葉酸代謝相關酶基因多態(tài)性與不良孕產(chǎn)發(fā)生易感性的關系*

李茜西，伍萍芝，何琳琳，呂德欣，傅錦堅

(廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院婦科門診，廣西柳州 545001)

?

葉酸代謝相關酶基因多態(tài)性與不良孕產(chǎn)發(fā)生易感性的關系*

李茜西，伍萍芝，何琳琳，呂德欣，傅錦堅△

(廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院婦科門診，廣西柳州 545001)

目的 分析婦女亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T、A1298C及甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)A66G基因多態(tài)性與不良孕產(chǎn)史的關聯(lián)性。方法 采用病例對照研究的方法，以549例正常婦女(對照組)及300例有不良孕產(chǎn)史(觀察組)婦女為對象，采集口腔黏膜上皮細胞，提取基因組DNA，采用基因測序技術，進行MTHFR及MTRR基因多態(tài)性檢測。結果MTHFR677TT基因型在觀察組的分布頻率(10.00%)較對照組(3.46%)明顯升高(χ2=15.25，P<0.01)；MTHFR-1298CC基因型在觀察組的分布頻率(11.00%)較對照組(4.01%)明顯升高(χ2=15.66，P<0.01)；MTRR66GG基因型頻率分布兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.02，P=0.082)。兩個基因的交互作用分析表明同時攜帶MTHFRA1298C突變位點和MTRRA66G突變位點增加了不良孕產(chǎn)發(fā)生的可能性(OR=1.52，P=0.011)。結論MTHFRC677T及A1298C與女性不良孕產(chǎn)的發(fā)生有一定的相關性。

亞甲基四氫葉酸還原酶；甲硫氨酸合成酶還原酶；不良孕產(chǎn)史；基因多態(tài)性

流產(chǎn)、死胎、畸胎和新生兒死亡等不良孕產(chǎn)是生殖醫(yī)學的一個研究熱點，10%～15%的妊娠婦女有發(fā)生不良孕產(chǎn)的風險，給社會公共衛(wèi)生帶來沉重的經(jīng)濟和精神負擔。不良孕產(chǎn)的發(fā)生主要是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結果。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase,MTRR)是葉酸代謝途徑的關鍵酶，有研究表明，MTHFR及MTRR基因多態(tài)性影響與新生兒神經(jīng)管缺陷、唇腭裂、妊娠期高血壓、女性胚胎停育、習慣性流產(chǎn)等不良孕產(chǎn)史密切相關[1-6]。已發(fā)現(xiàn)MTHFR及MTRR基因存在多種基因多態(tài)性位點，其中最常見的是MTHFR基因的C677T、A1298C和MTRR的A66G。這些基因多態(tài)性影響著編碼酶的活性，導致血清中葉酸、維生素B12及血同型半胱氨酸發(fā)生改變。本研究旨在分析廣西壯族自治區(qū)柳州地區(qū)育齡婦女MTHFR基因的C677T、A1298C和MTRR的A66G 3個多態(tài)性位點，分析此位點與不良孕產(chǎn)史的相關性，為該地區(qū)人群預防出生缺陷制定針對性的干預研究提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年12月至2014年5月在本院進行孕期檢查或不良孕產(chǎn)史門診咨詢的女性300例(觀察組)，年齡18～35歲，平均(25.70±7.40)歲。患者簽署知情同意書，由經(jīng)過培訓的檢驗科技術人員現(xiàn)場進行口腔黏膜上皮細胞采樣，問卷以無記名的方式由患者獨立完成。納入標準：(1)年齡18～40歲的女性。(2)按照《婦產(chǎn)科學》第8版[7]的定義納入病例，發(fā)生難免流產(chǎn)、稽留流產(chǎn)、復發(fā)性流產(chǎn)等自然流產(chǎn)史；有胎兒先天畸形、胎兒生長受限、生育巨大胎兒、胎兒窘迫等胎兒異常史以及有死胎、死產(chǎn)史等生育史的育齡婦女。對照組為妊娠不超過20周且無不良妊娠史的育齡婦女549例，年齡19～36歲，平均(25.40±7.20)歲，獲得研究對象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑與設備 普通PCR儀ABI7500；葉酸代謝障礙相關的3個單核苷酸基因多態(tài)性位點(Single nucleotide polymorphisms,SNP)：MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G的引物由美國ABI公司合成，PCR試劑及引物均購自美國ABI公司，DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司。反應所用的基因多態(tài)位點引物信息，MTHFR C677T上游引物：5′-GAA AAG CTG CGT GAT GAT G-3′，下游引物：5′-TTG AAG GAG AAG GTG TC-3′；MTHFR A1298C上游引物：5′-AAG AAC GAA GAC TTC AAA-3′，下游引物：5′-TGG GGG GAG GAG CTG AC-3′；MTRR A66G上游引物：5′-AGG CAA AGG CCA TCG CA-3′，下游引物：5′-ATC CAT GTA CCA CAG CTT-3′。

1.2.2 樣本DNA提取及葉酸基因分型 采集受檢者的口腔黏膜上皮細胞，利用柱式抽提試劑盒抽提樣本DNA。采用基因測序技術，檢測MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G的基因多態(tài)性。每個反應體系總體積10.00 μL，包含DNA模板(20.00 ng/μL)1.00 μL，2×MasterMix 5.00 μL，20×引物0.50 μL，去離子水3.50 μL。反應條件為95 ℃ 10 min，隨后92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min進行20個循環(huán)，89 ℃ 15 s，60 ℃ 90 s再進行30個循環(huán)。反應結束后把樣本送至上海生物工程公司以進行基因測序，確定各個樣本的基因分型結果。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，基因計數(shù)法統(tǒng)計基因型頻率和等位基因頻率。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗、基因型及等位基因頻率比較均使用χ2檢驗，基因-基因交互作用采用Logistic回歸，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組對象MTHFR基因C677T、A1298C位點基因型和等位基因頻率分布比較 MTHFR 677TT基因型及MTHFR 677T等位基因在觀察組的分布頻率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MTHFR基因1298CC基因型及1298C等位基因在觀察組的分布頻率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、2。

表1 兩組對象MTHFR基因C677T位點基因型分布和等位基因頻率比較[n(%)]

表2 兩組對象MTHFR基因A1298C位點基因型分布和等位基因頻率比較[n(%)]

表3 兩組對象MTRR基因A66G位點基因型分布和等位基因頻率比較[n(%)]

表4 Logistic回歸模型分析葉酸代謝基因-基因交互作用

2.3 葉酸代謝相關基因-基因交互作用與不良孕產(chǎn)的關系 經(jīng)Logistic回歸分析，MTHFR基因A1298C位點與MTRR基因A66G位點分布之間存在交互作用，二者聯(lián)合作用導致婦女發(fā)生不良孕產(chǎn)的危險性增高(OR=1.52，P=0.011)，見表4。

3 討 論

在體內(nèi)DNA甲基化、DNA合成、細胞分裂、組織生長、特別是在高速生長的細胞中，葉酸代謝過程均起了重要的作用。因此，有缺陷的葉酸代謝可能會導致DNA合成、參與胚胎形成過程中DNA甲基化受損[8]。MTHFR和MTRR是葉酸轉運和代謝過程中關鍵的酶，這些酶基因多態(tài)性是過去10多年來的研究熱點[9-10]。越來越多的研究表明，MTHFR和MTRR基因多態(tài)性與先兆子癇、胎兒生長受限、死胎、唇腭裂、反復自然流產(chǎn)、胎兒畸形發(fā)生等不良孕產(chǎn)結局有關[1-6]。

MTHFR存在多種基因突變類型，常見的突變是cDNA序列上第4外顯子677位點胞嘧啶C被胸腺嘧啶T取代，這一變化造成編碼的丙氨酸被纈氨酸取代。雜合子CT的多態(tài)性使得正常酶活性降低35%，血紅細胞葉酸水平降低10%。相對于正常的CC基因型，患者攜帶TT基因型的MTHFR僅有正常酶活性的60%，紅細胞葉酸水平下降了18%[11]。MTHFR第7個外顯子1298位點腺嘌呤A被胞嘧啶C替代后，使得編碼谷氨酰胺轉變?yōu)楸彼?。而MTRR 66位點位于第2外顯子，位點腺嘌呤A突變成鳥嘌呤G后，可引起編碼氨基酸由異亮氨酸變?yōu)榈鞍彼?。上?個基因多態(tài)性位點的純合子個體(677TT、1298CC、66GG)血漿葉酸和維生素B12水平較低，血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平上升?？傮w而言，由于其潛在的降低MTHFR及MTRR酶活性的作用，引起血漿高Hcy和低葉酸水平，造成Hcy在體內(nèi)蓄積，從而導致自然流產(chǎn)和胚胎發(fā)育異常等不良孕產(chǎn)的結局。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組與對照組婦女相比，其純合突變677TT型及等位基因677T基因型頻率分布，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示677位點突變基因與不良孕產(chǎn)結局的發(fā)生有密切關系。Yang等[4]的Meta分析結果表明，產(chǎn)唐氏綜合征患兒的孕婦比正常婦女更容易攜帶677TT基因(OR=1.28，95%CI=1.22～1.46)。本研究結果表明，677T等位基因型也影響著不良孕產(chǎn)結局的發(fā)生(χ2=8.88，P=0.003)，這與國外的研究一致[12]。Zhao等[1]對納入的9篇關于MTHFR C677T基因多態(tài)性與唇腭裂關系的Meta分析結果表明，亞洲兒童中，MTHFR C677T基因多態(tài)性導致發(fā)生非綜合征性唇腭裂(nonsyndromic cleft lip and palate,NSCL/P) 的危險性增高(OR=1.41，95%CI= 1.23～1.61)，并且這一關系在生出NSCL/P患兒的母親中得到證實 (OR=1.70，95%CI=1.19～2.42)。Yang等[3]對114篇關于妊娠高血壓的文獻進行薈萃分析，該Meta分析納入了15 411例有妊娠高血壓綜合征(妊高征)的孕婦及21 970正常孕婦，結果表明，C677T 基因多態(tài)性顯著影響著妊高征的發(fā)生(OR=1.21，95%CI=1.08～1.32)。Stangler Herode?等[5]對353 個自然流產(chǎn)胚胎及222個正常胚胎進行MTHFR C677T及 A1298C 基因多態(tài)性分析，在自然流產(chǎn)胚胎組發(fā)現(xiàn)有較高的MTHFR 677雜合子基因型(CT)攜帶(P<0.01)。

MTHFR A1298C基因多態(tài)性與不良孕產(chǎn)結局發(fā)生的相關性早已備受關注[13]。本研究發(fā)現(xiàn)對攜帶1298AA基因型而言，無論是1298CC純合子突變型還是1298C等位基因型，其發(fā)生不良孕產(chǎn)結局的風險均比對照組風險增加(P<0.05)。相同的結果也在一些研究報道中得到證實。Chedraui等[2]對150例有先兆子癇的孕婦及正常婦女檢測MTHFR C677T及A1298C基因型，結果發(fā)現(xiàn)，攜帶1298CC純合子突變型的孕婦更容易發(fā)生先兆子癇(病例組TT頻率15.3%，對照組TT頻率0.7%，P<0.05)。Nair等[6]發(fā)表的對1 080例不明原因反復流產(chǎn)婦女及709例正常婦女MTHFR 基因A1298C多態(tài)性進行分析，結果表明，與正?；蛐?298AA相比，攜帶純合子基因的風險是前者的4.83倍(95%CI=1.71～13.61)，攜帶雜合子基因的風險是正常型的1.98倍(95%CI=1.23～3.18)。Stangler Herode?等[5]以攜帶1298AA基因型胚胎為對照組，與攜帶MTHFR A1298C的雜合型及純合子突變型1298CC相比，后者發(fā)生自然流產(chǎn)的風險是對照組的3.01倍及1.54倍(P<0.05)，而不管胚胎是單倍體型還是正常核型，說明自然流產(chǎn)可能與母親和胎兒基因之間的相互作用有關。

MTRR在葉酸代謝途徑中保持甲硫氨酸合成酶在催化Hcy重甲基化為蛋氨酸過程中的活性，間接參與體內(nèi)甲基化過程。MTRR基因多態(tài)性與不良孕產(chǎn)結局的關系研究較少。本研究顯示，MTRR A66G多態(tài)本身似乎與不良孕產(chǎn)發(fā)病風險無關，但發(fā)現(xiàn)對66G等位基因型而言，其發(fā)生不良孕產(chǎn)結局的風險要較攜帶66A基因型者風險增加(P=0.032)，提示66G等位基因的影響也存在，但效應不如MTHFR C677T及A1298C明顯。Yang等[4]研究表明，MTRR A66G基因多態(tài)性顯著影響著唐氏綜合征患兒的出生(OR=1.22，95%CI=1.02～1.46)。Pozzi等[14]對在意大利產(chǎn)唐氏綜合征患兒的74例婦女和產(chǎn)正常兒的184例婦女進行病例對照研究，結果表明，突變的G等位基因無論是以雜合或純合的形式存在，在產(chǎn)唐氏綜合征母親中更為常見(OR=2.21，95%CI=1.11～4.40)。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，疾病的發(fā)生常常是環(huán)境與基因因素相互作用的結果，而疾病與多個遺傳位點多態(tài)性的聯(lián)合作用有關，即存在基因-基因之間的交互作用。葉酸的代謝過程較復雜，涉及多個調(diào)控機制，任何調(diào)控步驟中發(fā)生遺傳變異均可影響蛋白質(zhì)功能，進而改變代謝物的平衡狀態(tài)，以及基因-基因的交互作用。據(jù)Robien等[15]報道，MTHFR基因和胱硫醚β-合成酶(CBS)基因聯(lián)合突變，使得產(chǎn)脊柱裂畸形兒的風險比任何單基因(MTHFR或CBS)發(fā)生突變增加了5倍，提示在脊柱裂這一遺傳病中存在基因-基因交互作用。本研究結果表明，MTHFR A1298C基因與MTRR A66G基因存在交互作用，使得發(fā)生不良孕產(chǎn)結局的風險增加了1.52倍，其確切的致病機制尚待進一步的深入研究加以證實。

[1]Zhao M,Ren Y,Shen L,et al.Association between MTHFR C677T and A1298C polymorphisms and NSCL/P risk in Asians:a meta-analysis[J].PLoS One,2014,9(3):e88242.

[2]Chedraui P,Salazar-Pousada D,Villao A,et al.Polymorphisms of the methylenetetrahydrofolate reductase gene (C677T and A1298C) in nulliparous women complicated with preeclampsia[J].Gynecol Endocrinol,2014,30(5):392-396.

[3]Yang B,Fan S,Zhi X,et al.Associations of MTHFR gene polymorphisms with hypertension and hypertension in pregnancy:a meta-analysis from 114 studies with 15411 cases and 21970 controls[J].PLoS One,2014,9(2):e87497.

[4]Yang M,Gong T,Lin X,et al.Maternal gene polymorphisms involved in folate metabolism and the risk of having a Down syndrome offspring:a meta-analysis[J].Mutagenesis,2013,28(6):661-671.

[5]Stangler Herode? S,Zagradinik B,Erjaveckerget A,et al.MTHFR C677T and A1298C genotypes and haplotypes in Slovenian couples with unexplained infertility problems and in embryonic tissues from spontaneous abortions[J].Balkan J Med Genet,2013,16(1):31-40.

[6]Nair RR,Khanna A,Singh R,et al.Association of maternal and fetal MTHFR A1298C polymorphism with the risk of pregnancy loss:a study of an Indian population and a meta-analysis[J].Fertil Steril,2013,99(5):1311-1318.

[7]謝幸.婦產(chǎn)科學[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:47-121.

[8]Morrison K,Papapetrou C,Hol FA,et al.Susceptibility to spina bifida;an association study of five candidate genes[J].Ann Hum Genet,1998,62(Pt 5):379-396.

[9]García-Minguillán CJ,Fernandez-Ballart JD,Ceruelo S,et al.Riboflavin status modifies the effects of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and methionine synthase reductase (MTRR) polymorphisms on homocysteine[J].Genes Nutr,2014,9(6):435.

[10]Bravatà V.Controversial roles of methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms and folate in breast cancer disease[J].Int J Food Sci Nutr,2014,10(16):1-7.

[11]Molloy AM,Daly S,Mills JL,et al.Thermolabile variant of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase associated with low red-cell folates:implications for folate intake recommendations[J].Lancet,1997,349(9065):1591- 1593.

[12]Costa-Lima MA,Amorim MR,Orioli IM.Association of methylenetetrahydro- folate reductase gene 677C>T polymorphism and Down syndrome[J].Mol Biol Rep,2013,40(3):2115-2125.

[13]Madjunkova S,Volk M,Peterlin B,et al.Detection of thrombophilic mutations related to spontaneous abortions by a multiplex SNaPshot method[J].Genet Test Mol Biomarkers,2012,16(4):259-264.

[14]Pozzi E,Vergani P,Dalprà L,et al.Maternal polymorphisms for methyltetrahydrofolate reductase and methionine synthetase reductase and risk of children with Down syndrome[J].Am J Obstet Gynecol,2009,200(6):636.

[15]Robien K,Ulrich CM.5,10-methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms and leukemia risk:a HuGE minireview[J].Am J Epidemiol,2003,157(7):571-582.

Relationship between folic acid metabolism-related enzyme gene polymorphism and susceptibility of abnormal pregnancy*

LiQianxi,WuPingzhi,HeLinlin,LvDexin,FuJinjian△

(LiuzhouMunicipalMaternityandChildHealthCareHospital,Liuzhou,Guangxi545001,China)

Objective To analyze the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T,A1298C and methionine synthase reductase(MTRR) gene polymorphism with abnormal pregnancy history.Methods 549 normal women (control group) and 300 women with the abnormal pregnancy history(observation group) were taken as the subjects by adopting the case control research method.The oral mucosa epithelial cells were collected for extracting genomic DNA.The MTHFR and MTRR gene polymorphisms were detected by the gene sequencing method.Results The distribution frequency of MTHFR 677TT genotype in the abnormal pregnancy group was significantly increased compared with the control group (10.00%vs.3.46%,χ2=15.25，P<0.01);the distribution frequency of MTHFR-1298CC genotype in the abnormal pregnancy group was significantly increased compared with the control group (11.00vs.4.01%,χ2=15.66,P<0.01);the distribution frequency of MTRR A66G genotype had no statistical difference between the two groups(χ2=3.02，P=0.082).The interactive analysis of 2 genes indicated that simultaneous carrying the MTHFR A1298C mutation site and MTRR A66G mutation site increased the possibility of abnormal pregnancy occurrence (OR=1.52,P=0.011).Conclusion MTHFR C677T and A1298C have a certain correlation with female abnormal pregnancy occurrence.

methylenetetrahydrofolate reductase;methionine synthase reductase;abnormal pregnancy history;gene polymorphism

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.012

廣西醫(yī)藥衛(wèi)生自籌經(jīng)費資助項目(Z2014373)。 作者簡介：李茜西(1965-)，副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事婦科內(nèi)分泌研究?！?/p>

，Tel：(0772)2815306；E-mail：fujinjianaa@126.com。

R

A

1671-8348(2015)10-1330-04

2014-10-18

2014-12-28)