七氟醚預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究*

饒淑梅，高 麗，馬永超

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)生物工程重點實驗室，河南漯河 462002)

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七氟醚預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究*

饒淑梅，高 麗，馬永超△

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校醫(yī)學(xué)生物工程重點實驗室，河南漯河 462002)

目的 了解非受體酪氨酸激酶c-Src在七氟醚預(yù)處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用。方法 將健康雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為5組(n=10)，假手術(shù)組(Ⅰ組)、缺血再灌注組(Ⅱ組)、七氟醚預(yù)處理組(Ⅲ組)、七氟醚預(yù)處理加二甲基亞砜(DMSO)組(Ⅳ組)和七氟醚預(yù)處理加c-Src特異性抑制劑SU6656組(Ⅴ組)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組于再灌注前1min進(jìn)行七氟醚后處理；Ⅴ組于再灌注前5min靜脈注射SU6656；Ⅳ組給予等容量DMSO。再灌注120min后，采集動脈血樣，檢測血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)的活性。取小鼠心臟并分離左心室，計算心肌梗死面積；檢測Src、磷酸化Src(p-Src)、心肌過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的表達(dá)水平。結(jié)果 與Ⅰ組比較，其余4組血清CK-MB、LDH的活性、心肌梗死面積、心肌p-Src/Src、CAT、SOD升高(P<0.05)；與Ⅲ、Ⅳ組比較，Ⅱ、Ⅴ組血清CK-MB、LDH的活性、 心肌梗死體積、CAT升高，SOD活性降低，同時心肌p-Src/Src顯著下降 (P<0.05)。結(jié)論c-Src-活性氧(ROS)信號通路可能介導(dǎo)了七氟醚預(yù)處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷作用。

非受體酪氨酸激酶；活性氧；七氟醚；心肌缺血；再灌注損傷

臨床上冠狀動脈溶栓術(shù)和心搏驟停復(fù)蘇后可發(fā)生心肌缺血再灌注損傷。如何減少缺血再灌注損傷一直是臨床工作的難點。有研究表明，七氟醚預(yù)處理可減輕腦部缺血及心肌缺血再灌注損傷[1-2]。而且研究發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞內(nèi)信號通路介導(dǎo)了缺血后處理減輕心肌缺血再灌注損傷的作用。非受體酪氨酸激酶c-Src通路是細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與多種細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控，不僅參與細(xì)胞分化、增殖，還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡[3-5]。七氟醚預(yù)處理的心肌保護(hù)機(jī)制是否與c-Src-活性氧(ROS)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)尚有待研究。本研究以Wistar大鼠為模型，構(gòu)建心肌缺血模型，檢測c-Src-ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在七氟醚預(yù)處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：健康清潔級雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量240～270 g，2～3月齡，由河南省實驗動物中心提供。儀器及藥品：80麻醉機(jī)購自美國Datex-Ohmeda 公司，Vamos氣體監(jiān)測儀購自德國Drager公司；七氟醚購自山東濟(jì)南維都化工公司，SU6656 購自Calbiochem公司；乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及模型建立 (1)實驗分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法，將50只大鼠隨機(jī)分為5組(n=10)：假手術(shù)組(Ⅰ組)、缺血再灌注組(Ⅱ組)、七氟醚預(yù)處理組(Ⅲ組)、七氟醚預(yù)處理加二甲基亞砜(DMSO)組(Ⅳ組)和七氟醚預(yù)處理加c-Src特異性抑制劑SU6656組(Ⅴ組)。(2)模型建立：腹腔注射3%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉下，用16G BD套管針經(jīng)口氣管插管后，接DHXl50B小型動物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，動物呼吸機(jī)進(jìn)氣口與80麻醉機(jī)相連，潮氣量6～8 mL，通氣頻率75次/min，吸呼比1∶2，氣管導(dǎo)管呼氣端連接Vamos氣體監(jiān)測儀，監(jiān)測呼氣末七氟醚濃度及二氧化碳分壓(PCO2)水平，維持PCO235～45 mm Hg。左側(cè)頸總動脈穿刺置管，連接BL-420F生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，監(jiān)測有創(chuàng)動脈壓及標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。模型制備過程中維持直腸溫度36.5～37.5 ℃。Ⅱ～Ⅴ組參照文獻(xiàn)[1]介紹的方法制備心肌缺血再灌注損傷模型。于左側(cè)胸壁第3、4肋間距離胸骨左緣約0.5 cm逐層鈍性分離開胸，7～0絲線穿過左冠狀動脈前降支，穩(wěn)定10 min后結(jié)扎，以結(jié)扎線遠(yuǎn)端心前壁變青紫色或蒼白色、ST段抬高、T波高聳為缺血成功標(biāo)志。缺血30 min時松開結(jié)扎線，心肌缺血區(qū)恢復(fù)紅潤、ST段回落和(或)T波恢復(fù)為再灌注成功的標(biāo)志。Ⅰ組僅在左冠狀動脈前降支下進(jìn)行穿線。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組進(jìn)行七氟醚預(yù)處理：再灌注前3 min吸入七氟醚，使再灌注前1 min呼氣末七氟醚濃度為2.5%～3.0%后，持續(xù)吸入5 min；Ⅴ組于再灌注前5 min經(jīng)股靜脈注射SU6656 (Calbiochem公司)0.5 mg/kg，Ⅳ組給予等容量0.02% DMSO。

1.2.2 心肌損傷指標(biāo)的檢測 再灌注120 min時，每組10只大鼠，均經(jīng)左頸動脈取血樣2 mL，離心，取上清液，采用比色法檢測血清LDH和CK-MB 的活性。每組取5只大鼠，再次結(jié)扎左冠狀動脈前降支，經(jīng)左頸總動脈逆行注射1%伊文氏藍(lán)3.4 mL，未藍(lán)染的區(qū)域為缺血區(qū)心肌。取出心臟，冰凍10 min，垂直于心臟長軸切片(片厚2 mm)，置入1%四氮唑藍(lán)溶液中，于37 ℃孵育15 min，缺血心肌呈磚紅色，梗死心肌呈灰白色。10%甲醛溶液固定，24 h后進(jìn)行封片、掃描，數(shù)碼照相，采用Image 6.0軟件進(jìn)行分析。根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]計算心肌梗死面積比例，其公式為：

梗死面積=(梗死區(qū)面積÷缺血危險區(qū)面積)×100%

(1)

梗死體積=梗死面積×2

(2)

1.2.3 Western blot檢測大鼠心肌磷酸化Src(p-Src)、c-Src蛋白表達(dá)水平 再灌注120 min時，每組取5只大鼠，迅速取出心臟，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，取左心室前壁組織，一邊加液氮一邊進(jìn)行組織研磨。加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，4 ℃，13 200 r/min，離心15 min。BCA法測蛋白水平后，均衡各組蛋白水平，蛋白樣品經(jīng)變性處理后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。經(jīng)半干式轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗鼠p-Src抗體，4 ℃孵育過夜，按1∶7 500比例稀釋二抗，室溫下孵育1 h。PBST洗3次，等體積混勻化學(xué)發(fā)光液A、B液，曝光、顯影、定影，圖像經(jīng)Image J 軟件進(jìn)行灰度掃描分析。PVDF膜經(jīng)抗體洗脫后，加5%牛奶封閉液重新室溫封閉1 h。加入兔抗鼠β-actin及c-Src抗體。以目的蛋白條帶光密度值與β-actin光密度值的比值反映目的蛋白表達(dá)，計算p-Src與c-Src表達(dá)的比值(p-Src/c-Src)反應(yīng)c-Src活性。

1.2.4 心肌CAT、SOD水平的檢測 新鮮心肌組織經(jīng)液氮下研磨勻漿后，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，4 ℃，13 200 r/min，離心15 min。取上清液BCA法測蛋白濃度后，均衡各組蛋白濃度，按CAT、SOD試劑盒說明書進(jìn)行CAT、SOD水平的檢測。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清CK-MB、LDH水平及心肌梗死面積比較 Ⅰ組未發(fā)生心肌梗死。與Ⅰ組比較，其余4組均出現(xiàn)不同程度的心肌梗死及血清CK-MB、LDH陽性。與Ⅱ、Ⅴ組比較，Ⅲ、Ⅳ組心肌梗死面積及血清CK-MB、LDH水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清CK、LDH水平及心肌梗死面積比較

a：P<0.05，與Ⅰ組比較；b：P<0.05，與Ⅱ、 Ⅴ組比較。

2.2 各組大鼠心肌組織p-Src、c-Src蛋白表達(dá)水平比較 Ⅲ、Ⅳ組心肌細(xì)胞p-Src表達(dá)水平顯著高于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

A：Westernblot檢測；B：統(tǒng)計分析圖；a：P<0.01，與Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組比較。

圖1 各組大鼠心肌組織p-Src、c-Src蛋白

表達(dá)比較(n=5)

2.3 各組大鼠心肌組織SOD、CAT活性比較 與Ⅲ、Ⅳ組比較，Ⅱ、Ⅴ組SOD活性降低、CAT活性增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠心肌組織SOD、CAT活性比較

a：P<0.05，與Ⅱ、 Ⅴ組比較。

3 討 論

缺血、缺氧性損傷(ischemiareperfusioninjury，IRI)是指缺血后的再灌注不僅不能使臟器功能恢復(fù)，反而加重臟器的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷[6]。臨床上腦外傷、缺血性腦卒中、頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)、心臟手術(shù)等麻醉管理期間存在缺氧缺血性腦損傷的可能。缺血缺氧性損傷直接影響到疾病的預(yù)后、手術(shù)成功率和患者存活率。因此，研究缺血缺氧性腦損傷作用的機(jī)制及如何減輕缺血缺氧性腦損傷，具有重要的臨床意義。

藥物預(yù)處理的臟器保護(hù)作用成為近年來研究的熱點。已有研究發(fā)現(xiàn)利用七氟醚和氟烷、安氟醚、異氟醚等吸入麻醉藥進(jìn)行預(yù)處理，有心肌保護(hù)效應(yīng)，但具體機(jī)制目前不甚清楚[7-8]。線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)控可能參與到七氟醚預(yù)處理對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[9-11]。由于大鼠循環(huán)系統(tǒng)與人體極為相似，心肌側(cè)支循環(huán)較少，再灌注損傷發(fā)生的概率比較高。因此，本研究采用大鼠為研究對象，結(jié)果表明，與Ⅰ組比較，Ⅱ組血清CK-MB、LDH的活性和心肌梗死體積升高，提示大鼠心肌缺血再灌注損傷模型制備成功。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，當(dāng)大鼠預(yù)先通入七氟醚處理10min可減輕大鼠離體心臟缺血再灌注損傷。七氟醚預(yù)處理可減少心肌梗死面積，降低血清心肌酶水平，減輕心肌缺血再灌注損傷。然而當(dāng)大鼠在預(yù)處理七氟醚同時注射c-Src活性抑制劑SU6656，大鼠心肌損傷與Ⅱ組同樣嚴(yán)重，提示c-Src信號通路可能參與了七氟醚預(yù)處理的保護(hù)作用。對心肌組織p-Src表達(dá)水平檢測表明，Ⅲ、Ⅳ組心肌p-Src水平顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組，說明七氟醚預(yù)處理可增強(qiáng)心肌c-Src的活性。

c-Src廣泛地分布于各種組織中，在細(xì)胞生長、增殖、凋亡、血管生成、神經(jīng)細(xì)胞分化等多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的信號通路中具有重要作用[12-13]。對心肌組織CAT及SOD水平檢測進(jìn)一步表明，Ⅱ組心肌CAT水平增高而相應(yīng)的SOD水平降低，CAT、SOD活性與細(xì)胞內(nèi)ROS的水平密切相關(guān)，表明缺血再灌注引起心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加，后者損傷線粒體內(nèi)膜，使線粒體內(nèi)膜通透性增加，細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放出來，啟動細(xì)胞凋亡信號，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-15]。當(dāng)大鼠預(yù)先處理七氟醚后，能顯著逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD的活性，但同時使用SU6656，則七氟醚的這種作用減弱或消失，這提示七氟醚預(yù)處理可能通過調(diào)節(jié)c-Src活性，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD的活性，對心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。

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Study on mechanism of protective effect of sevoflurane pretreatment on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats*

RaoShumei,GaoLi,MaYongchao△

(KeyLaboratoryofMedicalBioengineering,LuoheMedicalCollege,Luohe,Henan462002,China)

Objective To explore the role of non-receptor tyrosine kinase(c-Src) in sevoflurane pretreatment for relieving myocardial ischemia- reperfusion injury.Methods By using the random number table,the healthy male Wistar rats were randomly divided into 5 groups (n=10):sham operation group (Ⅰ),ischemia- reperfusion group(Ⅱ),sevoflurane pretreatment group(Ⅲ),sevoflurane pretreatment plus dimethyl sulfoxide(DMSO,Ⅳ) and sevoflurane pretreatment plus c-Src specific inhibitor SU6656 group(Ⅴ) groups.The group Ⅲ,Ⅳ and Ⅴ were performed the sevoflurane aftertreatment before reperfusion;the group Ⅴ was injected by SU6656 at 5 min before reperfusion;the group Ⅳ was given the equal volume DMSO.The arterial blood sample in each group was collected at 120 min after reperfusion for detecting serum LDH level and CK-MB activity.Rats were killed for taking the heart and separating the left ventricle to calculate the area of myocardial infarctio;the expression levels of Src,phosphorylated Src (p-Src),CAT and SOD in myocardial tissue were detected in each group.Results Compared with the groupⅠ,the level of serum CK-MB and LDH activity,myocardial infarct area and p-Src/Src,CAT,SOD in the other 4 groups were increased significantly (P<0.05);comparing with the group Ⅲ,the serum CK-MB and LDH activity,myocardial infarct area and SOD,CAT,in the group Ⅱ,Ⅳ and Ⅴ were increased,however the level of p-Src/Src was decreased significantly (P<0.05).Conclusion The c-Src-reactive oxygen signaling pathway might mediate the role of sevoflurane pretreatment for reducing myocardial ischemia- reperfusion injury in rat.

non-receptor tyrosine kinase;reactive oxygen;sevoflurane;myocardial ischemia;reperfusion injury

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.010

漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基金(2013-S-LMC03)。 作者簡介：饒淑梅(1987-)，講師，碩士研究生，主要從事老年性疾病研究。△

,Tel：13839527381；E-mail:13839527381@163.com。

R

A

1671-8348(2015)10-1325-03

2014-10-15

2014-12-10)