羊棲菜不同溶劑提取物抗抑郁活性研究

郭 悅，夏亞男，周 敏，金洪國，關(guān)麗萍

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省舟山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江舟山 316021）

羊棲菜不同溶劑提取物抗抑郁活性研究

郭 悅1，夏亞男1，周 敏2，金洪國2，關(guān)麗萍1

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省舟山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江舟山 316021）

探討了褐藻羊棲菜4種不同溶劑萃取層的抗抑郁藥理活性。采用水煎浸提及超聲波輔助提取，制備羊棲菜石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水層提取物。采用常用的抑郁模型“強(qiáng)迫游泳實驗”和“懸尾實驗”，以小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾不動時間作為指標(biāo)，對4種不同溶劑提取層進(jìn)行抗抑郁活性研究。實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，石油醚、乙酸乙酯和水層均能降低小鼠強(qiáng)迫游泳和小鼠懸尾的不動時間，具有相對的顯著性差異。羊棲菜石油醚、乙酸乙酯和水提取物具有抗小鼠實驗性抑郁作用。

羊棲菜；抗抑郁；絕無行為；不動時間

抑郁癥是一種常見的情感性精神疾病，隨著人們生活節(jié)奏的加快和社會競爭的不斷加劇，工作壓力和精神壓力逐漸增加，抑郁癥日趨成為困擾人們生活的高發(fā)病，嚴(yán)重地危害人們的身心健康。目前抑郁癥已經(jīng)成為威脅人類健康的第四大疾病，據(jù)WHO統(tǒng)計預(yù)測，抑郁癥將成為威脅人類健康的第二大疾病，到2020年[1]。目前用于臨床的抗抑郁西藥存在的一定毒副作用，為此，開發(fā)高效、低毒、不良反應(yīng)少的新型天然抗抑郁藥成為研究工作者研究的熱點。

褐藻羊棲菜Sargassum fusiforme(Harv.)Setchel為馬尾藻科植物，是一種暖溫亞熱帶性海藻，也是一種重要的食藥兩用海藻。在我國主要分布在浙江、福建、遼寧、山東等省的沿海地區(qū)。在民間素有“海人參”和“長壽菜”之美稱。在我國古代，羊棲菜也是很好的入藥植物，如陶弘景的《神農(nóng)本草經(jīng)》和李時珍的《本草綱目》等史書均有記載[2,3]。據(jù)文獻(xiàn)報道，羊棲菜中含有大量多糖、甾醇類、多酚類、礦物質(zhì)和維生素等生物活性物質(zhì)[4-7]。研究表明這些物質(zhì)顯示抗氧化、抗病毒、抗菌、抗疲勞、降血壓和免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[8-14]。由此可見，開發(fā)研究海藻羊棲菜提取物及相關(guān)有效成分及分離活性單體具有一定的發(fā)展前景。關(guān)于羊棲菜提取物抗抑郁活性的研究還鮮有報道。因此，本文以羊棲菜不同溶劑萃取物為研究對象，采用經(jīng)典的抑郁模型“小鼠強(qiáng)迫游泳實驗”和“小鼠懸尾實驗”對其進(jìn)行抗抑郁藥理活性研究，為抗抑郁中藥研究提供實驗理論依據(jù)，為開發(fā)利用中藥羊棲菜提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

超聲波提取儀（JP300型，武漢嘉鵬電子有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（HWS12型，上海—恒科技有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000型，上海亞榮生化儀器廠）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB型，河南省太康科教器材廠）；精密電子天平（BS323S型，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；紫外-可見分光光度計（S53型，上海凌光技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗藥物和動物

褐藻羊棲菜：采集于浙江省舟山市海域。陽性對照藥鹽酸氟西汀（美國Lilly公司），使用前采用生理鹽水配制成1 g/L，冰箱中放置，備用；其他常用試劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等均為國產(chǎn)分析純。健康雄性ZCR小鼠（18～22 g），購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。實驗開始為適應(yīng)實驗室環(huán)境前一周購買并放入動物實驗室飼養(yǎng)（室溫：21～23℃），每天自由地飲水、進(jìn)食，晝夜規(guī)律12 h/12 h每日保持，常用日光燈08:00 am-08:00 pm照明。

2 實驗方法

2.1 羊棲菜不同溶劑萃取物的制備

稱取用粉碎機(jī)粉碎成粉末羊棲菜200 g，采用水煎煮法進(jìn)行提取[15]。加入適量的蒸餾水浸泡，超聲波輔助加熱回流浸提2 h，提取2次，濾液合并，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干得到膏狀黑褐色固體。而后加入10倍量的蒸餾水，分別用10倍量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，合并濾液，真空旋出溶劑得到膏狀物，備用。

2.2 實驗動物分組及藥品處理

取健康雄性小鼠48只，隨機(jī)分成6組，每組8只，分別為空白對照組、陽性對照組鹽酸氟西汀、石油醚層組、乙酸乙酯層組、正丁醇層組和水層組。鹽酸氟西汀配成劑量為10 mg/kg；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水層各劑量組分別配成200 mg/kg的劑量；空白對照組灌服同體積[按照0.1 mL/20 g（小鼠體重）]的0.2%羧甲基纖維素鈉水溶液進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)灌胃7 d，每天1次。末次給藥1 h后，對各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)測試實驗。

2.3 小鼠強(qiáng)迫游泳實驗

采用PORSOLT等人[16]建立的方法進(jìn)行小鼠強(qiáng)迫游泳實驗，本實驗對此方法進(jìn)行了一些改進(jìn)。實驗時，在柱狀大燒杯內(nèi)（規(guī)格為水深10 cm、直徑34 cm的杯內(nèi)，水溫25±1℃），將實驗小鼠單獨地放入。行為學(xué)實驗是觀察小鼠6 min內(nèi)游泳的情況，然后統(tǒng)計后4 min內(nèi)小鼠游泳累積不動時間（不動的狀態(tài)即小鼠呈漂浮狀態(tài)或小鼠停止掙扎和小鼠為保持頭部在水面四肢有輕微動作）。

2.4 小鼠懸尾實驗

采用STERU等人[17]建立小鼠懸尾實驗方法，在此基礎(chǔ)上略有改進(jìn)。實驗在昏暗、安靜的房間里，在懸尾箱（規(guī)格為30 cm×30 cm×25 cm）里，在距離小鼠尾尖部約2 cm處用膠布貼于支架上，使小鼠成倒掛狀態(tài)，使其頭部離箱底約5 cm，1次懸掛2只小鼠，中間用隔板隔開。懸掛時間為6 min，統(tǒng)計后4 min內(nèi)小鼠懸尾累積不動時間（不動狀態(tài)即小鼠無任何活動或小鼠停止掙扎不動）。

2.5 小鼠開野行為試驗

實驗采用ARCHER[18]建立的小鼠開野行為方法，實驗時在此基礎(chǔ)上略有改進(jìn)。實驗裝置為一個長寬均為60 cm，高40 cm的盒子，將其分成沒有隔板的相等的小格子，而后在其正上方懸有一個60 W的日光燈。將小鼠單獨地放在盒子的中央任其自由活動6 min，記錄統(tǒng)計小鼠后5 min內(nèi)爬行過的站立次數(shù)、格子數(shù)和理毛的次數(shù)，整個實驗過程在黑暗中進(jìn)行。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

實驗結(jié)果采用單向方差分析（ANOVA）檢測，以x±s表示。具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 結(jié)果

3.1 羊棲菜不同溶劑萃取層對小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間的影響

4種不同溶劑提取層小鼠強(qiáng)迫游泳行為學(xué)實驗結(jié)果見表1。以200 mg/kg劑量下連續(xù)灌胃7d后，與空白對照組相對比，石油醚、乙酸乙酯和水層均能降低小鼠強(qiáng)迫游泳的不動時間。而石油醚層和水層明顯的縮短小鼠強(qiáng)迫游泳的不動時間，作用效果與鹽酸氟西汀相似，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），顯示較好的抗抑郁活性。

表1 4種不同萃取層對小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間的影響（n=8）Tab.1 Tab.1 The result of the forced swimming test(n=8）

3.2 羊棲菜不同溶劑萃取層對小鼠懸尾不動時間的影響

4種不同溶劑提取層小鼠懸尾不動時間行為學(xué)實驗結(jié)果見表2。實驗結(jié)果與小鼠強(qiáng)迫游泳抑制不動時間相似。在200 mg/kg劑量下，與空白對照組相比較，石油醚、乙酸乙酯和水層均能縮短小鼠懸尾的不動時間，而正丁醇層與空白組相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表2 4種不同萃取層對小鼠懸尾不動時間的影響（n=8）Tab.2 Tab.2 The result of the tail suspension test(n=8)

3.3 小鼠開野行為試驗

4種不同溶劑提取層開野行為實驗結(jié)果見表3，實驗結(jié)果表明，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水層小鼠站立、移動格數(shù)、理毛次數(shù)均沒有顯著變化，與空白組相比（P＞0.05）。

表3 4種不同萃取層對小鼠開野實驗影響（n=8）Tab.3 The result of the open-field test(n=8)

4 討論

經(jīng)典的行為學(xué)抑郁模型“小鼠強(qiáng)迫游泳實驗”和“小鼠懸尾實驗”被廣泛用于評價、篩選和觀察抗抑郁藥物常用的實驗方法[16,17]。這兩種行為絕望模型實驗構(gòu)建了一個無法回避的壓迫環(huán)境，小鼠在實驗中表現(xiàn)出來的不動狀態(tài)，形象地反映出被稱之為“對強(qiáng)壓環(huán)境適應(yīng)的失敗”或“行為絕望和扭曲”[18]。對絕大多數(shù)抗抑郁藥敏感，此行為學(xué)實驗具有簡便、快捷及敏感的特點，

本研究采用經(jīng)典抑郁模型“小鼠強(qiáng)迫游泳實驗”和“懸尾實驗”對褐藻羊棲菜的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水層進(jìn)行抗抑郁活性評價。實驗研究結(jié)果顯示：與空白對照組相比，在200 mg/kg劑量下3灌胃7 d后，石油醚、乙酸乙酯和水層均能縮短小鼠強(qiáng)迫游泳的不動時間和小鼠懸尾的不動時間，尤其是石油醚和水層與氟西汀相似，明顯的縮短小鼠強(qiáng)迫游泳的不動時間（P＜0.001），顯示較好的抗抑郁活性。初步推斷這可能是與羊棲菜中含有甾醇類、多酚類和糖類物質(zhì)有關(guān)。甾醇類物質(zhì)在石油醚溶劑中含量相對較多，多酚類結(jié)合糖及糖類在水層中含量相對較多。韓迎辰[20]報道的天然植物中甾醇類、多酚和低聚糖具有抗抑郁活性。

同時，為了排除假陽性結(jié)果對實驗的影響，避免中樞興奮藥的干擾[19]，對各提取層進(jìn)行開野試驗實驗。實驗結(jié)果顯示各組小鼠移動格數(shù)、站立、理毛次數(shù)沒有顯著變化（P＞0.05），表明羊棲菜各提取層明顯降低小鼠強(qiáng)迫游泳試驗和懸尾試驗的不動時間與神經(jīng)系統(tǒng)興奮性無關(guān)。此結(jié)果與絕大多數(shù)抗抑郁藥相似，既能減少小鼠不動狀態(tài)時間，小鼠的自主活動又沒受到影響。

褐藻羊棲菜資源豐富，且可食藥兩用，此研究為開發(fā)新型抗抑郁中藥提供實驗理論依據(jù)。

[1]趙會娟,史義靜,劉 琨.抗抑郁藥種類概述及發(fā)展趨勢[J].河北化工,2010,33(2):24-26.

[2]陶弘景.本草經(jīng)集注[M].上海:群聯(lián)出版社,1955.

[3](明)李時珍．本草綱目[J].長春:吉林大學(xué)出版社,2009:76．

[4]KIM H J,CHOI J I,KIM D J,et a1.Effect of ionizing radiation on the physiological activities of ethanol extract from Hizikia fusiformis cooking drips[J].Applied Radiation and Isotopes,2009,67:1 509-1 512.

[5]ZHU T,HEO H J,ROW K H.Optimization of crude polysaccharides extraction from Hizikia fusiformis using response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers,2010,82:106-110.

[6]王 威,李紅巖,王艷艷,等.褐藻羊棲菜化學(xué)成分的研究[J].中草藥,2008,39(5):657-661.

[7]王潤生,東 方.羊棲菜多糖活性研究評述[J].黑龍江醫(yī)藥,2013,26(5):782-784.

[8]錢媛華,楊靖亞,孫立春,等.羊棲菜急性毒性實驗及體外抑菌活性的研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(2):339-342.

[9]楊小青,盧虹玉,李延平,等.羊棲菜不同分子質(zhì)量褐藻多酚抗氧化活性研究[J].海洋科學(xué),2013,37(4):47-51.

[10]吳 越,曲 敏,佟長青,等.羊棲菜多糖對小鼠抗疲勞作用的研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(8):350-352.

[11]葉 紅,周春宏,高蓓蕾,等.羊棲菜乙醇提取物的抗氧化活性[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,22(50):4 695-4 697.

[12]楊旭東,張 杰,楊驕霞.羊棲菜多糖對糖尿病大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)作用[J].中國食品與營養(yǎng),2013(1):65-66.

[13]況 煒,陳慧玲,章 皓.羊棲菜多糖免疫調(diào)節(jié)活性的實驗研究[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(23):3 872-3 873．

[14]楊 銘,郎 朗,季宇彬.海藻羊棲菜藥用功能研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐,2013,26(4):450-451;487.

[15]符家珠,楊 寶,刁曉平,等.海南沿海羊棲菜和海帶不同提取物的抑茵活性[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2013,38(1):34-37.

[16]PORSOLT R D,BERTIN A,JALFRE M.Behavioural despair in mice:a primary screening test for antidepressants[J].Arch Int Pharmacodyn Ther,1977,229:327.

[17]STERU L,CHERMAT R,THIERRY B,et al.The tail suspension test:a new method for screening antidepressants in mice[J]. Psychopharmacology,1985,85:367.

[18]WIILLNER P.Animal models as stimulations of depression[J].Trends Pharmacol Sci,1991(12):131.

[19]周本宏,李小軍,馮 琪,等.天麻醇提取物對小鼠的抗抑郁作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(11):1 525-1 528.

[20]韓迎辰.抑郁癥及抗抑郁天然藥物研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實踐雜志,2005,23(1):3-5.

Antidepressant Effect of Different Extracted from Sargassum fusiforme

GUO Yue1,XIA Ya-Nan1,ZHOU Min2,et al
(1.Food and Pharmacy School of Zhejiang Ocean University,Zhejiang 316022;2.Department of Neurology, Zhoushan Hospital of Zhejiang Province,Zhoushan 316021，China）

To explore the antidepressant effect of four different extracted from Sargassum fusiforme.Sargassum fusiforme was extracted by water immersion extraction and ultrasonic wave method.And different extraction were obtained with petroleum ether,ethyl acetate,butanol and water as the solvents resp.To investigate the antidepressant activity of four different extraction by the forced swimming test and the tail suspension test,with behavioral despair mice in the immobility time as an indicator in this paper.Petroleum ether,ethyl acetate and water could significantly reduce the immobility time of mice during the forced swimming test and the tail suspension test,compared with that of the control group.Petroleum ether,ethyl acetate and water from Sargassum fusiforme possessed the antidepressant effects.

Sargassum fusiforme;antidepressant effect;behavioral despair;immobility time

R931.71

A

1008－830X(2015)06－0578－04

2015-01-20

浙江省大學(xué)生新苗人才計劃項目（2014R411011）；舟山市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃攻關(guān)項目（2015G01）

郭悅（1995-），女，吉林吉林人，研究方向：天然抗抑郁活性成分.

關(guān)麗萍，教授.E-mial:glp730@163.com