大蒜素防治大鼠肝纖維化的效果及其機(jī)制探討

葉靜，周曉明，張立，王璐璐，劉清華

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832003;2上海市徐匯區(qū)康健街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心;3石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

大蒜素的化學(xué)名為二烯丙基三硫化物，是大蒜的主要有效成分，在抗病原微生物、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、預(yù)防心腦血管疾病、抗氧化等方面具有多種藥理作用［1，2］。近年來少數(shù)體內(nèi)研究表明，大蒜素具有抗肝纖維化的作用，與下調(diào)炎癥因子和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)水平有關(guān)，但其作用機(jī)制尚不明確［3，4］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，采用四氯化碳(CCl4)腹腔注射法制備大鼠肝纖維化模型，于實(shí)驗(yàn)第4周開始即可有不同程度的肝纖維化改變;而且該模型病理特征穩(wěn)定，在病理生理學(xué)方面與人類肝纖維化較為相似［5，6］。2013年12月～2014年2月，我們采用這種方法制備大鼠肝纖維化模型，并分別于造模開始及造模第5周予以大蒜素干預(yù)治療，觀察其對(duì)大鼠肝纖維化的保護(hù)效果。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠45只，雌雄各半，體質(zhì)量220～260 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大蒜素軟膠囊(批號(hào)13050602)購(gòu)于新疆華世丹藥業(yè)有限公司，CCl4購(gòu)于廣州萬(wàn)從化工有限公司。ALT、AST、生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子β(TGF-β)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州佰而林生物科技有限公司，Thermo Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司，Olympus BX-51顯微鏡購(gòu)于日本 Olympus公司。

1.2 造模與分組處理 將45只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組6只、溶劑對(duì)照組7只、模型組8只、小劑量預(yù)防組8只、中劑量預(yù)防組8只及中劑量治療組8只。大鼠肝纖維化模型的建立參照趙松峰等［5］的方法，用植物油將CCl4、大蒜素分別配成40%的油溶液和相應(yīng)濃度。小、中劑量預(yù)防組及中劑量治療組均給予CCl4油溶液1 mL/(kg·次)腹腔注射，2次/周，共8周;同時(shí)小、中劑量預(yù)防組于造模開始即分別給予大蒜素11、22 mg/(kg·d)灌胃，共8周;而中劑量治療組則于造模后第5周開始給予大蒜素22 mg/(kg·d)灌胃，共4周?？瞻讓?duì)照組不做任何處理，自由飲食、飲水。溶劑對(duì)照組給予等量植物油灌胃及腹腔注射，模型組給予等量植物油灌胃、CCl4油溶液腹腔注射。所有大鼠喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)食料，自由飲水。

1.3 血清ALT、AST、TGF-β檢測(cè) 8周后于腹主動(dòng)脈取血，制備血清。采用ELISA法檢測(cè)各組血清ALT、AST、TGF-β，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.4 肝臟組織學(xué)觀察 腹主動(dòng)脈取血后，處死大鼠，解剖后肉眼觀察肝臟組織的外觀形態(tài)學(xué)改變。取肝臟左葉，常規(guī)甲醛固定，乙醇逐級(jí)脫水，石蠟包埋、切片，行HE染色及Masson染色。于100倍光鏡下觀察肝細(xì)胞變性、膠原纖維增生程度。

1.5 肝細(xì)胞變性及膠原纖維增生程度評(píng)價(jià)方法參照顧宏圖等［7］的評(píng)分方法，評(píng)價(jià)肝細(xì)胞變性及膠原纖維增生程度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清ALT、AST、TGF-β比較 見表1。

表1 各組血清ALT、AST、TGF-β比較(±s)

表1 各組血清ALT、AST、TGF-β比較(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，a P＜0.05，b P＜0.01;與溶劑對(duì)照組比較，c P＜0.05，d P＜0.01;與模型組比較，e P＜0.01;與小劑量預(yù)防組比較，f P＜0.01;與中劑量預(yù)防組比較，g P＜0.05。

6 7.79±0.45 4.63±0.27 21.18±5.57溶劑對(duì)照組 7 7.83±1.20 4.59±0.64 18.95±2.98模型組 8 36.85±2.77bd 19.01±1.40bd 101.42±10.96bd小劑量預(yù)防組 8 24.03±7.48bde 12.82±3.88bde 71.50±11.98bde中劑量預(yù)防組 8 14.23±4.53bdef 7.22±1.83acef 45.44± 9.45bdef中劑量治療組 8 10.60±1.79ef 5.46±0.96ef 34.87±4.76空白對(duì)照組bdefg

2.2 肝臟組織學(xué)檢查結(jié)果 肝臟組織染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組及溶劑對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊;表現(xiàn)為肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，未見變性和壞死，僅在匯管區(qū)有少量膠原纖維表達(dá)。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，匯管區(qū)纖維組織明顯增生并伸入肝小葉將小葉分割，形成完全或不完全假小葉，小葉內(nèi)肝細(xì)胞氣球樣變性廣泛，部分肝細(xì)胞灶狀壞死。小劑量預(yù)防組肝組織匯管區(qū)及小葉內(nèi)仍可見較薄的纖維間隔形成，少數(shù)形成不完全的假小葉，肝小葉部分肝細(xì)胞氣球樣變性，少數(shù)點(diǎn)狀壞死。中劑量預(yù)防組匯管區(qū)散在星芒狀纖維組織增生，未形成明顯纖維間隔，肝小葉內(nèi)仍可見局灶性氣球樣變性的肝細(xì)胞。中劑量治療組匯管區(qū)纖維組織增生，部分纖維間隔形成，但小葉結(jié)構(gòu)大部分保存，僅見散在的肝細(xì)胞氣球樣變性。見插頁(yè)Ⅰ圖1。

圖1 大鼠肝組織學(xué)觀察（×100）

2.3 各組肝細(xì)胞變性及膠原纖維增生程度比較見表2。

表2 各組肝細(xì)胞變性及膠原纖維增生程度比較(分，±s)

表2 各組肝細(xì)胞變性及膠原纖維增生程度比較(分，±s)

注:與空白對(duì)照組比較，a P＜0.01;與溶劑對(duì)照組比較，b P＜0.01;與模型組比較，c P＜0.01。

組別 n 肝細(xì)胞變性程度 膠原纖維增生程度空白對(duì)照組6 0 0溶劑對(duì)照組7 0 0模型組 8 3.38±0.52ab 2.87±0.83ab小劑量預(yù)防組 8 1.50±0.76abc 1.75±0.71abc中劑量預(yù)防組 8 1.37±0.51abc 1.12±0.35abc中劑量治療組 8 1.25±0.46abc 1.63±0.52abc

3 討論

肝纖維化是肝臟受到損傷時(shí)的一種修復(fù)反應(yīng)，是多種慢性肝病共有的病理改變，其特征為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多而降解減少。肝纖維化的演進(jìn)與多種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子有關(guān)，如IL-6、IFN-γ、TNF-α及TGF-β等，炎癥相關(guān)細(xì)胞因子調(diào)控失衡是肝纖維化形成與發(fā)展的重要因素之一［8］。肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活被公認(rèn)為肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，TGF-β在HSC激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用［9］。TGF-β既能夠激活HSC，促進(jìn)膠原、纖維連接蛋白、蛋白多糖等ECM主要成分的合成，又能促進(jìn)HSC分泌金屬蛋白酶抑制劑，減少ECM的降解，使ECM的合成與降解失衡，從而加速肝纖維化的發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，各組血清TGF-β比較，模型組＞小劑量預(yù)防組＞中劑量預(yù)防組＞中劑量治療組＞空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組(P均＜0.05)。說明大蒜素能明顯下調(diào) CCl4所致的肝纖維化大鼠血清TGF-β，并且其療效可能有一定的劑量依賴性。D' Argenio等［10］對(duì)CCl4誘導(dǎo)2周的肝纖維化大鼠給予大蒜提取物處理后，發(fā)現(xiàn)其血清TGF-β、ALT等均明顯下降，這與我們的研究結(jié)果相一致，但并不能明確是大蒜提取物中的何種成分發(fā)揮了該藥理作用。本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果亦顯示，大蒜素具有抑制HSC增殖和促進(jìn) ECM降解的作用［11，12］。上述結(jié)果均提示，大蒜素對(duì)肝纖維化具有預(yù)防兼治療的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平有關(guān)。

ALT是反映肝功能受損最靈敏的指標(biāo)，而AST的升高提示肝功能嚴(yán)重受損。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生變性、壞死或細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ALT、AST即釋放入血，二者的水平可反映出肝功能受損程度。本研究中，肝纖維化大鼠經(jīng)大蒜素干預(yù)治療后，血清中的ALT、AST水平均明顯下降，表明大蒜素具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用，與本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果相符［13］。本實(shí)驗(yàn)病理組織觀察結(jié)果顯示，經(jīng)大蒜素干預(yù)治療后，肝纖維化大鼠肝細(xì)胞變性壞死、炎癥程度明顯減輕，肝組織內(nèi)膠原纖維明顯減少，肝小葉結(jié)構(gòu)也有所恢復(fù)。這與朱蘭香等［4］的研究結(jié)果相一致，均提示大蒜素具有減輕肝細(xì)胞損傷的作用。

因此，中等劑量的大蒜素即可較好地防治大鼠肝纖維化，可能與其抑制炎性反應(yīng)及防止肝細(xì)胞變性有關(guān)。提示大蒜素在預(yù)防及治療肝纖維化的過程中具有積極的作用，可能會(huì)成為治療肝纖維化的一種新選擇。

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