李彩霞等[9]所述方法計(jì)算出·OH清除率，并作VC和土香薷總黃酮對(duì)羥基自由基清除作用圖（見(jiàn)圖1）。

圖1 VC和土香薷總黃酮對(duì)羥基自由基清除作用的結(jié)果圖Fig.1 VC and Origanum vulgare L flavonoids on hydroxyl radical scavenging effect of the results of FIG.

由圖1可知，在20～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)，土香薷總黃酮的清除·OH能力與濃度呈正相關(guān)，土香薷總黃酮和Vc對(duì)·OH清除率的IC50分別為102.14 μg/mL和37.78 μg/mL，證明土香薷總黃酮提取液具有一定的·OH清除作用，但效果不及Vc。實(shí)驗(yàn)測(cè)得土香薷總黃酮清除·OH能力的IC50為102.14 μg/mL。

2.2.2 對(duì)DPPH的清除作用

將土香薷提取液稀釋成含總黃酮濃度為6、12、18、24、36、40 μg/mL的濃度，各取5 mL于具塞試管中，加入等體積濃度為0.1 mmo1/L的DPPH溶液，室溫避光反應(yīng)30 min，同時(shí)以無(wú)水乙醇為空白，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以相同濃度的抗壞血酸(Vc)溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。按王曉波等[10]所述方法計(jì)算出DPPH自由基清除率。并作VC和土香薷總黃酮提取液對(duì)DPPH自由基清除作用的結(jié)果圖（見(jiàn)圖2）。

圖2 VC和土香薷總黃酮對(duì)DPPH自由基清除作用的結(jié)果圖Fig.2 VC and Origanum vulgare L flavonoids on DPPH radical scavenging effect of the results of FIG.

由圖2的可知，在6～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)，土香薷總黃酮清除DPPH能力隨濃度增大而增大，呈一定的量效關(guān)系，但弱于相同濃度的Vc。當(dāng)濃度為40 μg/mL時(shí)，Vc的清除率為96.33%，而土香薷總黃酮的清除率為78.44%。實(shí)驗(yàn)測(cè)得土香薷總黃酮清除DPPH能力的IC50為26.33 μg/mL。

2.2.3 對(duì)FRAP還原能力的作用

[11]的方法,將土香薷提取液稀釋成含總黃酮濃度為10、20、50、100、125、150、200 μg/mL的濃度，分別取稀釋液0.3 mL于具塞試管中，依次加入1.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH6.6)和1.5 mL 1%K3Fe(CN)6溶液，50℃水浴20 min，取出快速冷卻，再加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液 (TCA)，混勻后加入2.5 mL蒸餾水及0.1 mL 0.1%FeCl3溶液，充分混勻，靜置10 min后，700 nm處測(cè)定其吸光度(以60%乙醇代替樣品的混合液作參比溶液)，并以相應(yīng)濃度的Vc作陽(yáng)性對(duì)照。并作VC和土香薷總黃酮對(duì)FRAP還原能力結(jié)果圖（見(jiàn)圖3）。

由圖3可知，Vc和土香薷總黃酮對(duì)Fe2+的還原能力隨著濃度增大而增強(qiáng)，在實(shí)驗(yàn)濃度范內(nèi)，均與濃度呈一定的量效關(guān)系。若以反應(yīng)體系吸光度值Y與樣品濃度X進(jìn)行回歸分析，可得土香薷總黃酮的回歸方程為Y=0.002X+0.289 9(R=0.9951)；Vc的回歸方程為Y=0.002X+0.162 6(R=0.9755)。當(dāng)土香薷總黃酮濃度為125 μg/mL時(shí)，其對(duì)Fe2+的還原能力約與52 μg/mL的VC溶液相當(dāng)。

圖3 VC和土香薷總黃酮對(duì)FRAP還原能力的結(jié)果圖VC and Origanum vulgare L flavonoids on FRAP reducing ability results in Fig.

3 討論

3.1 Harman提出的衰老自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為，隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體器官組織的衰退性變化是由自由基的副作用引起的[12]，機(jī)體中過(guò)量的自由基會(huì)引起蛋白質(zhì)變性、多糖降解、DNA鏈斷裂、生物膜結(jié)構(gòu)損傷、細(xì)胞解體乃至機(jī)體死亡[13]。本文對(duì)土香薷總黃酮進(jìn)行了體外抗氧化作用研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，土香薷總黃酮能有效清除·OH和DPPH·兩種自由基，可增強(qiáng)Fe2+的還原能力，顯示土香薷總黃酮有較強(qiáng)的體外抗氧化作用。本文研究為土香薷總黃酮體外抗氧化能力的評(píng)價(jià)提供了參考，為土香薷的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。

3.2 項(xiàng)目組前期對(duì)土香薷總黃酮的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行了考察[14]，在此基礎(chǔ)上，采用鋁鹽比色法測(cè)定了土香薷總黃酮的含量（52.2 mg/g），顯示土香薷中含有豐富的黃酮類成分，為土香薷活性成分的研究奠定了基礎(chǔ)。

3.3 本文僅對(duì)土香薷總黃酮的體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，但其抗氧化的活性成分及作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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Stduy on Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Origanum vulgare L.in Vitro

HUANG Xin-ying,ZHU Wen-rui,CHEN Gao,et al
(Pharmaceutical College,Zhejiang Chinese Medical University,Zhejiang Hangzhou 310053)

Using NaNO2-Al(NO3)3colorimetric method,to establish a method for determination of total flavonoid content in Origanum vulgare L.in herbs.Using ethanol extraction method to extract total flavonoids from Origanum vulgare L.,to prepare dry extract total flavonoids,and to study on the activity of total flavonoids from Origanum vulgare L.to eliminate hydroxyl free radical(OH)and the reducing power,with Vc as positive control.The experiment result shows the total flavonoids from Origanum vulgare L was 52.2mg/g.The content of total flavonoids from Origanum vulgare L.exhibited good DPPH radical and good Fe2+reducing power.The median inhibitory concentration(IC50)of scavenging hydroxyl radical and DPPH radical were 102.14 μg/mL and 26.33 μg/mL，respectively.The antioxidant activity of total flavonoids from Origanum vulgare L.in vitro is strong.

Origanum vulgare L.;total flavonoids;determination;Antioxidant activity in vitro

R284.2

A

1008－830X(2015)06－0588－05

2015-08-05

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013R410019，2014R410031)

黃馨瑩(1994-)，女，浙江義烏人，研究方向:中藥活性成分研究及新藥開(kāi)發(fā).

吳巧鳳，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:中藥活性成分研究及新藥開(kāi)發(fā).E-mail:wqfyjm@sina.com