探索顱內(nèi)出血細(xì)胞及分子學(xué)發(fā)病機(jī)理

康 婕，李小剛

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

顱內(nèi)出血(intracranial hemorrhage，ICH)是一種血液滲入腦組織，形成血腫，導(dǎo)致病理性水腫和腦組織損傷的急性卒中，ICH約占卒中的15%，現(xiàn)在尚無(wú)令人滿意的治療方法。ICH后持續(xù)的功能失常，使患者死亡率高，預(yù)后差。此外，ICH后出現(xiàn)腦梗死后出血轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步加重腦損傷和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。ICH的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型主要以注入膠原酶或自體血到腦實(shí)質(zhì)為基礎(chǔ)，以助于了解ICH復(fù)雜的發(fā)病機(jī)理?，F(xiàn)就ICH發(fā)病的細(xì)胞及分子機(jī)理、研究中存在的問(wèn)題做一綜述。

1 ICH發(fā)病的分子學(xué)機(jī)理

ICH后血腫形成，導(dǎo)致腦組織損傷。凝血酶、血紅蛋白A及其降解產(chǎn)物對(duì)腦細(xì)胞產(chǎn)生生物作用和毒性作用，它們是ICH發(fā)病的重要因素。這些反應(yīng)主要是由血液外滲造成的，然后引發(fā)腦實(shí)質(zhì)的次級(jí)反應(yīng)，比如附加蛋白酶的補(bǔ)充、炎性反應(yīng)和固有的細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)。

1.1 凝血酶及其受體的作用 凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，在凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用。凝血酶參與大腦內(nèi)多種生理作用和病理過(guò)程。ICH后，血液在凝固過(guò)程中產(chǎn)生的大量凝血酶具有細(xì)胞毒性作用，是出血后一系列病理生理變化而致繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵物質(zhì)［1］。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠紋狀體注射全血誘發(fā)的水腫，能被凝血酶抑制劑水蛭素抑制。其機(jī)理包括:(1)抑制凝血酶誘導(dǎo)的水通道蛋白(aquaporin，AQP)中AQP－4和AQP－9的表達(dá);(2)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶－9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)表達(dá)，減輕血 －腦屏障(blood brain barrier，BBB)破壞，降低血管通透性;(3)抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕其引起的腦組織損害［2］。ICH相關(guān)性水腫是BBB破壞和腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡導(dǎo)致的，而它們可能由凝血酶誘發(fā)。

凝血酶受體是一種蛋白酶激活受體(protease activated receptors，PAR)，ICH 后 PAR －1在凝血酶介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中起主要作用。ICH后，凝血酶會(huì)持續(xù)性產(chǎn)生，PAR－1的表達(dá)高峰與細(xì)胞凋亡和腦水腫的高峰一致，均在ICH 72 h左右，提示PAR－1參與了ICH后腦損傷的全過(guò)程［3］。PAR－1活化后激活細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路，如激活RhoA、蛋白激酶C、絲裂原激活蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)，激活核內(nèi)蛋白合成酶的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)和釋放，加重腦水腫和繼發(fā)性腦損傷［4－5］。

大腦皮質(zhì)和紋狀體之間損傷機(jī)理存在明顯差別。例如，胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signalregulated kinases，ERK)、p38 和 JNK，是 MAPK 家族的3種成員，它們都參與凝血酶誘導(dǎo)的紋狀體損傷，而在凝血酶誘導(dǎo)腦皮質(zhì)損傷過(guò)程中，只有ERK參與。此外，來(lái)自于切片培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的損耗，能減輕凝血酶誘導(dǎo)紋狀體組織損傷，卻不能對(duì)皮質(zhì)細(xì)胞起到這一作用，說(shuō)明小膠質(zhì)細(xì)胞只參與紋狀體組織損傷這個(gè)過(guò)程［6］。另一方面，血纖維蛋白溶酶原被發(fā)現(xiàn)能與凝血酶共同作用誘導(dǎo)皮質(zhì)損傷，而在凝血酶誘導(dǎo)紋狀體損傷中未發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象［7］。

凝血酶介導(dǎo)的細(xì)胞損傷同樣能被活化的MMP－9介導(dǎo)。同時(shí)作用的MMP－9能加劇原始培養(yǎng)中神經(jīng)細(xì)胞的凝血酶的細(xì)胞毒性，MMP抑制劑能部分性減弱凝血酶的細(xì)胞毒性。另外，MMP－9編碼基因缺失和凝血酶抑制劑水蛭素的應(yīng)用，兩者協(xié)同作用，能減弱自體血注入誘導(dǎo)的腦損傷。

1.2 基質(zhì)金屬蛋白酶的作用 MMP在細(xì)胞表面調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞。MMP未活化時(shí)主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，參與蛋白質(zhì)的裂解［8］，甚至能進(jìn)入細(xì)胞核，影響基因轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)［9］，參與組織結(jié)構(gòu)的重塑。病理?xiàng)l件下，MMP活化后可降解細(xì)胞外基質(zhì)，造成組織損傷。ICH后，MMP家族的不同成員聚集并參與這一發(fā)病過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP抑制劑BB－1101能在誘發(fā)ICH 6 h后減輕腦水腫。在ICH后，MMP－9和MMP－3的表達(dá)隨之增加［10］。MMP－9的升高與腦水腫范圍有關(guān)，而MMP－3與高死亡率相關(guān)［10］。使用缺失MMP－9大鼠的實(shí)驗(yàn)證明MMP－9參與了注射自體血后水腫的形成。此外，與野生型大鼠相比，缺失MMP－9大鼠表現(xiàn)更低水平的神經(jīng)變性，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞反應(yīng)。膠原酶注入模型中發(fā)現(xiàn)，MMP－9主要表達(dá)在神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞，在誘導(dǎo)ICH后最初2 h，給予MMP抑制劑GM6001，能減輕中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、氧化應(yīng)激、腦水腫、神經(jīng)變性和神經(jīng)功能缺損［11］。有證據(jù)表明，MMP－12在大鼠和小鼠膠原酶注入模型中顯著表達(dá)，MMP－12缺失小鼠在ICH后表現(xiàn)出更好的功能恢復(fù)，在水腫區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞反應(yīng)水平更低［12］，MMP－12也許在ICH的發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用。

然而，不同研究卻得到相反結(jié)論。例如，一個(gè)關(guān)于MMP－9缺失小鼠的研究表明，膠原酶注入突變小鼠的紋狀體導(dǎo)致出血增加，死亡率增高，神經(jīng)功能缺失加重。這些變化也許可以歸咎于ICH后MMP－2和MMP－3反應(yīng)性增加，以及MMP－9缺失小鼠大腦中膠原水平下降［13］。另外，在膠原酶注入前30min，將廣譜性MMP抑制劑BB－94通過(guò)全身性用藥，會(huì)使出血量和DNA斷裂的細(xì)胞數(shù)增加。

1.3 亞鐵血紅素和鐵的作用 血紅蛋白和它的降解產(chǎn)物，也參與ICH的發(fā)病過(guò)程。ICH發(fā)生后，大量紅細(xì)胞滲入腦實(shí)質(zhì)，但溶血反應(yīng)不會(huì)立即發(fā)生，而是在出血后數(shù)天甚至數(shù)周后發(fā)生。紅細(xì)胞溶解釋放產(chǎn)生血紅蛋白，血紅蛋白釋放亞鐵血紅素，然后亞鐵血紅素和血紅蛋白被類(lèi)似神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞替代。

亞鐵血紅素能被血紅素氧化酶(HO)降解成膽綠素、鐵和一氧化碳(CO)，亞鐵血紅素或它的降解產(chǎn)物促進(jìn)腦水腫的形成。HO的主要亞型是HO－1和HO－2。在注射膠原酶或自體血誘導(dǎo)ICH后，HO－1被誘導(dǎo)顯著表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞［14］。切除HO－1基因能減輕ICH相關(guān)性損傷程度、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化和氧活性損傷［15］。

鐵由亞鐵血紅素降解產(chǎn)生，通過(guò)加速氧化應(yīng)激反應(yīng)在ICH發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用。研究顯示，高血清鐵蛋白水平與ICH患者預(yù)后不良有關(guān)，說(shuō)明鐵參與ICH引起的腦組織損傷［16］。非蛋白結(jié)合鐵能通過(guò)介導(dǎo)生成大量自由基直接破壞或通過(guò)NO、MMP、炎性細(xì)胞因子等間接破壞 BBB，從而導(dǎo)致血管源性腦水腫［17］。另外，產(chǎn)生的大量自由基通過(guò)破壞細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)體、誘發(fā)興奮性氨基酸過(guò)量生成、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、酸中毒等機(jī)理導(dǎo)致細(xì)胞毒性腦水腫［18］。研究還提示鐵螯合劑－去鐵胺能減輕組織損傷和神經(jīng)功能缺損。然而，去鐵胺的作用功效取決于ICH模型的類(lèi)型。提出去鐵胺有效作用的報(bào)道都以自體血注入模型為基礎(chǔ)，去鐵胺并不能改善膠原酶注入誘導(dǎo)型ICH模型大鼠的預(yù)后。

1.4 促炎性細(xì)胞因子和其他 ICH發(fā)病機(jī)理中包括多種炎性反應(yīng)，如小膠質(zhì)細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、氧化應(yīng)激反應(yīng)增多和促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)物。注射自體血或凝血酶到紋狀體以及膠原酶誘導(dǎo)型ICH時(shí)，腫瘤壞死因子α(TNF－α)表達(dá)水平均升高。ICH導(dǎo)致急性占位性損傷，激發(fā)免疫系統(tǒng)表達(dá)TNF－α增加，促進(jìn)中性粒細(xì)胞向病灶區(qū)聚集，誘導(dǎo)白細(xì)胞、受損組織細(xì)胞釋放更多的細(xì)胞因子，促使白細(xì)胞自血管內(nèi)向缺血區(qū)腦組織遷移，加重腦組織損傷。

ICAM－1是白細(xì)胞表面白細(xì)胞功能相關(guān)抗原－1(lymphocyte function－associated antigen－1，LFA －1)的配體，參與白細(xì)胞黏附和活化，在免疫炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要介導(dǎo)作用［19］。ICAM－1和LFA－1結(jié)合可發(fā)揮多種生物學(xué)作用，參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，參與中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附、白細(xì)胞穿出血管壁。正常情況下，ICAM－1在血管內(nèi)皮細(xì)胞低水平表達(dá)，當(dāng)組織缺血受損或炎癥反應(yīng)時(shí)表達(dá)增強(qiáng)，產(chǎn)生多種生理和病理反應(yīng)［20］。

IL－6對(duì)單核巨噬細(xì)胞有趨化作用，引起腦血腫周?chē)毖獏^(qū)單核巨噬細(xì)胞的增多。浸入的白細(xì)胞激活蛋白酶引起自由基誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。IL－6通過(guò)使興奮性氨基酸釋放增多并作用于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)NO合成酶的表達(dá)，使NO合成增多，刺激花生四烯酸的代謝，使自由基釋放增加，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密聯(lián)接，使血管壁通透性增加而導(dǎo)致腦水腫形成［21］。但同時(shí)，IL－6能下調(diào)IL－1和TNF－α合成，發(fā)揮抗炎作用，能潛在起著避免炎癥反應(yīng)的過(guò)度破壞作用。因此，過(guò)高的IL－6對(duì)腦組織具有毒性作用還是具有保護(hù)作用目前尚存爭(zhēng)議［22－23］。

2 相關(guān)治療藥物研究

目前研究的ICH治療藥物，大多具有抗氧化作用、抗炎性、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，其中部分已被用于其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。這些藥物雖然在動(dòng)物模型上被證明有效，但在ICH臨床治療上的有效性和安全性尚不清楚。此外，干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞也被用于ICH后神經(jīng)功能缺損的治療。干細(xì)胞通過(guò)抗炎能力表現(xiàn)出對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)有利的免疫調(diào)節(jié)功能，但神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)揮著既可能有益又可能有害的作用。如何促進(jìn)炎癥在干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生中的有益效應(yīng)并減少或抑制其不良效應(yīng)，采取適當(dāng)措施來(lái)指導(dǎo)和誘導(dǎo)炎癥向需要的方向發(fā)展，仍然需要得到解決。

3 展 望

ICH發(fā)病的機(jī)理尚未完全研究透徹。在ICH模型和患者中，數(shù)百種基因表達(dá)水平上調(diào)或者下調(diào)，參與炎性反應(yīng)、新陳代謝、神經(jīng)元信號(hào)傳遞。研究清楚這些基因的產(chǎn)物在ICH發(fā)病機(jī)理中的作用，能為ICH找到治療方案提供幫助。

從實(shí)驗(yàn)研究上看，能改善ICH病理學(xué)和神經(jīng)病學(xué)預(yù)后的藥物越來(lái)越多。但是，這些藥物在ICH患者治療中是否有效仍屬未知。在ICH發(fā)生之后，自體修復(fù)過(guò)程會(huì)啟動(dòng)，取代損傷過(guò)程，藥物治療是否會(huì)對(duì)此過(guò)程產(chǎn)生影響也不得而知。例如，蛋白激酶Src的抑制作用能改善自體血注射后大鼠的急性期預(yù)后情況，如神經(jīng)功能障礙和行為異常。同時(shí)，ICH模型中Src持續(xù)的抑制作用卻會(huì)影響神經(jīng)及血管的修復(fù)過(guò)程，妨礙BBB形成，這也許會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)期預(yù)后不良。

ICH后的神經(jīng)學(xué)癥狀的嚴(yán)重程度與白質(zhì)損傷范圍緊密相關(guān)，從臨床治療的角度上來(lái)說(shuō)，ICH治療中最重要的問(wèn)題是降低死亡率和減輕神經(jīng)功能缺損，但目前大部分研究主要關(guān)心的是神經(jīng)元的缺失，對(duì)白質(zhì)損傷缺乏關(guān)注。目前常用的ICH試驗(yàn)動(dòng)物模型為紋狀體自體血注射和膠原酶注射。前者不是自發(fā)性和連續(xù)性出血，這與人類(lèi)腦出血患者有所區(qū)別。后者會(huì)加重膠原引起的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)毒性。這兩種方法結(jié)構(gòu)損傷部位和程度、神經(jīng)損害評(píng)估方法不同，預(yù)后特點(diǎn)也不同，都無(wú)法完全模擬人類(lèi)ICH的真實(shí)情況。所以，如何了解不同模型的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，最大程度上接近人類(lèi)ICH情況，將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化為臨床治療，至關(guān)重要。ICH動(dòng)物模型研究，需要一些便于推測(cè)到臨床表現(xiàn)的精細(xì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

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