肝X受體表達(dá)對(duì)糖尿病腎病大鼠的影響及機(jī)制研究

師帥帥，張毅強(qiáng)，溫文斌，張 巍，趙銀娥

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·論著·

肝X受體表達(dá)對(duì)糖尿病腎病大鼠的影響及機(jī)制研究

師帥帥，張毅強(qiáng)，溫文斌，張 巍，趙銀娥

目的 探討肝X受體(LXR)對(duì)糖尿病腎病大鼠的影響及機(jī)制。方法 選取60只Wistar大鼠，采用抽簽法隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及干預(yù)組，每組各20只。模型組及干預(yù)組大鼠通過鏈脲佐菌素(60 mg/kg)腹腔注射建立糖尿病腎病模型，干預(yù)組大鼠給予LXR激動(dòng)劑T0901317(30 mg·kg-1·d-1)。2周后，稱重，留取24 h尿，之后腹腔注射乙醚，在腹上動(dòng)脈部位進(jìn)行取血，隨后處死，留存血液樣本,測(cè)量血糖、腎功能、血脂水平。結(jié)果 12周后，3組大鼠體質(zhì)量、尿蛋白、血糖、肌酐、尿素氮、內(nèi)生肌酐清除率、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組和干預(yù)組尿蛋白、血糖、肌酐、尿素氮、三酰甘油、總膽固醇水平高于對(duì)照組，體質(zhì)量、內(nèi)生肌酐清除率、高密度脂蛋白膽固醇水平低于對(duì)照組(P<0.05)；干預(yù)組尿蛋白、血糖、肌酐、尿素氮、三酰甘油、總膽固醇水平低于模型組，體質(zhì)量、內(nèi)生肌酐清除率、高密度脂蛋白膽固醇水平高于模型組(P<0.05)。結(jié)論 LXR表達(dá)能夠明顯改善Wistar大鼠糖尿病腎病生化指標(biāo)，具有一定的指導(dǎo)意義。

糖尿病腎病；肝X受體；血糖；腎功能試驗(yàn)；脂蛋白類

師帥帥，張毅強(qiáng)，溫文斌，等.肝X受體表達(dá)對(duì)糖尿病腎病大鼠的影響及機(jī)制研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(9)：1029-1031,1036.[www.chinagp.net]

Shi SS,Zhang YQ,Wen WB,et al.Effects of liver X receptor expression on rats with diabetic nephropathy and its mechanism[J].Chinese General Practice，2015，18(9)：1029-1031,1036.

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是由于長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)引起的一種腎臟病變[1]。本病主要損傷腎臟的結(jié)構(gòu)，臨床上表現(xiàn)為腎功能減退。本病多發(fā)于病程較長(zhǎng)、血糖控制較差的糖尿病患者。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，我國(guó)糖尿病人群DN發(fā)病率從1995年的15%上升至2010年的40%，并有逐年上升趨勢(shì)[2]。隨著生物免疫技術(shù)的發(fā)展，人們更加重視疾病防治及預(yù)后，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取創(chuàng)痛降糖、改善腎功能等療法，但治療效果并不理想。研究發(fā)現(xiàn)，肝X受體(LXR)能夠改善DN[3]。本研究通過觀察LXR激動(dòng)劑T0901317誘導(dǎo)下DN大鼠血糖、腎功能、血脂等指標(biāo)的變化，來探究LXR表達(dá)對(duì)DN的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年清潔級(jí)雄性Wistar大鼠60只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)有限公司，體質(zhì)量185～225 g，鼠齡均在8個(gè)月左右。采用抽簽法隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及干預(yù)組，各20只。此實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格依據(jù)中國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)提出的 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。各組大鼠的體質(zhì)量、鼠齡、飼養(yǎng)方式具有均衡性。

1.2 主要試劑及儀器 LXR激動(dòng)劑T0901317(Code:T2320)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；血糖測(cè)量?jī)x(葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法)購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)責(zé)任有限公司；尿蛋白測(cè)定試劑盒、肌酐測(cè)定試劑盒、尿素氮測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成試劑責(zé)任有限公司；三酰甘油測(cè)定試劑盒、總膽固醇測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)責(zé)任有限公司；高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京北化康泰臨床試劑責(zé)任有限公司。

1.3 制備模型 雄性Wistar大鼠均飼養(yǎng)于干凈的代謝籠中，每日給予充足的水源以及標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)動(dòng)物飼料，室內(nèi)環(huán)境控制在12 h/12 h黑白交替,溫度控制在20～25 ℃，濕度控制在55%～60%。大鼠1周適應(yīng)后建立DN模型。將STZ(60 mg/kg)溶解在枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液內(nèi)，模型組及干預(yù)組大鼠腹腔注射。對(duì)照組大鼠以同等劑量的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液腹腔注射[4]。

1.4 方法 干預(yù)組大鼠給予LXR激動(dòng)劑T0901317(30 mg·kg-1·d-1)。12周后，大鼠稱重，留取24 h尿，之后腹腔注射乙醚，在腹上動(dòng)脈部位進(jìn)行取血，隨后處死，留存血液樣本,測(cè)量血糖、腎功能、血脂水平。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 體質(zhì)量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)12周后60只大鼠采用電子天平進(jìn)行體質(zhì)量的測(cè)量，記錄數(shù)據(jù)。

1.5.2 尿蛋白水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)12周后收集大鼠24 h尿量，采用考馬斯藍(lán)染料染色，測(cè)定吸光度，檢測(cè)尿蛋白水平。

1.5.3 血糖、腎功能的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)12周后60只大鼠尾部靜脈取血，葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測(cè)血糖水平。水浴(37 ℃) 中靜置至分層后，以3 000 r/min(離心半徑3 cm)離心 15 min，采用酶法測(cè)定肌酐、尿素氮水平。

1.5.4 內(nèi)生肌酐清除率 內(nèi)生肌酐清除率(ml·min-1·kg-1)=〔尿肌酐(mg/dl)×尿容量(ml)/肌酐(mg/dl)〕×〔1 000/體質(zhì)量(g)〕×〔1/1 440(min)〕。

1.5.5 血脂水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)12周后60只大鼠尾部靜脈取血，3 000 r/min(離心半徑3 cm)離心3 min，收集血清，采用酶法測(cè)定三酰甘油水平；采用 Trinder 反應(yīng)法測(cè)定總膽固醇水平；采用酶法測(cè)定高密度脂蛋白膽固醇水平。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠體質(zhì)量和尿蛋白水平比較 12周后，3組大鼠體質(zhì)量、尿蛋白水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組和干預(yù)組體質(zhì)量低于對(duì)照組，尿蛋白水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)組體質(zhì)量高于模型組，尿蛋白水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of body mass and level of urine protein of rats among the three groups

組別只數(shù)體質(zhì)量(g)尿蛋白(mg/d)對(duì)照組20370±9 4.23±0.52模型組20211±4* 44.83±7.58*干預(yù)組20281±5*△25.29±0.75*△F值3123.11424.38P值<0.001<0.001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

2.2 3組大鼠血糖和腎功能比較 12周后，3組大鼠血糖、肌酐、尿素氮、內(nèi)生肌酐清除率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組和干預(yù)組血糖、肌酐、尿素氮水平高于對(duì)照組，內(nèi)生肌酐清除率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)組血糖、肌酐、尿素氮水平低于模型組，內(nèi)生肌酐清除率高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

Table 2 Comparison of level of blood sugar and renal function of rats among the three groups

組別只數(shù)血糖(mmol/L)肌酐(μmol/L)尿素氮(mmol/L)內(nèi)生肌酐清除率(ml·min-1·kg-1)對(duì)照組205.78±0.3263.52±1.529.32±0.4526.48±1.32模型組2025.77±0.89*79.29±3.25*18.45±1.13*16.78±1.35*干預(yù)組2017.63±0.52*△68.27±1.78*△14.23±0.92*△20.35±1.02*△F值5204.59244.80538.62313.58P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

2.3 3組大鼠血脂水平比較 12周后，3組大鼠三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組和干預(yù)組三酰甘油、總膽固醇水平高于對(duì)照組，高密度脂蛋白膽固醇水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)組三酰甘油、總膽固醇水平低于模型組，高密度脂蛋白膽固醇水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表3 3組大鼠血脂水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3 討論

DN是糖尿病最常見慢性微血管病變并發(fā)癥之一，呈隱匿性發(fā)展，是糖尿病患者主要死亡原因，同時(shí)也是導(dǎo)致慢性腎衰竭的主要因素之一。該病逐漸出現(xiàn)持續(xù)性的尿蛋白、腎小球率過濾下降，最終導(dǎo)致腎衰竭[5-7]。其發(fā)病機(jī)制尚不明確。近年來，LXR表達(dá)備受醫(yī)學(xué)界推崇。LXR是有配體激活的核受體所表達(dá)的家族成員，其在內(nèi)源性配體或人工合成的激動(dòng)劑作用下被激活表達(dá)，對(duì)配體有較強(qiáng)的依賴性，通過調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)生理和病理過程，如糖代謝、膽固醇代謝、脂肪代謝和炎性反應(yīng)等[8-9]。筆者為此做了相關(guān)研究，主要通過用LXR激動(dòng)劑T0901317激活LXR表達(dá)來觀察其對(duì)DN大鼠血糖、腎功能、血脂等指標(biāo)的影響，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析。

本實(shí)驗(yàn)中，12周后,模型組和干預(yù)組尿蛋白、血糖、肌酐、尿素氮水平高于對(duì)照組，體質(zhì)量、內(nèi)生肌酐清除率低于對(duì)照組；干預(yù)組尿蛋白、血糖、肌酐、尿素氮水平低于模型組，體質(zhì)量、內(nèi)生肌酐清除率高于模型組，表明LXR激動(dòng)劑T0901317對(duì)大鼠的誘導(dǎo)作用可有效調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的尿蛋白、肌酐、尿素氮水平。

相關(guān)研究顯示，LXR激動(dòng)劑T0901317可以增強(qiáng)小鼠主動(dòng)脈、肝臟、小腸及體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)[10]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，12周后，模型組和干預(yù)組三酰甘油、總膽固醇水平高于對(duì)照組，高密度脂蛋白膽固醇水平低于對(duì)照組；干預(yù)組三酰甘油、總膽固醇水平低于模型組，高密度脂蛋白膽固醇水平高于模型組。表明LXR激動(dòng)劑T0901317可有效調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)的三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平。

有研究表明，LXR表達(dá)能夠通過抑制肝臟組織中糖異生酶的表達(dá)從而抑制糖異生過程[11]。除此之外，LXR表達(dá)還能通過抑制糖皮質(zhì)激素受體的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性的途徑，來達(dá)到調(diào)節(jié)糖代謝的功能[12]。而在胰島β細(xì)胞中有LXR的表達(dá)，激活LXR后可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素[13]。因此，與模型組相比，干預(yù)組大鼠的體質(zhì)量與血糖均明顯好轉(zhuǎn)；若予以大鼠LXR激動(dòng)劑，則可對(duì)大鼠的脂類代謝(三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇)均有較好的調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，LXR表達(dá)可誘導(dǎo)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，將其排泄[14-15]。同時(shí)還可減少小腸對(duì)膽固醇的吸收，從而降低體內(nèi)膽固醇水平。

綜上所述，LXR表達(dá)在DN中具有重要的功能，對(duì)高血糖、腎臟微血管病變以及高血脂等病變有著很好的防治作用。LXR表達(dá)有望作為治療DN藥物的靶點(diǎn)，為今后進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

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(本文編輯：陳素芳)

Effects of Liver X Receptor Expression on Rats with Diabetic Nephropathy and Its Mechanism

SHIShuai-shuai,ZHANGYi-qiang,WENWen-bin,etal.

DepartmentofNephrology,HejiHospitalAffiliatedtoChangzhiMedicalCollege,Changzhi046011,China

Objective To investigate the effects of liver X receptor (LXR) expression on rats with diabetic nephropathy(DN) and its mechanism.Methods 60 Wistar rats were randomly divided into control group,model group and intervention group by sortition randomization method with 20 rats in each group.Rats in model group and intervention group were injected intraperitoneally with streptozocin (STZ) (60 mg/kg) injection to establish DN model.Rats in intervention group were treated with LXR agonists T0901317(30 mg·kg-1·d-1).After 12 weeks,the rats were weighed up,24-hour urine of rats was collected,then rats were injected intraperitoneally with ether,blood samples were taken from epigastric vessels,then rats were put to death,the blood samples were used to measure levels of blood sugar,renal function,blood lipid.Results After 12 weeks,there were significant differences in body mass,levels of urine protein,blood sugar,creatinine,urea nitrogen,triglyceride,total cholesterol and high density lipoprotein cholesterol,and endogenous creatinine clearance rate among three groups of rats (P<0.05).Levels of urine protein,blood sugar,creatinine,urea nitrogen,triglyceride and total cholesterol in model group and intervention group were significantly higher than those in control group (P<0.05),while body mass,endogenous creatinine clearance rate,and level of high density lipoprotein cholesterol in model group and intervention group were significantly lower than those in control group (P<0.05).Levels of urine protein,blood sugar,creatinine,urea nitrogen,triglyceride and total cholesterol in intervention group were significantly lower than those in model group,while body mass,endogenous creatinine clearance rate,and level of high density lipoprotein cholesterol in intervention group were significantly higher than those in model group (P<0.05).Conclusion LXR expression can obviously improve biochemical indexes of Wistar rats with DN,which may have certain guiding significance.

Diabetic nephropathies；Liver X receptor；Blood glucose；Kidney function tests；Lipoproteins

山西省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)項(xiàng)目 (2011113)

046011山西省長(zhǎng)治市，長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科(師帥帥，溫文斌，張巍，趙銀娥)；長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室(張毅強(qiáng))

師帥帥，046011山西省長(zhǎng)治市，長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科；E-mail:mrshiss@126.com

R 587.24 R -332

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.09.011

2014-06-06；

2015-02-14)