腫瘤壞死因子α 308和腫瘤壞死因子α 238位點基因多態(tài)性與藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病關(guān)系研究

李得春

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·論著·

腫瘤壞死因子α 308和腫瘤壞死因子α 238位點基因多態(tài)性與藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病關(guān)系研究

李得春

目的 探討腫瘤壞死因子(TNF)α 308、TNF-α 238位點基因多態(tài)性與藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病的關(guān)系。方法 采用單純隨機抽樣法選取2012年10月—2013年10月在青海大學附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨病科住院治療，根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、X線檢查、細菌學檢查及病理組織學檢查等確診為骨關(guān)節(jié)結(jié)核的青海地區(qū)藏族患者65例為試驗組，選取同時段本院青海地區(qū)藏族體檢健康者50例為對照組。采集受試者清晨空腹外周靜脈血3 ml，提取其白細胞基因組DNA；采用等位基因特異引物聚合酶鏈反應(AS-PCR)分析TNF-α 308、TNF-α 238位點基因多態(tài)性。結(jié)果 兩組TNF-α 308位點等位基因、基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。試驗組TNF-α 308 G/A、A/A基因型頻率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.85，P<0.05)。兩組TNF-α 238位點等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.33，P>0.05)；TNF-α 238位點基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中TNF-α 308 A存在過度表達，且TNF-α 308位點基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病可能有關(guān)系；TNF-α 238位點基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病可能無關(guān)系。

結(jié)核，骨關(guān)節(jié)；腫瘤壞死因子α ；多態(tài)性，單核苷酸；藏族；聚合酶鏈反應

李得春.腫瘤壞死因子α 308和腫瘤壞死因子α 238位點基因多態(tài)性與藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病關(guān)系研究[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(6)：465-648.[www.chinagp.net]

Li DC.Relationship between tumor necrosis factor-α 308 and 238 polymorphisms and osteoarticular tuberculosis in tibetans[J].Chinese General Practice，2015，18(6)：465-648.

我國是全球22個結(jié)核病高負擔國家之一，患者人數(shù)居世界第二位[1]。骨關(guān)節(jié)結(jié)核是主要的肺外結(jié)核之一，當前全國估計有骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者30萬例，其發(fā)病原因與生活貧困有直接關(guān)系[2]。青海省地處偏遠地區(qū)，經(jīng)濟交通不發(fā)達，骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病率較高，尤其是藏族人群，但目前原因尚不明確[3]。骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病是由結(jié)核桿菌經(jīng)血行、淋巴管或由淋巴結(jié)核病灶直接蔓延到局部形成播散灶[4]。病情嚴重者，若診療不當可造成脊柱及肢體畸形、關(guān)節(jié)活動受限甚至截癱，而目前非典型患者的早期診斷和鑒別診斷較困難[5-6]。

腫瘤壞死因子(TNF)α是一種多向性的細胞因子，主要由活化的巨噬細胞產(chǎn)生，參與巨噬細胞抵抗結(jié)核桿菌的感染和結(jié)核性肉芽腫的形成，還能誘導巨噬細胞凋亡和其他抗結(jié)核細胞因子的釋放[7]。TNF-α的產(chǎn)生除了與機體本身免疫系統(tǒng)的活化水平等有關(guān)外，宿主自身因素即TNF-α啟動子區(qū)基因多態(tài)性也可能通過影響其轉(zhuǎn)錄活性而使其表達水平不同[6]。TNF-α 308 G/A位點基因多態(tài)性由Pantelidis等[8]首先發(fā)現(xiàn)。該位點位于TNF-α基因編碼的啟動子區(qū)，為一功能性位點。TNF-α基因多態(tài)性通過影響基因轉(zhuǎn)錄水平而改變TNF-α的表達量，進而影響與TNF-α相關(guān)的病理生理過程。本研究通過探討TNF-α 308、238位點基因多態(tài)性對青海地區(qū)藏族人群骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展和治療的作用，以篩選和保護特定環(huán)境中的易患人群，并為采取切實有效的干預措施提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準 納入標準：(1)連續(xù)3代以上生活在青海境內(nèi)，且均為藏族；(2)各研究對象之間無任何血緣關(guān)系。排除合并肝腎功能異常、HIV、自身免疫性疾病、糖尿病等和長期應用激素者。

1.2 臨床資料 采用單純隨機抽樣法選取2012年10月—2013年10月在青海大學附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨病科住院治療，根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、X線檢查、細菌學檢查及病理組織學檢查等確診為骨關(guān)節(jié)結(jié)核的青海地區(qū)藏族患者65例為試驗組，其中男33例，女32例；平均年齡(39.2±13.6)歲。選取同時段本院青海地區(qū)藏族健康體檢者50例為對照組，其中男27例，女23例；平均年齡(39.9±7.4)歲。兩組性別、年齡具有均衡性；均簽署知情同意書。

1.3 儀器與試劑 96孔梯度PCR儀(德國EPPENDOR公司)，臺式離心機5810 R(德國Eppendorf公司)，DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，凝膠成像分析系統(tǒng)(UVP800，美國)；血液基因組提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國)，2×PCR反應預混液體(2×PCR MasterMix，北京天根生物技術(shù)有限公司)，DNA分子量(北京天根生物技術(shù)有限公司)，高純度瓊脂糖(西班牙)。

本文要點：

(1)探討青海地區(qū)藏族人群TNF-α 308、238位點基因多態(tài)性與骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病易患性之間的關(guān)系，為該病的預防、早期診斷和個體化治療提供新的分子靶向。

(2)TNF-α 308基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病可能有關(guān)系，而TNF-α 238基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病可能無關(guān)系。

1.4 研究方法

1.4.1 提取白細胞基因組DNA 采集受試者清晨空腹外周靜脈血3 ml，加入乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，淋巴細胞基因組DNA嚴格按照所購血液基因組提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國)說明書操作提取，采用梯度離心法(12 000 r/min 室溫離心15 min，離心半徑為25 cm)提取基因組DNA，并于-20 °C保存。

1.4.2 分析TNF-α 308、TNF-α 238位點基因多態(tài)性 從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站獲取人類TNF-α基因全序列，利用Dnaman 6.0軟件設(shè)計引物，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成；根據(jù)PCR試劑盒構(gòu)成反應體系，并完成擴增。TNF-α 308 G/A 擴增引物序列為上流引物：5′-AATAGGTTTTGAGGGGCAAGG-3′，下游引物：5′-AGGGAGCGTCTGCTGGCT G-3′。TNF-α 238 G/A擴增所用引物參照文獻[9]，引物序列為上游引物：5′-CCGTGCTTGGTGCTTTGGACTA-3′，下游引物：5′-AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3′。在96孔梯度PCR儀中進行等位基因特異引物聚合酶鏈反應(AS-PCR)，分析TNF-α 308、TNF-α 238位點基因多態(tài)性。PCR反應體系總體積為25 μl，包括2×PCR MasterMix 12.5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，模板DNA 2 μl，無RNA/DNA酶水8.5 μl。反應條件：95 °C預變性2 min，94 °C變性1 min，63.3 °C退火1 min，72 °C延伸1 min，循環(huán)30次，最后經(jīng)72 °C延伸5 min，4 °C終止反應，產(chǎn)物取出后于-20 °C保存。采用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，確定等位基因及基因型：取PCR擴增產(chǎn)物5 μl經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)判斷結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Hard-Weinberg遺傳平衡分析檢驗樣本是否具有群體代表性。采用直接計數(shù)法計算各組等位基因和基因型頻率。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人白細胞基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定結(jié)果 可見單一的明亮條帶，表明所提取的DNA無降解(見圖1)。

圖1 人白細胞基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定結(jié)果

Figure 1 Results of agarose gel electrophoresis separation of leukocyte genomic DNA

2.2 TNF-α 308、TNF-α 238位點等位基因與基因型的鑒定

2.2.1 TNF-α 308位點等位基因與基因型的鑒定 PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)135 bp條帶為GG基因型(野生型純合子)，出現(xiàn)360 bp條帶為AA基因型(野生型純合子)，135 bp、360 bp條帶同時出現(xiàn)為GA基因型(突變型雜合子，見圖 2)。

注：M=Marker

圖2 TNF-α 308位點等位基因與基因型的鑒定

Figure 2 Identification of promoter allele and genotype of TNF-α 308

2.2.2 TNF-α 238位點等位基因與基因型的鑒定 PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)206 bp條帶為GG基因型(野生型純合子)，出現(xiàn)287 bp條帶為AA基因型(野生型純合子)，206 bp、287 bp條帶同時出現(xiàn)為GA基因型(突變型雜合子，見圖3)。

注：M=Marker

圖3 TNF-α 238位點等位基因與基因型的鑒定

Figure 3 Identification of promoter allele and genotype of TNF-α 238

2.3 Hard-Weinberg遺傳平衡檢驗 TNF-α 308、TNF-α 238位點等位基因與基因型在兩組中分布頻率均符合遺傳平衡定律，兩組樣本來自于遺傳平衡群體，有較好的代表性(χ2=12.36，P<0.05)。

2.4 TNF-α 308、TNF-α 238位點等位基因及基因型頻率比較 兩組TNF-α 308位點等位基因、基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。試驗組TNF-α 308 G/A、A/A基因型頻率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.85，P<0.05)。兩組TNF-α 238位點等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；TNF-α 238位點基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

表1 TNF-α 308位點等位基因及基因型頻率比較〔n(%)〕

Table 1 Comparison of promoter allele and genotype frequencies of TNF-α 308

組別例數(shù)等位基因G A基因型G/G G/A A/A對照組5099(990)1(10)49(980)1(20)0試驗組65118(908)12(92)55(846)8(123)2(31)χ2值718-P值00070033?

注：-為無此項，*采用Fisher確切概率法

表2 TNF-α 238位點等位基因及基因型頻率比較〔n(%)〕

Table 2 Comparison of promoter allele and genotype frequencies of TNF-α 238

組別例數(shù)等位基因G A基因型G/G G/A A/A對照組5097(970)3(30)48(960) 1(20) 1(20)試驗組65120(923)10(77)55(846)10(154)0χ2值233-P值01270015?

注：-為無此項，*采用Fisher確切概率法

3 討論

骨關(guān)節(jié)結(jié)核是由結(jié)核桿菌通過血液或淋巴系統(tǒng)播散至骨與關(guān)節(jié)，造成血供豐富和負重大或活動較多的骨關(guān)節(jié)發(fā)生壞死[10]。研究表明，TNF-α能通過與破骨細胞前體細胞上的相應受體結(jié)合，直接或間接調(diào)節(jié)破骨細胞的分化、激活和凋亡[11-12]。王翔鋒等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當結(jié)核患者的外周血單核細胞體外培養(yǎng)加入結(jié)核桿菌相關(guān)抗原2 d后，細胞培養(yǎng)液中的TNF-α水平明顯升高。這表明TNF-α在結(jié)核桿菌感染過程中起到了重要的調(diào)控作用。TNF-α的產(chǎn)生除了與機體本身免疫系統(tǒng)的活化水平等有關(guān)外，宿主自身因素即TNF-α啟動子區(qū)基因多態(tài)性也可能通過影響其轉(zhuǎn)錄活性而使其表達水平不同。研究資料顯示，TNF-α基因多態(tài)性影響其產(chǎn)物的表達，不同的基因型可以產(chǎn)生不同的蛋白，從而影響疾病的易患性及嚴重性，但TNF-α基因多態(tài)性對骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病的作用還鮮有報道[7]。

本研究對中國青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者TNF-α 308、TNF-α 238 位點等位基因及基因型進行鑒定，并與正常藏族受試者進行比較。結(jié)果顯示，試驗組和對照組TNF-α 308位點基因型的分布頻率存在差異，A/A基因型在試驗組分布頻率為3.1%，而在對照組未發(fā)現(xiàn)該基因型，A/A、G/A基因型與G/G基因型相比，其相對危險度要高很多[14]。由于基因型為TNF-α 308 A/A的藏族人群少[15]，無法直接比較TNF-α 308 A/A藏族人群與TNF-α 308 G/A藏族人群患骨關(guān)節(jié)結(jié)核的危險性。本研究將各組TNF-α 308 A/A型與TNF-α 308 G/A型合并進行比較，結(jié)果顯示，試驗組TNF-α 308 G/A、A/A基因型頻率明顯高于對照組；試驗組TNF-α 308 A等位基因頻率也明顯高于對照組。說明青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中TNF-α 308 A存在過度表達，揭示TNF-α 308 A等位基因可能是青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核的一種遺傳易患因子，TNF-α 308位點基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病可能有一定的相關(guān)性；此外本研究顯示，試驗組和對照組青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核TNF-α 238位點等位基因頻率無差異，提示TNF-α 238位點基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病可能不存在相關(guān)性，這與林春燕等[16]的研究結(jié)果一致。

本研究并未將TNF-α 308、TNF-α 238位點基因多態(tài)性與其他民族骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病進行比較，且本研究樣本量較小，這也是以后研究的方向和需要注意的問題，研究結(jié)果仍需多中心大樣本試驗的進一步驗證。

綜上所述，青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中TNF-α 308 A存在過度表達，且TNF-α 308基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病可能相關(guān)；TNF-α 238基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病可能沒有關(guān)系。

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(本文編輯：崔麗紅)

Relationship between Tumor Necrosis Factor-α 308 and 238 Polymorphisms and Osteoarticular Tuberculosis in Tibetans

LIDe-chun.

DepartmentofJoint,QinghaiUniversityAffiliatedHospital,Xining810001,China

Objective To investigate the relationship between the polymorphisms of tumor necrosis factor (TNF) α 308 and TNF-α 238 and osteoarticular tuberculosis (OATB) in Tibetans.Methods A total of 65 patients confirmed as OATB by medical history,clinical manifestations,X-ray examination,bacteriological test and histopathological findings in Qinghai University Affiliated Hospital from October 2012 to October 2013 were selected as experiment group by simple random sampling method,while 50 healthy Tibetans from Qinghai area who had physical examination during the same period were selected as control group.3 ml peripheral venous blood of the subjects was collected on an empty stomach in the morning,and then leukocyte genomic DNA was extracted.Allele-specific polymerase chain reaction (AS-PCR) was used to analyze the promoter allele polymorphism of TNF-α 308 and TNF-α 238.Results The promoter allele and genotype frequency of TNF-α 308 between the two groups showed statistically significant differences (P<0.05).Compared with the control group,TNF-α 308 G/A and A/A genotype frequency of the experiment group showed statistically significant difference (χ2=5.85,P<0.05).The TNF-α 238 promoter allele frequency between the two groups showed no statistically significant differences (χ2=2.33,P>0.05),but the TNF-α 238 genotype frequency showed statistically significant differences (P<0.05).Conclusion Tibetans with OATB in Qinghai area have overexpression of TNF-α 308 A.The TNF-α 308 polymorphism may be related to the development of OATB among the Tibetans in Qinghai area,but TNF-α 238 polymorphism may be not related to it.

Tuberculosis,osteoarticular;Tumor necrosis factor-alpha;Polymorphism,single nucleotide;Zang nationality;Polymerase chain reaction

810001 青海省西寧市，青海大學附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨病科

R 529.22

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.06.009

2014-05-04；

2014-11-28)