補(bǔ)體C5基因多態(tài)性與維吾爾族飼鴿者肺易患性的關(guān)系研究

彭 玲，鄔 超，楊曉紅

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補(bǔ)體C5基因多態(tài)性與維吾爾族飼鴿者肺易患性的關(guān)系研究

彭 玲，鄔 超，楊曉紅

目的 探討補(bǔ)體C5基因多態(tài)性與維吾爾族飼鴿者肺(PBL)易患性的關(guān)系。方法 選取2012年1月—2013年12月在喀什、和田地區(qū)飼養(yǎng)鴿子年限≥1年并在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸科病房和門診確診的維吾爾族PBL患者為病例組(n=32)，選擇飼養(yǎng)鴿子年限≥1年的維吾爾族未患PBL者為陰性對(duì)照組(n=30)，選擇同期未飼養(yǎng)鴿子且本院體檢健康的維吾爾族人群為正常對(duì)照組(n=30)。抽取受試者外周血抗凝，提取白細(xì)胞DNA，采用MassARRAY Assay Design實(shí)時(shí)PCR 法進(jìn)行C5基因14個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)檢測(cè)，對(duì)存在等位基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行組間比較。結(jié)果 C5基因rs17611、rs17612、rs17216529存在基因多態(tài)性，其中rs17611、rs17216529位點(diǎn)存在GG、AA、GA 3種基因型，rs17612位點(diǎn)存在CC、AA、CA 3種基因型。3組C5基因rs17611、rs17216529、rs17612基因型及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 補(bǔ)體C5 基因多態(tài)性可能不影響維吾爾族PBL的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

養(yǎng)鳥者肺；肺泡炎,外源性變應(yīng)性；補(bǔ)體C5；多態(tài)性,單核苷酸；疾病遺傳易感性；維吾爾族

彭玲，鄔超，楊曉紅.補(bǔ)體C5基因多態(tài)性與維吾爾族飼鴿者肺易患性的關(guān)系研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(14)：1667-1671.[www.chinagp.net]

Peng L,Wu C,Yang XH.Relationship between C5 gene polymorphism and susceptibility to pigeon breeder′s lung in Uygur people[J].Chinese General Practice，2015，18(14)：1667-1671.

過敏性肺炎(HP)又名外源性過敏性肺泡炎，是一組易感宿主反復(fù)吸入環(huán)境中的細(xì)小懸浮有機(jī)物抗原誘發(fā)的以細(xì)胞免疫和體液免疫為主要反應(yīng)介導(dǎo)的肉芽腫性炎性肺疾病[1]。飼鴿者肺(PBL)為HP的常見類型，是易感個(gè)體反復(fù)暴露于抗原后促發(fā)免疫反應(yīng)導(dǎo)致的炎性肺泡炎。據(jù)報(bào)道，暴露人群中只有0.5%～7.5%會(huì)發(fā)展成為PBL[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，PBL的發(fā)病與Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的失衡密切相關(guān)[3]，敏感個(gè)體暴露于抗原后，Th1細(xì)胞因子分泌的促炎因子與Th2細(xì)胞因子分泌的抗炎因子的分布可能影響PBL的易患性[4]。補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體重要的免疫防御系統(tǒng)，C5是補(bǔ)體系統(tǒng)中關(guān)鍵片段，是Th1/Th2失衡中的重要調(diào)節(jié)分子，其水平變化可能影響疾病的發(fā)生發(fā)展。C5基因多態(tài)性被證實(shí)與多種Th1/Th2失衡性疾病的易患性相關(guān)[5-7]。PBL是一種典型的Th1/Th2失衡性疾病，晚期發(fā)展成為不可逆性的肺纖維化，C5基因多態(tài)性與PBL發(fā)病的易患性尚未見報(bào)道。本研究探討了C5基因多態(tài)性與維吾爾族PBL發(fā)病的關(guān)系，以期從分子水平闡釋PBL的發(fā)病機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.2 選擇位點(diǎn) C5基因位于9號(hào)染色體上，本研究對(duì)C5基因的14個(gè)單核苷酸的多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)(rs17611、rs17612、rs17216529、rs2230212、rs201100938、rs2230215、rs144332635、rs41311883、rs141560628、rs118181017、rs41311887、rs35791896、rs148353209、rs188716286)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 試劑 人全血基因組DNA試劑盒購自德國Greiner公司；多重PCR及延伸引物由Sequenom公司提供的MassARRAY Assay Design 軟件設(shè)計(jì)，北京博奧生物有限合成。

1.3.2 DNA提取和保存 受試者均在清晨空腹抽取2份靜脈血各4 ml，以3.2%枸櫞酸鈉抗凝。按照全血基因組DNA試劑盒說明書快速提取DNA(見圖1)，-80 ℃深低溫保存。

圖1 全血基因組DNA提取圖

1.3.3 SNP檢測(cè) 采用SequenomMassARRAY Assay Design軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),多重PCR技術(shù)對(duì)所選位點(diǎn)的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增(反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s,56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)45次；72 ℃ 3 min；4 ℃保持)。將PCR反應(yīng)板放置于PCR儀上，啟動(dòng)PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增產(chǎn)物保存在-20 ℃?zhèn)溆?。將上述擴(kuò)增產(chǎn)物中加入蝦堿性磷酸酶(SAP)純化并加入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，通過單堿基延伸引物(見表1)序列實(shí)現(xiàn)SNP位點(diǎn)的擴(kuò)增,操作步驟按Sequenom公司的操作指南進(jìn)行。延伸完畢后，產(chǎn)物通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜基因分型技術(shù)進(jìn)行SNP分型。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) C5基因rs17611、rs17612、rs17216529共3個(gè)位點(diǎn)存在基因多態(tài)性。3組間C5基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2=1.428、0.001、4.861，P>0.05)，表明研究群體具有代表性。

2.2 基因分型的檢測(cè) rs17611、rs17216529位點(diǎn)在新疆維吾爾族人群中存在GG、GA、AA 3種基因型，rs17612位點(diǎn)存在CC、CA、AA 3種基因型。

表1 PCR引物及單堿基延伸引物序列

2.3 C5基因rs17611位點(diǎn)基因型及等位基因分布 各組C5基因rs17611位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

表2 各組C5基因rs17611位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

Table 2 Comparison of genetypes and allele frequency of C5 rs17611 among the 3 groups

組別例數(shù)基因型GG AG AA等位基因G A正常對(duì)照組301010103030陰性對(duì)照組3091473228病例組3251892836χ2值4.4451.180P值0.3490.554

2.4 C5基因rs17612位點(diǎn)基因型及等位基因分布 各組C5基因rs17612位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表3)。

2.5 C5基因rs17216529位點(diǎn)基因型及等位基因分布 各組C5基因rs17216529位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表4)。

表3 各組C5基因rs17612位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

Table 3 Comparison of genetypes and allele frequency of C5 rs17612 among the 3 groups

組別例數(shù)基因型GG AG AA等位基因G A正常對(duì)照組300228258陰性對(duì)照組300327357病例組320032064χ2值3.1443.056P值0.2080.217

表4 各組C5基因rs17216529位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

Table 4 Comparison of genetypes and allele frequency of C5 rs17216529 among the 3 groups

組別例數(shù)基因型GG AG AA等位基因G A正常對(duì)照組30201005010陰性對(duì)照組3021 9 051 9 病例組32221005410χ2值0.0790.064P值0.9610.968

3 討論

機(jī)體Th1/Th2失衡參與多種變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫性系統(tǒng)疾病和移植排斥反應(yīng)等疾病的發(fā)生。PBL是一種復(fù)雜的多因子疾病，Th1/Th2失衡所分泌的相關(guān)免疫學(xué)因子促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展，但只有少部分人暴露抗原后會(huì)發(fā)展為PBL。Th1/Th2失衡相關(guān)基因多態(tài)性與PBL關(guān)系的相關(guān)研究顯示，主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ(MHC-Ⅱ)、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)、抗原提呈蛋白-1(TAP-1)、金屬蛋白酶組織抑制劑-3(TIMP-3)等基因SNP均被證實(shí)與PBL的遺傳易患性相關(guān)[8-10]。

C5是補(bǔ)體系統(tǒng)的重要組成部分，其基因編碼的蛋白在Th1/Th2失衡性疾病的炎性免疫應(yīng)答中發(fā)揮了極其關(guān)鍵的作用。在PBL的發(fā)病機(jī)制中，鴿子糞便、羽毛等外源性抗原可直接激活補(bǔ)體旁路途徑和巨噬細(xì)胞，引發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性損害，從而造成肺組織炎癥。早期研究發(fā)現(xiàn)，在農(nóng)民肺的動(dòng)物模型及患者的活檢肺組織中均有補(bǔ)體沉著[1l]。C5基因是與炎癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)的免疫相關(guān)基因[12]，該基因的突變導(dǎo)致C5蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性降低，加速其降解，患者表現(xiàn)為嚴(yán)重復(fù)發(fā)性感染傾向。如前所述，C5基因多態(tài)性已明確證明與多種Th1/Th2失衡性疾病關(guān)聯(lián)[13],提示在Th1/Th2失衡性疾病中可能存在共同基因或者共同的細(xì)胞途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，C5基因rs17611、rs17612、rs17216529共3個(gè)位點(diǎn)存在變異。rs17611位點(diǎn)參與C5蛋白質(zhì)第802號(hào)氨基酸序列的編碼。多數(shù)情況下該位點(diǎn)的2個(gè)等位基因堿基均是G(即GG型)，轉(zhuǎn)錄翻譯為纈氨酸；當(dāng)2個(gè)堿基都轉(zhuǎn)換為A時(shí)(即AA型)，轉(zhuǎn)錄翻譯該位置時(shí)全部為異亮氨酸；當(dāng)其中一個(gè)堿基轉(zhuǎn)換為A時(shí)(即AG型)，轉(zhuǎn)錄翻譯后該位置半數(shù)為異亮氨酸。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的突變?cè)黾恿艘倚透窝撞《靖腥菊甙l(fā)生肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)[14],可能與C5的結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)水平有關(guān)。也有報(bào)道表明rs17611位點(diǎn)突變?cè)黾游⒀芗膊“l(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，rs17611等位基因A和G及各基因型頻率3組間無明顯差異，提示其與PBL的易患性不相關(guān)，不是PBL的風(fēng)險(xiǎn)因素。而關(guān)于rs17612、rs17216529在其他疾病中的研究報(bào)道較少，本研究發(fā)現(xiàn)rs17612在此次研究中存在等位基因A和C以及AA、CA兩種基因型，rs17216529存在等位基因A和G以及GG、GA兩種基因型，結(jié)果表明這兩個(gè)位點(diǎn)均未增加PBL的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。這可能與C5基因高度保守有一定關(guān)系，考慮到本研究樣本量較小，因此有必要進(jìn)一步進(jìn)行大樣本的重復(fù)研究來驗(yàn)證。

綜上所述，本研究納入的樣本量較少，在一定程度上可能影響研究結(jié)果，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，在不同民族間進(jìn)行重復(fù)研究來證實(shí)和闡明PBL的遺傳發(fā)病機(jī)制。從遺傳學(xué)的角度講，尋找與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的基因，一般先從SNP數(shù)據(jù)庫入手，選擇等位頻率比較高的位點(diǎn)進(jìn)行SNP分型。該方法雖簡單易行，但是存在一定的盲目性，甚至可能得到陰性結(jié)果，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性。因此，有效地發(fā)掘與疾病關(guān)聯(lián)SNP仍是今后研究面臨的一大挑戰(zhàn)。

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(本文編輯：吳立波)

Relationship Between C5 Gene Polymorphism and Susceptibility to Pigeon Breeder′s Lung in Uygur People

PENGLing,WUChao,YANGXiao-hong.

DepartmentofClinicalResearch，ShiheziUniversity,Shihezi832002,China

Objective To evaluate the association between C5 gene polymorphism and susceptibility to pigeon breeder′s lung (PBL) in Uygur people.Methods We enrolled 32 Uygur patients who had bred pigeons for more than one year，came from KashiRegon and Hetian，and were diagnosed with PBL in the outpatient clinic and the Department of Pneumology，the People′s Hospital of Xinjiang from January 2012 to December 2013 as the case group.30 Uygur who had bred pigeons for more than one year and weren′t diagnosed with PBL,were enrolled as negative control group.Another 30 healthy Uygur people who hadn′t bred pigeons and received physical examination in the hospital in the same period were enrolled as the normal control group.Peripheral blood was sampled from the subjects,and leucocyte DNA was extracted from the samples.We conducted tests on 14 single nucleotide polymorphism (SNP) loci in C5 genes by real-time polymerase chain reaction (PCR) method of MassARRAY Assay Design.The three groups were compared in the SNP loci with allelic genes.Results Gene polymorphism was found in the loci of rs17611,rs17612 and rs17216529.Genotypes of GG,AA and GA were found in rs17611 and rs17216529;genotypes of CC,AA and CA were found in rs17612.No significant differences were found in rs17611,rs17216529 and rs17612 in genotype and allele frequency among three groups(P>0.05).Conclusion C5 gene polymorphisms may not have on influence on the susceptibility to PBL in Uygur people.

Bird fancier′s lung；Alveolitis,extrinsic allergic；Complement C5；Polymorphism,single nucleotide；Genetic predisposition to disease；Uygur nationality

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260003)

832002新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床系(彭玲)；新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(鄔超，楊曉紅)

楊曉紅，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；E-mail：yxh6176@126.com

R 563.19

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.14.016

2014-11-10；

2015-03-03)