小麥-黑麥1BL.1RS易位系中1BL染色體臂的變異

葛 群，李文靜，任天恒，李 治，任正隆

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

小麥-黑麥1BL.1RS易位系中1BL染色體臂的變異

葛 群，李文靜，任天恒，李 治，任正隆

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

【目的】 研究小麥-黑麥1BL.1RS易位系中1BL染色體臂的變異，為1BL.1RS在小麥育種中的進一步應(yīng)用提供依據(jù)。【方法】 利用 GISH和 FISH技術(shù)從小麥品種綿陽11(MY11)和白粒黑麥遠緣雜交的后代中篩選1R(1B)代換系G1和1BL.1RS易位系G2。選用小麥染色體1B上的40對引物對親本MY11、白粒黑麥、G1、G2以及普通小麥中國春(CS)進行SSR分析。【結(jié)果】 6對引物在MY11、CS及G2中擴增出1BL的條帶，在G1和白粒黑麥中未擴增出條帶，其中3對引物 (Xgwm259、Xbarc188，Xgwm268)在親本MY11及后代1BL.1RS易位系(G2)中擴增出差異性的1BL條帶，說明在小麥-黑麥遠緣雜交產(chǎn)生的易位系后代中，1BL染色體臂發(fā)生變異。有13對引物在MY11、白粒黑麥和G1、G2中擴增出差異性條帶，說明在小麥-黑麥遠緣雜交后代中小麥微衛(wèi)星發(fā)生了一定的變化；引物Xbarc8能擴增出白粒黑麥染色體1RS的特異條帶，且該條帶穩(wěn)定出現(xiàn)，可以作為白粒黑麥1RS染色體識別和鑒定的分子標(biāo)記。【結(jié)論】 小麥-黑麥1BL.1RS易位系中1BL染色體臂發(fā)生變異，Xbarc8是鑒定白粒黑麥1RS染色體臂的新的分子標(biāo)記。

小麥；黑麥；1BL.1RS易位系；1R(1B)代換系；微衛(wèi)星序列

小麥-黑麥 1BL.1RS易位染色體在小麥育種中已被廣泛應(yīng)用，世界上有數(shù)百個小麥品種含1BL.1RS易位染色體[1]。目前，因1RS攜帶的抗病基因被新的病原生理小種所克服[2-3]，1RS在小麥育種中的應(yīng)用遇到了瓶頸。因此，對1BL.1RS易位染色體遺傳多樣性的研究顯得極為重要[4-5]。前人對1BL.1RS染色體多樣性的研究主要集中在1RS的多樣性和著絲粒結(jié)構(gòu)的變異方面[6-8]，而對1BL的變異情況尚未見相關(guān)研究。1BL染色體臂作為1BL.1RS易位染色體的組成部分，其變異對1BL.1RS染色體作用的發(fā)揮會產(chǎn)生重大影響，如對染色體結(jié)構(gòu)、染色體行為產(chǎn)生一定的影響。因此，1BL染色體臂變異的研究，對1BL.1RS易位在小麥育種中的應(yīng)用具有重要意義。

在眾多研究基因組變異的工具中，簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat，SSR)是一個重要的工具，也被稱作微衛(wèi)星序列(Microsatellite) ，它是以1～6個堿基為基本單元的串聯(lián)重復(fù)序列，側(cè)翼序列大多是保守的單拷貝序列[9]，廣泛分布于植物基因組中。SSR具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、數(shù)量多、覆蓋性好等優(yōu)點，因此常被用于進行植物多樣性分析[10-11]及基因定位[12]。在植物遇到應(yīng)激時，包括環(huán)境影響、遠緣雜交及體外培養(yǎng)均可能造成重復(fù)序列的改變[13-14]。已有報道在小麥-黑麥、小麥-大麥遠緣雜交形成雙二倍體以及人工合成小麥過程中微衛(wèi)星發(fā)生改變[15-17]。

本研究利用定位于1BL染色體臂上的微衛(wèi)星標(biāo)記，檢測1BL.1RS染色體中1BL染色體臂的變異情況，為1BL.1RS在小麥育種中的進一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料G1、G2是普通小麥品種綿陽11(MY11)和白粒黑麥遠緣雜交F1與親本MY11回交所得的BC1經(jīng)過連續(xù)自交得到的較穩(wěn)定材料。MY11、白粒黑麥、中國春(CS)均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳育種重點實驗室提供。

1.2 植物DNA提取

綿陽11、白粒黑麥、G1、G2和中國春基因組DNA提取參考Zhang等[18]的方法。

1.3 基因組原位雜交和雙色熒光原位雜交

利用基因組原位雜交(GISH)和雙色熒光原位雜交(FISH)方法，分別使用黑麥全基因組DNA、Aegilopstauschii重復(fù)序列pAs1和黑麥重復(fù)序列pSc119.2作為探針，對材料G1、G2的染色體結(jié)構(gòu)組成進行鑒定。黑麥全基因組DNA和重復(fù)序列pAs1使用Texas Red-5-dUTP (Invitrogen)進行標(biāo)記，重復(fù)序列pSc119.2利用Alexa Fluor-488-5-dUTP (Invitrogen)進行標(biāo)記。有絲分裂中期染色體制備，探針標(biāo)記、GISH以及FISH參照Han等[19]描述的方法。采用熒光顯微鏡Olympus BX51觀察染色體并照相。

1.4 引物的選擇和PCR擴增

用http://wheat.pw.usda.gov 網(wǎng)站公布的位于小麥染色體1B上的40對SSR引物對試驗材料進行分析。PCR擴增及聚丙烯酰胺凝膠電泳的程序和方法參照李雪[20]描述的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 GISH和FISH鑒定結(jié)果

為了準(zhǔn)確鑒定材料G1、G2的染色體組成，采用普通小麥中國春(CS)全基因組DNA作封阻，黑麥全基因組DNA和重復(fù)序列pSc119.2、pAs1分別為探針，對材料G1、G2進行GISH和FISH分析，結(jié)果顯示：材料G1根尖細胞中含有42條染色體，其中包含40條小麥染色體，而1對小麥1B染色體被1對黑麥1R染色體替換(圖1A)；材料G2根尖細胞中含有42條染色體，包括40條小麥染色體和2條1BL.1RS易位染色體(圖1B)。綜上證明材料G1是1R(1B)代換系，材料G2是1BL.1RS易位系。

2.2 不同小麥材料SSR引物擴增結(jié)果

2.2.1 染色體臂1BL的變異 利用小麥染色體1B上的40對引物對小麥-黑麥1BL.1RS易位系G2、1R(1B)代換系G1和親本MY11、白粒黑麥以及中國春全基因組DNA進行SSR分析，結(jié)果顯示，6對引物(Xgwm268、Xgwm259、Xbarc188、Xbarc80、Xbarc61、Xwmc728)在MY11、CS及G2中擴增出1BL的條帶，在G1和白粒黑麥中未擴增出條帶，其中3對引物(Xgwm268、Xgwm259、Xbarc188)在親本MY11和G2中擴增條帶存在差異(圖2)，Xgwm268在G2中的擴增產(chǎn)物較在親本MY11中擴增產(chǎn)物變長；Xgwm259在G2中的擴增產(chǎn)物較在親本MY11中擴增產(chǎn)物變短，且可能發(fā)生條帶缺失和增加；Xbarc188在G2中擴增條帶發(fā)生丟失和增加。這些結(jié)果說明，在遠緣雜交后代1BL.1RS易位系中，染色體1BL發(fā)生變異。

2.2.2 微衛(wèi)星的變化 40對引物中有13對引物在MY11、白粒黑麥和G1、G2中擴增出差異性條帶。其中有4對引物(Xbarc128、Xgwm153、Xgwm582和Xgwm498)在MY11、G2和白粒黑麥中擴增出相同條帶，而在G1中擴增出不同的條帶，且在G1中部分條帶丟失(圖3A)；5對引物(Xwmc367、Xwmc51、Xbarc174、Xgwm264和Xgwm131)在1R(1B)代換系(G1)和1BL.1RS易位系(G2)中擴增出相同條帶，且與親本MY11和白粒黑麥不同，在G1和G2中擴增產(chǎn)物量增加和擴增片段增大(圖3B)；4對引物(Xbarc181、Xbarc55、Xwmc85和Xbarc302)在MY11、白粒黑麥、G1和G2中擴增出的條帶完全不同(圖3C)。這些結(jié)果表明，在遠緣雜交后代1BL.1RS易位系中小麥微衛(wèi)星可能發(fā)生變化。

2.2.3 白粒黑麥1RS的特異引物 40對引物中，只有引物Xbarc8在材料G1(1R(1B)代換系)、G2(1BL.1RS易位系)和白粒黑麥中擴增出相同的條帶(圖4)，且該條帶經(jīng)多次重復(fù)均穩(wěn)定出現(xiàn)，并且該條帶未出現(xiàn)在小麥CS和MY11中(圖4)，因此引物Xbarc8可以作為識別和鑒定小麥CS和MY11背景中白粒黑麥1RS染色體臂的特異引物。

3 討 論

小麥-黑麥1BL.1RS易位系已被廣泛應(yīng)用于小麥育種中，對于1BL.1RS染色體的多樣性研究主要集中在1RS染色體臂以及著絲粒區(qū)域。蘇亞蕊等[6]用11對1RS特異引物對21個1BL.1RS小麥易位系進行擴增，結(jié)果顯示1RS出現(xiàn)特異帶的丟失或增加，并認為這些變化可能是1RS臂堿基發(fā)生變化造成的；唐宗祥等[7]用重復(fù)序列pSc119.1對姊妹系1BL.1RS易位分析發(fā)現(xiàn)，姊妹系之間黑麥特異重復(fù)序列pSc119.1發(fā)生變化，說明黑麥1RS染色體臂發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。本研究利用GISH和FISH技術(shù)準(zhǔn)確鑒定了1BL.1RS易位系和1R(1B)代換系，并利用SSR方法對其進行分析，結(jié)果顯示，6對引物在MY11、CS及G2中擴增出1BL的條帶，在G1和白粒黑麥中未擴增出條帶，其中3對引物在1BL.1RS易位系和親本MY11間擴增出差異性條帶，這意味著小麥1BL染色體臂發(fā)生了變異。小麥-黑麥遠緣雜交、雙二倍體形成、外源染色體的進入對1BL染色體臂造成的影響以及長期的栽培等，都是造成小麥-黑麥1BL.1RS易位系中1BL染色體變異的原因。唐宗祥等[21]對小麥-黑麥雙二倍體植株及其F1植株進行SSR分析發(fā)現(xiàn)，在小麥-黑麥雙二倍體形成過程中微衛(wèi)星未發(fā)生長度變異。本試驗中，在小麥-黑麥1BL.1RS易位系中，微衛(wèi)星發(fā)生了長度變異以及條帶的丟失或增加，這可能是在小麥-黑麥1BL.1RS易位形成過程中或長期栽培過程中造成的，但本試驗中1BL染色體臂變異的具體機制還需進一步研究。

遠緣雜交是創(chuàng)造新的不同于親本性狀的一種方法。通過對遠緣雜交后經(jīng)人工加倍獲得的小麥-黑麥雙二倍體及其后代進行遺傳多樣性研究，可以了解遠緣雜交及雙二倍體形成過程中基因組、染色體行為及表觀遺傳學(xué)的快速變化[22]。小麥-黑麥遠緣雜交組合中，小麥細胞質(zhì)背景、親本的親緣程度、外源染色體附加、基因組大小的不同、染色質(zhì)組成形式和細胞周期的不同都是造成染色體組變化的原因[23-25]。同時，研究表明在多倍化過程中常常伴隨低拷貝、編碼和非編碼序列的快速丟失，且具有重復(fù)性[22,26-27]。Han等[15]報道，種間雜交和小黑麥雙二倍體中的染色體組改變發(fā)生在較早的時期，隨后雙二倍體則保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，同時DNA水平上的染色體組間的重組可以造成非常有限范圍內(nèi)基因組的變化。在本研究中，40對引物中有13對SSR引物在親本和后代中擴增出不同的條帶，證明在遠緣雜交形成易位的過程中，小麥染色體的微衛(wèi)星也會發(fā)生一定變化。在進一步的研究中，如果詳細檢測不同世代植株染色體的微衛(wèi)星變異，進行前后代微衛(wèi)星的比較，就可以揭示微衛(wèi)星變化的具體原因和機制。

某一物種中的SSR標(biāo)記常常被成功地應(yīng)用于其近緣種屬中，例如小麥的微衛(wèi)星被成功地應(yīng)用于黑麥、大麥、簇毛麥等物種中。Zhang等[28]發(fā)現(xiàn)，276對小麥SSR引物中有9對可以作為簇毛麥的特異分子標(biāo)記。本試驗40對SSR引物中，有1對引物(Xbarc8)在白粒黑麥、1R(1B)代換系和1BL.1RS易位系中擴增出特異條帶，而小麥CS和MY11中未出現(xiàn)相同的特征帶，表明Xbarc8位于白粒黑麥1RS上，且可以作為白粒黑麥1RS染色體的特異引物。田茂潔等[29]發(fā)現(xiàn)，在50對普通小麥SSR引物中有3對引物gwm232、gwm260 和gwm644在13種黑麥基因組DNA中擴增出黑麥特異片段，對這些片段進行回收測序，發(fā)現(xiàn)該特異片段包含啟動子區(qū)域；Tang等[30]利用小麥上的150對SSR引物擴增小麥-黑麥附加系及黑麥，只有9對引物擴增出黑麥特異條帶。但是這些引物和本試驗中的Xbarc8不同，因此引物Xbarc8是白粒黑麥1RS染色體上新的特異引物，為識別和鑒定小麥CS和MY11背景中白粒黑麥1RS染色體臂的特異引物。

[1] Singh R,Tiwari R,Gupta R K,et al.1RS.1BL translocation and grain yield as well as bread loaf volume in Indian wheats [J].Cereal Research Communications,2009,37(3):441-448.

[2] 雷孟平,李光蓉,劉 成,等.抗條銹病的小麥-非洲黑麥異代換系的分子細胞學(xué)鑒定 [J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2013,21(3):263-271.

Lei M P,Li G R,Liu C,et al.Molecular cytogenetic characterization of aTriticumdurum-Secaleafricanumsubstitution line for resistance to stripe rust (PucciniastriiformisEriks.f.sp.tritici) [J].Journal of Agricultural Biotechnology,2013,21(3):263-271.(in Chinese )

[3] Chen W Q,Wu L R,Liu T G,et al.Race dynamics,diversity,and virulence evolution inPucciniastriiformisf.sp.tritici,the causal agent of wheat stripe rust in China from 2003 to 2007 [J].Plant Disease,2009,93(11):1093-1101.

[4] Ren T H,Yang Z J,Yan B J,et al.Development and characterization of a new 1BL.1RS translocation line with resistance to stripe rust and powdery mildew of wheat [J].Euphytica,2009,169(2):207-213.

[5] Ren T H,Chen F,Yan B J,et al.Genetic diversity of wheat-rye 1BL.1RS translocation lines derived from different wheat and rye sources [J].Euphytica,2012,183(2):133-146.

[6] 蘇亞蕊,張大樂,高安禮,等.小麥1BL/1RS易位系1RS分子標(biāo)記位點穩(wěn)定性分析 [J].麥類作物學(xué)報,2006,26(6):6-10.

Su Y R,Zhang D L,Gao A L,et al.Analysis on the stability of 1RS in the wheat-rye 1BL/1RS translocation lines [J].Journal of Triticeae Crops,2006,26(6):6-10.(in Chinese)

[7] 唐宗祥,任正隆,符書蘭,等.黑麥特異重復(fù)序列pSc119.1在姊妹T1 RS.1BL易位系中的變異 [J].遺傳,2007,29(2):235-242.

Tang Z X,Ren Z L,Fu S L,et al.Variation of rye-specific repetitive DNA pSc119.1 among sister T1 RS.1BL translocations [J].Hereditas,2007,29(2):235-242.(in Chinese)

[8] Tang Z X,Fu S L,Ren Z L,et al.Characterization of three wheat cultivars possessing new 1BL.1RS wheat-rye translocations [J].Plant Breed,2009,128:524-527.

[9] 王 曦,劉太國,向文勝,等.小麥稈銹菌特異性 SSR分子標(biāo)記的開發(fā) [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(22):4593-4599.

Wang X,Liu T G,Xiang W S,et al.Development of a SSR molecular marker forPucciniagraminisf.sp.tritici [J].Scientia Agricultura Sinica,2011,44(22):4593-4599.(in Chinese)

[10] 李衛(wèi)華,劉 偉,尤明山,等.利用多種SSR引物構(gòu)建小麥遺傳連鎖圖譜及其多態(tài)性分析 [J].麥類作物學(xué)報,2007,27(1):1-6.

Li W H,Liu W,You M S,et al.Construction of wheat molecular linkage map using different SSR markers and the polymorphism of the markers [J].Journal of Triticeae Crops,2007,27(1):1-6.(in Chinese)

[11] 郭小麗,劉冬成,羅 錚,等.我國部分優(yōu)質(zhì)小麥品種遺傳差異的SSR標(biāo)記分析 [J].麥類作物學(xué)報,2004,24(1):1-5.

Guo X L,Liu D C,Luo Z,et al.Genetic diversity of some Chinese high quality wheat detected by SSR markers [J].Journal of Triticeae Crops,2004,24(1):1-5.(in Chinese)

[12] 王 瑞,劉紅彥,李洪連,等.小麥抗白粉病基因Pm6的PCR標(biāo)記鑒定 [J].麥類作物學(xué)報,2007,27(3):421-424.

Wang R,Liu H Y,Li H L,et al.Identification of PCR markers linked to wheat powdery mildew resistance gene Pm6 [J].Journal of Triticeae Crops,2007,27(3):421-424.(in Chinese)

[13] Zhang M,Wang H,Dong Z,et al.Tissue culture-induced variation at simple sequence repeats in sorghum (SorghumbicolorL.) is genotype-dependent and associated with down-regulated expression of a mismatch repair gene,MLH3 [J].Plant Cell Reports,2010,29(1):51-59.

[14] Feldman M,Levy A A.Genome evolution due to allopolyploi-dization in wheat [J].Genetics,2012,192(3):763-774.

[15] Han F P,Fedak G,Ouellet T,et al.Rapid genomic changes in interspecific and intergeneric hybrids and allopolyploids of triticeae [J].Genome,2003,46(4):716-723.

[16] Vershinin A V,Salina E A,Svitashev S K.Is there a connection between genomic changes and wide hybridization [J].Hereditas,1992,116(3):213-217.

[17] 王變銀,翟 軍,郝元峰,等.對人工合成小麥的微衛(wèi)星變異分析 [J].作物學(xué)報,2011,37(8):1491-1496.

Wang B Y,Zhai J,Hao Y F,et al.Microsatellite variation in synthetic hexaploid wheat [J].Acta Agronomica Sinica,2011,37(8):1491-1496.(in Chinese)

[18] Zhang H B,Zhao X P,Ding X L,et al.Preparation of megabase-size DNA from plant nuclei [J].The Plant Journal,1995,7(1):175-184.

[19] Han F P,Gao Z,Yu W C,et al.Minichromosome analysis of chromosome pairing,disjunction,and sister chromatid choesion in maize [J].The Plant Cell Online,2007,19(12):3853-3863.

[20] 李 雪.簡單重復(fù)序列在小麥中的突變機制與抗病應(yīng)用的初步研究 [D].四川雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

Li X.The study on mutations mechanism of simple repeat sequence and disease resistant application [D].Ya’an,Sichuan:Sichuan Agricultural University,2011.(in Chinese)

[21] 唐宗祥,符書蘭,任正隆,等.小麥-黑麥雙二倍體形成過程中微衛(wèi)星序列的變化 [J].麥類作物學(xué)報,2008,28(2):197-201.

Tang Z X,Fu S L,Ren Z L,et al.Microsatellite sequence variation of wheat-rye amphiploids detected by SSR markers [J].Journal of Triticeae Crops,2008,28(2):197-201.(in Chinese)

[22] Ozkan H,Levy A A,Feldman M.Allopolyploidy-induced rapid genome evolution in the wheat (Aegilops-Triticum) group [J].The Plant Cell Online,2001,13(8):1735-1747.

[23] Ma X F,Gustafson J P.Timing and rate of genome variation in triticale following allopolyploidization [J].Genome,2006,49(8):950-958.

[24] Bento M,Gustafson P,Viegas W,et al.Genome merger:From sequence rearrangements in triticale to their elimination in wheat-rye addition lines [J].Theoretical and Applied Genetics,2010,121(3):489-497.

[25] Fu S L,Sun C F,Yang M Y,et al.Genetic and epigenetic variations induced by wheat-rye 2R and 5R monosomic addition lines [J].PLoS ONE,2013,8(1):e54057.

[26] Ma X F,Fang P,Gustafson J P.Polyploidization-induced genome variation in triticale [J].Genome,2004,47(5):839-848.

[27] Feldman M,Liu B,Segal G,et al.Rapid elimination of low-copy DNA sequences in polyploidy wheat:A possible mechanism for differentiation of homoeologous chromosomes [J].Genetics,1997,147(3):1381-1387.

[28] Zhang W,Gao A L,Zhou B,et al.Screening and applying wh-eat microsatellite markers to trace individualHaynaldiavillosachromosomes [J].Acta Genetica Sinica,2006,33(3):236-243.

[29] 田茂潔,唐宗祥.利用小麥微衛(wèi)星引物建立黑麥特異標(biāo)記及其局限性 [J].西華師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2009,30(1):17-20.

Tian M J,Tang Z X.The development and limitation of rye-specific markers using wheat SSR markers [J].Journal of China West Normal University:Natural Sciences,2009,30(1):17-20.(in Chinese)

[30] Tang Z X,Fu S L,Ren Z L,et al.Variations of tandem repeat,regulatory element,and promoter regions revealed by wheat-rye amphiploids [J].Genome,2008,51(6):399-408.

Variation of 1BL chromosome arm in wheat-rye translocation line 1BL.1RS

GE Qun,LI Wen-jing,REN Tian-heng,LI Zhi,REN Zheng-long

(AgronomyCollege，SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

【Objective】 The study analyzed the variation of 1BL chromosome arm in wheat-rye translocation line 1BL.1RS to provide theoretical basis for further application of 1BL.1RS in wheat breeding.【Method】 Two wheat lines,G1 and G2,originated from the cross of wheat cultivar Mianyang 11 (MY11) and rye were identified using GISH and FISH. G1 was a 1R(1B) substitution line and G2 was a 1BL.1RS translocation line.40 markers of wheat 1B chromosome were selected to amplify the genome DNA of the parents MY11,rye,G1,G2 and common wheat Chinese spring (CS) for SSR analysis.【Result】 Among the 40 pairs,6 pairs of primers had amplified bands of 1BL in MY11,CS and G2,while no bands for G1 and rye, and 3 markers (Xgwm259,Xbarc188,and Xgwm268) exhibited different bands between the parents MY11 and translocation line G2,indicating that the variation of the 1BL chromosome arm occurred in formation of 1BL.1RS translocation.There were 13 out of 40 markers had different bands between the parents,G1 and G2,suggesting the variation of microsatellites progeny of wheat-rye hybrid.Marker Xbarc8 amplified the 1RS specific bands,and the band was stable,so it can be used as molecular marker to identify the 1RS chromosome.【Conclusion】 The variation of 1BL chromosome arm in wheat-rye translocation line 1BL.1RS was confirmed.Xbarc8 can be used as molecular marker to identify the 1RS chromosome.

wheat;rye;1BL.1RS translocation line;1R(1B) substitution line;microsatellite

2014-01-06

國家自然科學(xué)基金項目(31271722)

葛 群(1989-)，男，安徽宿州人，在讀碩士，主要從事植物分子細胞遺傳學(xué)研究。E-mail:gejiaoyu@163.com

任正隆(1949-)，男，四川成都人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物分子細胞遺傳學(xué)研究。 E-mail:renzllab@sicau.edu.cn

時間:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.025

S512.1；S330

A

1671-9387(2015)06-0073-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.025.html