黃瓜葉片上SPAD值的空間分布及氮素診斷的位點選擇

胡 靜，毛罕平，左志宇，李青林

(1.江蘇大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.蘇州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215104)

從世界范圍看，在所有必需營養(yǎng)中，氮是限制植物生長和形成產(chǎn)量的首要因素.氮是葉綠素的主要成分，也是和葉綠素合成相關(guān)的酶的一部分，葉肉中高達(dá)75%的氮位于葉綠體中［1-2］.傳統(tǒng)的氮素營養(yǎng)診斷多以化學(xué)分析為主，但這種方法需要耗費大量的人力、物力和財力，不利于推廣應(yīng)用［3-7］.葉綠素計(SPAD)具有操作簡便、快捷、非破壞性地監(jiān)測植物氮素營養(yǎng)水平等優(yōu)點［8］，近年來在大豆、水稻、生菜和花生等多種植物上得到廣泛應(yīng)用［9-17］，并顯示出葉綠素計值和植物氮含量之間具有強(qiáng)烈的相關(guān)關(guān)系.葉片是植物進(jìn)行光合作用的最主要器官，綠色植物的葉片有賴于葉綠素進(jìn)行光合作用，因此作物的氮素營養(yǎng)狀況會在葉片上有所反映.屈衛(wèi)群等［3］通過研究棉花主莖頂部4張定型葉片SPAD值的葉位分布及其對施氮水平反應(yīng)的敏感程度，認(rèn)為頂1定型葉時空變異最大，頂4定型葉最穩(wěn)定.張延麗等［18］的研究結(jié)果顯示，隨施氮量的增加，黃瓜各葉位葉片SPAD值均有所增加，但不同葉位葉片SPAD值增長的幅度明顯不同，并得出結(jié)論認(rèn)為黃瓜幼苗期和開花期的第3葉、結(jié)果期的第7葉對施氮水平的反應(yīng)最敏感，可以作為黃瓜氮素缺乏診斷的最佳部位.可見作物氮素營養(yǎng)狀況在不同葉位間存在明顯的空間差異.李嵐?jié)龋?9］綜合分析認(rèn)為，應(yīng)用SPAD儀監(jiān)測油菜氮素營養(yǎng)狀況的最佳測試葉位和位點為主莖頂4片完全展開葉中部，該部位SPAD值與葉綠素含量、葉片含氮量和植株全氮含量之間的相關(guān)性均達(dá)到顯著或極顯著水平，滿足氮素營養(yǎng)快速診斷的要求.祝錦霞等［20］用機(jī)器視覺圖像發(fā)現(xiàn)，水稻葉片的不同位點其顏色特征和葉位一樣也會隨著氮素水平的差異發(fā)生變化，只是不同位點的顏色特征參量變異系數(shù)都較小，葉尖和葉基沒有顯著性差異，因此可以選擇整個葉片作為氮素診斷的指示葉.S.C.Chapman等［21］的研究結(jié)果也顯示，作物葉片的氮素營養(yǎng)狀況在同一張葉片的不同位點上的分布有顯著的空間差異.因此，尋找最能代表作物葉片氮素營養(yǎng)狀況的敏感部位是精確診斷氮素營養(yǎng)的前提.

文中通過探索黃瓜葉片不同位點SPAD值的變化規(guī)律，分析葉片SPAD值與葉片含氮量之間的相關(guān)性，從而確定黃瓜葉片氮素營養(yǎng)診斷的葉片敏感位點，為黃瓜氮素的營養(yǎng)診斷提供最佳的參考測定位點.

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

供試黃瓜品種為津優(yōu)1號，在20～25℃的濕紗布上催芽黃瓜種子4 d后，把大小一致的苗移栽到盆里，盆的開口直徑為22 cm，高度20 cm，種植基質(zhì)為珍珠巖.黃瓜苗生長在江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)裝備工程學(xué)院Venlo型的溫室里，保持濕度(70±10)%，用山崎配方種植黃瓜.黃瓜長到四葉一心(幼苗期)時開始氮處理，分別在七葉一心(開花期)和十一葉一心(結(jié)果期)時測定數(shù)據(jù).黃瓜分成4組進(jìn)行氮處理試驗:N0為嚴(yán)重氮缺乏處理;N20為中等氮缺乏處理;N100為正常氮處理;N200為氮過量處理.正常氮處理(N100)為完全的山崎配方，包含3.5 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O，6 mmol·L-1KNO3，1 mmol·L-1NH4H2PO4和 2 mmol·L-1MgSO4·7H2O，加上微量元素，調(diào)節(jié)pH為5.8～6.0.缺氮組的營養(yǎng)液去掉Ca(NO3)2·4H2O和KNO3，分別用CaCl2和KC1來補(bǔ)鈣和鉀，過量氮組用NaNO3來添加氮.

1.2 數(shù)據(jù)采集與分析

1.2.1 SPAD值的取樣方法和測定

用SPAD-502分別測定開花期的正三葉和結(jié)果期的正七葉(從下往上數(shù)為正一葉、正二葉……以此類推)葉片各個位點的SPAD值.每張葉片分成如圖1所示的78個位置點，葉片主脈兩側(cè)對稱，避開葉脈，測定每個點的SPAD值.每個處理測定8張葉片，取平均值.

圖1 葉片取樣方法

1.2.2 葉片取樣方法和氮含量的測定

開花期的正三葉葉長為(23.2±0.8)cm，葉寬為(27.8±0.6)cm，用長28 cm，寬30 cm的自制帶圓孔的薄鐵板切割葉片;結(jié)果期的正七葉葉長為(24.4±0.9)cm，葉寬為(29.6±0.9)cm，用長 30 cm，寬30 cm的自制帶圓孔薄鐵板切割葉片.自制的帶圓孔薄鐵板沿長度、寬度各10等分，共100個孔，放到充分展開的正三葉葉片上面(見圖2)，對照帶方孔薄鐵板上的孔隙切割葉片，取樣后把殘留在取樣片上的支脈剔除.歸類時把主脈兩側(cè)對稱葉片放在一起，每個處理測定8張葉片，取平均值.按照圖1所示編號放入信封，105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重，稱干質(zhì)量，磨碎稱取適量，經(jīng)H2SO4-H2O2消煮后，用凱氏定氮法測定葉片含氮量.

圖2 自制帶孔薄鐵板

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

用Origin 8.0軟件作數(shù)據(jù)分析，變異系數(shù)CV=(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值)×100%.變異系數(shù)是衡量各觀測值變異程度的一個統(tǒng)計量，文中用變異系數(shù)表征不同氮營養(yǎng)水平下黃瓜葉片不同位點SPAD值的變化程度大小.在這里變異系數(shù)越大，指的是不同氮營養(yǎng)水平下SPAD值的差異性越大，說明該位點對氮營養(yǎng)水平的變化越敏感;反之，變異系數(shù)越小，指的是不同氮營養(yǎng)水平下SPAD值的差異性越小，說明該位點對氮營養(yǎng)水平的變化敏感性越差.

2 結(jié)果與分析

2.1 開花期黃瓜SPAD值的葉片分布規(guī)律

黃瓜開花期的第三完全展開葉上不同位點的SPAD值存在顯著的分布差異，如圖3，4所示.

由圖3可知，從主葉脈到葉邊緣位置，SPAD值顯示逐漸下降的變化趨勢，靠近主脈部分的SPAD值顯著高于葉片邊緣部位，且缺氮越嚴(yán)重，這一變化趨勢越明顯.圖4顯示從葉基部到葉尖部分，SPAD值顯示先上升后下降的變化趨勢，從葉基部開始40%～80%的區(qū)域的SPAD值較高，變異最小，而葉基部和葉尖的SPAD值更小一些.這個結(jié)果與文獻(xiàn)［21-22］在玉米和小麥上的測定結(jié)果相類似.由此可知，不同氮素水平下的SPAD值有顯著的差異，且葉片不同位點的SPAD值也有很大差異，隨著氮脅迫的加劇，不同位點的SPAD值的差異也越來越大.

圖3 主脈到邊緣不同距離下的測定結(jié)果

圖4 葉基部到葉尖不同距離下的測定結(jié)果

2.2 開花期SPAD值變異系數(shù)分析

開花期施氮水平對黃瓜正三葉不同位點SPAD值的影響如表1所示，由表可知不同位點的SPAD值的變異系數(shù)有明顯的差別.這與黃瓜缺氮時，葉片表現(xiàn)為均勻的黃化現(xiàn)象是不一致的，而是與不同位點的SPAD值的顯著不同這一現(xiàn)象相一致.由表1的數(shù)據(jù)可得出，整個葉片的SPAD值的變異系數(shù)平均值為17.8%，而緊靠主脈兩側(cè)(圖5中的黃色和綠色區(qū)域)相對距離0～60%范圍內(nèi)，即4A，4B，5B，5C，6A，6B和6C等的SPAD值的變異系數(shù)平均值為15.6%，說明這一區(qū)域?qū)Φ氐淖兓幻舾?葉邊緣與離葉邊緣的相對距離40%之間的這一區(qū)域(圖5中的橙色區(qū)域)的SPAD值的變異系數(shù)平均為18.1%，此區(qū)域的變異系數(shù)普遍比較高，說明從葉邊緣到葉片中間大概6 cm的距離內(nèi)的葉片區(qū)域?qū)Σ煌厮阶兓拿舾行云毡楸容^高.整個葉片最高的SPAD值的變異系數(shù)主要位于葉片尖部的三角部位(圖5中的紅色區(qū)域)，即10A，9A和9B位點處的變異系數(shù)分別為20.5%，20.3%和20.7%，變異系數(shù)平均值高達(dá)20.5%.這一結(jié)果表明了在開花期，對不同氮素水平變化最敏感的位點是葉尖周圍.因此，從整張葉片來看，基本上在離葉尖部的相對距離20%與葉邊緣之間的葉尖頂三角區(qū)域為氮素的最敏感區(qū)域(圖5中的紅色區(qū)域)，最容易反映氮素營養(yǎng)的變化情況.

表1 開花期施氮水平對黃瓜正三葉不同位點SPAD值的影響

圖5 開花期SPAD值的變異系數(shù)分布圖

2.3 開花期SPAD值與氮素指標(biāo)的相關(guān)性分析

開花期不同位點SPAD值與葉片含氮量的相關(guān)性如表2所示(*表示在0.05上有顯著意義;＊＊表示在0.01上有顯著意義).由表可知，在開花期黃瓜葉片各位點的SPAD值與葉片含氮量均存在很好的相關(guān)關(guān)系.雖然葉片主脈兩側(cè)位點的SPAD值與葉片含氮量的相關(guān)系數(shù)普遍高于葉片邊緣部位及葉片尖部，但葉片邊緣及尖部的SPAD值與葉片含氮量仍達(dá)到顯著水平.

綜合分析開花期不同位點的SPAD值與葉片含氮量的相關(guān)性和不同氮營養(yǎng)水平下的SPAD值的變異系數(shù)，結(jié)果表明在開花期黃瓜葉片離葉尖部相對距離20%與葉邊緣之間的葉尖頂三角區(qū)域(圖5中的紅色區(qū)域)為氮素的最敏感區(qū)域.

表2 開花期不同位點SPAD值與葉片含氮量的相關(guān)系數(shù)(r)

2.4 結(jié)果期SPAD值變異系數(shù)分析

圖6為結(jié)果期不同位點SPAD值變異系數(shù)分布圖.比較結(jié)果期不同氮素營養(yǎng)下的黃瓜葉片第七完全展開葉在不同位點SPAD值的變異系數(shù)，不同位點的SPAD值的變異系數(shù)有明顯的差別(圖6)，這與開花期不同位點SPAD值變異系數(shù)的變化相類似.圖6顯示在結(jié)果期，緊靠主脈兩側(cè)(圖6中的黃色區(qū)域)相對距離0～40%范圍內(nèi)SPAD值的變異系數(shù)最小，說明這一區(qū)域?qū)Φ氐淖兓幻舾?葉邊緣與離葉邊緣的相對距離60%之間的這一區(qū)域(圖6中的橙色區(qū)域)的SPAD值的變異系數(shù)普遍比較高，說明從葉邊緣到葉片中間大概9 cm的距離內(nèi)的葉片區(qū)域?qū)Σ煌厮阶兓拿舾行云毡楸容^高.整個葉片最高的SPAD值的變異系數(shù)主要位于葉片尖部的三角部位和葉邊緣尖部(圖6中的紅色區(qū)域).這一結(jié)果表明在結(jié)果期，黃瓜葉片離葉尖部相對距離30%與葉邊緣之間的葉尖頂三角區(qū)域(圖6中的紅色區(qū)域)為氮素的最敏感區(qū)域.

與開花期相比較，在結(jié)果期葉主脈兩側(cè)的黃色區(qū)域越來越小，即SPAD值的變異系數(shù)最小的范圍越來越小，而葉尖部周圍的紅色三角區(qū)域越來越大(圖5和6)，即SPAD值的變異系數(shù)最大的范圍越來越大.可見隨著植物的生長，植物對氮素變化的敏感區(qū)域越來越大，表明植物對氮素的需求越來越旺盛.可能的原因是結(jié)果期植物對氮素的需求要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于開花期.在開花期，植物吸收的氮素主要滿足植物營養(yǎng)生長的需要，而在結(jié)果期，營養(yǎng)中心轉(zhuǎn)移到果實中，吸收的氮素不僅要滿足植物營養(yǎng)生長的需要，更要滿足植物生殖生長的需要，一部分的氮素積累在果實中.

圖6 結(jié)果期SPAD值的變異系數(shù)分布圖

3 結(jié)論

黃瓜葉片的SPAD值與葉片含氮量有強(qiáng)烈的相關(guān)性，分析葉片不同位點SPAD值的分布情況，發(fā)現(xiàn)不同位點之間的SPAD值差異比較大，且氮脅迫越嚴(yán)重，這一差異越明顯，說明可用SPAD值作為不同位點氮素變化的敏感性診斷.不同位點的SPAD值的變異系數(shù)有顯著差異，這與黃瓜葉片缺氮素時肉眼可見的整體黃化特性是不一致的.不論是在開花期還是在結(jié)果期，除葉尖部以外的緊靠主脈兩側(cè)區(qū)域的SPAD值的變異系數(shù)最小，表明這一區(qū)域位點對氮素的變化最不敏感;葉片邊緣往中部6 cm這一區(qū)域的SPAD值的變異系數(shù)普遍比較大，且數(shù)值相對差異小，比較穩(wěn)定，表明這一區(qū)域位點對氮素的變化均比較敏感;而黃瓜葉片的離葉尖部的相對距離20%與葉邊緣之間的葉尖頂三角區(qū)域的SPAD值的變異系數(shù)在整張葉片中最高，表明此三角區(qū)域在氮素供給發(fā)生變化時要比葉片其他區(qū)域反應(yīng)更快更敏感，最能代表整張葉片的氮素營養(yǎng)狀況，因而是黃瓜葉片氮素營養(yǎng)診斷的最理想?yún)^(qū)域.通過研究黃瓜葉片不同位點SPAD值的變化規(guī)律，從而確定黃瓜葉片氮素診斷最佳測定位點的方法同樣適用于其他作物，但由于不同作物的葉片形狀和葉片營養(yǎng)分布規(guī)律均有很大差異，因而不同作物對氮素變化的最敏感位點仍需進(jìn)一步的試驗研究.

References)

［1］Lemaire G，Jeuffroy M H，Gastal F.Diagnosis tool for plant and crop N status in vegetative stage theory and practices for crop N management［J］.European Journal of Agronomy，2008，28:614-624.

［2］van den Berg A K，Perkins T D.Evaluation of a portable chlorophyll meter to estimate chlorophyll and nitrogen contents in sugar maple(Acer saccharum Marsh.)leaves ［J］.Forest Ecology and Management，2004，200:113-117.

［3］屈衛(wèi)群，王紹華，陳兵林，等.棉花主莖葉SPAD值與氮素營養(yǎng)診斷研究［J］.作物學(xué)報，2007，33(6):1010-1017.

Qu Weiqun，Wang Shaohua，Chen Binglin，et al.SPAD value of cotton leaves on main stem and nitrogen diagnosis for cotton growth［J］.Acta Agronomica Sinica，2007，33(6):1010-1017.(in Chinese)

［4］王紹華，曹衛(wèi)星，王強(qiáng)盛，等.水稻葉色分布特點與氮素營養(yǎng)診斷［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35(12):1461-1466.

Wang Shaohua，Cao Weixing，Wang Qiangsheng，et al.Positional distribution of leaf color and diagnosis of nitrogen nutrition in rice plant［J］.Scientia AgriculturaSinica，2002，35(12):1461-1466.(in Chinese)

［5］賈良良.應(yīng)用數(shù)字圖像技術(shù)與土壤植株測試進(jìn)行冬小麥氮營養(yǎng)診斷［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，2003.

［6］郭建華，趙春江，王 秀，等.作物氮素營養(yǎng)診斷方法的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展［J］.中國土壤與肥料，2008(4):10-14.

Guo Jianhua，Zhao Chunjiang，Wang Xiu，et al.Research advancement and status on crop nitrogen nutrition diagnosis［J］.Soil and Fertilizer Sciences in China，2008(4):10-14.(in Chinese)

［7］賈良良，陳新平，張福鎖.作物氮營養(yǎng)診斷的無損測試技術(shù)［J］.世界農(nóng)業(yè)，2001，266(6):36-37.

Jia Liangliang，Chen Xinping，Zhang Fusuo.Non-destructive detection of nitrogen nutrition status in plant［J］.World Agriculture，2001，266(6):36-37.(in Chinese)

［8］李銀水，余常兵，廖 星，等.三種氮素營養(yǎng)快速診斷方法在油菜上的適宜性分析［J］.中國油料作物學(xué)報，2012，34(5):508-513.

Li Yinshui，Yu Changbing，Liao Xing，et al.Applicability of three rapid methods of nitrogen nutrition diagnosis on rapeseed ［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2012，34(5):508-513.(in Chinese)

［9］喬 欣，馬 旭，張小超，等.大豆葉綠素和鉀素信息的冠層光譜響應(yīng)［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報，2008，39(4):108-111.

Qiao Xin，Ma Xu，Zhang Xiaochao，et al.Response of coronary spectrum on chlorophyll and K information of soy［J］.Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery，2008，39(4):108-111.(in Chinese)

［10］苗 騰，趙春江，郭新宇，等.基于葉綠素相對值的植物葉片顏色模擬方法［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報，2014，45(8):282-287.

Miao Teng，Zhao Chunjiang，Guo Xinyu，et al.Simulation of plant leaf color based on relative content of chlorophyll［J］.Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery，2014，45(8):282-287.(in Chinese)

［11］朱詠莉，李萍萍，毛罕平，等.生菜葉片光譜紅邊參數(shù)對氮營養(yǎng)的響應(yīng)特征分析［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報，2011，42(11):174-177.

Zhu Yongli，Li Pingping，Mao Hanping，et al.Response features of red edge parameters for lettuce leaf spectra under different nitrogen levels［J］.Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery，2011，42(11):174-177.(in Chinese)

［12］Samborski S M，Tremblay N，F(xiàn)allon E.Strategies to make use of plant sensors-based diagnostic information for nitrogen recommendations ［J］.Agronomy Journal，2009，101(4):800-815.

［13］Ali A M，Thind H S，Sharma S，et al.Prediction of dry direct-seeded rice yields using chlorophyll meter，leaf color chart and GreenSeeker optical sensor in northwestern India［J］.Field Crops Research，2014，161:11-15.

［14］Jr F A D，Center T D，Mattison E D.In situ estimates of waterhyacinth leaf tissue nitrogen using a SPAD-502 chlorophyll meter［J］.Aquatic Botany，2012，10:72-75.

［15］Errecart P M，Agnusdei M G，Lattanzi F A，et al.Leaf nitrogen concentration and chlorophyll meter readings as predictors of tall fescue nitrogen nutrition status［J］.Field Crops Research，2012，129:46-58.

［16］Huang J，He F，Cui K，et al.Determination of optimal nitrogen rate for rice varieties using a chlorophyll meter［J］.Field Crops Research，2008，105:70-80.

［17］Songsri P，Jogloy S，Holbrook C C，et al.Association of root，specific leaf area and SPAD chlorophyll meter reading to water use efficiency of peanut under different available soil water［J］.Agricultural Water Management，2009，96:790-798.

［18］張延麗，田吉林，翟丙年，等.不同施氮水平下黃瓜葉片SPAD值與硝態(tài)氮含量及硝酸還原酶活性的關(guān)系［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2009，37(1):189-193.

Zhang Yanli，Tian Jilin，Zhai Bingnian，et al.Relationship between leaf SPAD values and the nitrate content and nitrate reductase activity in cucumber at different nitrogen rates［J］.Journal of Northwest A＆F University:Natural Science Edition，2009，37(1):189-193.(in Chinese)

［19］李嵐?jié)?，?波，魯劍巍，等.冬油菜葉片SPAD的時空分布和氮素診斷的葉位選擇［J］.中國油料作物學(xué)報，2014，36(1):76-83.

Li Lantao，Liu Bo，Lu Jianwei，et al.Spatial distribution of SPAD value and determination of the suitable leaf for N diagnosis in winter rapeseed ［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2014，36(1):76-83.(in Chinese)

［20］祝錦霞，鄧勁松，林芬芳，等.水稻氮素機(jī)器視覺診斷最佳葉位和位點的選擇研究［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報，2010，41(4):179-183.

Zhu Jinxia，Deng Jinsong，Lin Fenfang，et al.Determination of suitable leaf for nitrogen diagnosis in rice based on computer vision ［J］.Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery，2010，41(4):179-183.(in Chinese)

［21］Chapman S C，Barreto H J.Using a chlorophyll meter to estimate specific leaf nitrogen of tropical maize during vegetative growth ［J］.Agronomy Journal，1997，89:557-562.

［22］李志宏，劉宏斌，張福鎖.應(yīng)用葉綠素儀診斷冬小麥氮營養(yǎng)狀況的研究［J］.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2003，9(4):401-405.

Li Zhihong，Liu Hongbin，Zhang Fusuo.Research of nitrogen nutrition status for winter wheat based on chlorophyll meter ［J］.PlantNutritionandFertilizer Science，2003，9(4):401-405.(in Chinese)