大鼠體外循環(huán)前后血漿蛋白質(zhì)差異性表達(dá)*

王壽勇，馬琳玉，王 穎，張 洲，鄧薇菲

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院：1.麻醉科；2.血液腫瘤科，重慶 400014)

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大鼠體外循環(huán)前后血漿蛋白質(zhì)差異性表達(dá)*

王壽勇1，馬琳玉2，王 穎1，張 洲1，鄧薇菲1

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院：1.麻醉科；2.血液腫瘤科，重慶 400014)

目的 實(shí)施大鼠體外循環(huán)(CPB)前后血漿比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，了解CPB前、后血漿蛋白質(zhì)的差異性表達(dá)，以期發(fā)現(xiàn)對(duì)早期診斷CPB后并發(fā)癥有參考價(jià)值的血漿標(biāo)志物。方法 將成年雄性SD大鼠10只分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只，術(shù)前自由進(jìn)食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)組大鼠建立CPB模型，對(duì)照組只進(jìn)行麻醉和動(dòng)、靜脈穿刺操作。兩組動(dòng)物分別在CPB前和CPB結(jié)束時(shí)采取血液標(biāo)本1mL，肝素抗凝，分離血漿。血漿蛋白提純后進(jìn)行二維凝膠電泳、用ImageScanner掃描儀掃描成像。將被認(rèn)定為差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行切膠、酶解和肽段提取后，用質(zhì)譜儀分析鑒定。結(jié)果CPB后，大鼠血漿蛋白質(zhì)表達(dá)斑點(diǎn)數(shù)目明顯增加，共有17個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)被認(rèn)定為CPB所致。經(jīng)質(zhì)譜分析，共鑒定出5種蛋白質(zhì)，分別為：凝溶膠蛋白、結(jié)合珠蛋白、載脂蛋白A1(ApoA1)、免疫球蛋白和Ba1-647。結(jié)論CPB可引起大鼠血漿蛋白質(zhì)出現(xiàn)差異性表達(dá)，從功能上分析，凝溶膠蛋白、結(jié)合珠蛋白、ApoA1有可能作為研究CPB并發(fā)癥的血漿標(biāo)志物。

血漿；蛋白質(zhì)組學(xué)；生物學(xué)標(biāo)記；心肺轉(zhuǎn)流術(shù)；模型，動(dòng)物；大鼠

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)下心內(nèi)直視手術(shù)，是矯治各種先天性心血管畸形和挽救部分終末期心臟病患者的最有效手段。但是，對(duì)CPB這一非生理過程所伴隨的內(nèi)環(huán)境紊亂，目前尚缺乏全面認(rèn)識(shí)。有研究者采用基因芯片技術(shù)獲得了CPB前、后人血白細(xì)胞基因差異性表達(dá)譜[1]，但信息量巨大，缺乏特異性，加上基因表達(dá)與病理、生理功能之間并非一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，對(duì)于全面認(rèn)識(shí)CPB的影響未獲得突破性進(jìn)展。與基因表達(dá)相比，蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，尤其是血漿蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)和診斷損傷性病理、生理過程，判斷轉(zhuǎn)歸，評(píng)估預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療等方面，具有更為重要的意義。本研究擬以SD大鼠CPB模型為研究對(duì)象，實(shí)施血漿比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。目的是要了解CPB引起的血漿蛋白質(zhì)差異性表達(dá)，期望篩選出對(duì)判斷CPB后重要器官、系統(tǒng)損傷等并發(fā)癥具有指導(dǎo)意義的血漿標(biāo)志性蛋白質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料 選取成年雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量300～350 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，將10只SD大鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只，術(shù)前自由進(jìn)食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)組大鼠按照文獻(xiàn)[2]的方法建立CPB模型，對(duì)照組只進(jìn)行麻醉和動(dòng)、靜脈穿刺操作，不進(jìn)行CPB。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在CPB前和CPB結(jié)束后分別采血液標(biāo)本1 mL，肝素抗凝，立即以2 000 r/min離心10 min，再以13 000 r/min離心10 min分離血漿，置于-70 ℃保存。對(duì)照組大鼠在與實(shí)驗(yàn)組平行的時(shí)刻同時(shí)留取血液標(biāo)本并分離血漿。

1.2.2 樣品制備 采用Bio-Rad Aurum Serum Protein Mini Kit對(duì)血漿樣本進(jìn)行處理，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。所獲得的純化蛋白析出液采用TCA-丙酮法沉淀，-20 ℃靜置過夜，然后以16 000 r/min低溫離心5 min，丟棄上清液。用丙酮清洗沉淀3次，加入裂解液100 μL，低溫超聲促溶5 min。純化蛋白樣品采用Bradford法進(jìn)行定量。

1.2.3 固相pH梯度-十二烷基磺酸鈉(SDS)雙向凝膠電泳(2-DE) 蛋白上樣量為1 mg，加入DTT 8.0 μL，IPG buffer 2.3 μL，用重泡脹液補(bǔ)足總體積至450.0 μL，旋渦振蕩器上充分混勻。IPG膠條重泡脹12 h以上，然后轉(zhuǎn)移到等電聚焦槽中，聚焦參數(shù)設(shè)置如下：40 V聚焦6 h，500 V聚焦1 h，1 000、3 000、5 000 V分別聚焦2 h，10 000 V聚焦6.3 h。再將膠板轉(zhuǎn)移到垂直平板電泳儀中，恒溫20 ℃，恒流電泳，4 W 60 min，10 W 320 min，3 W持續(xù)至溴酚藍(lán)下沿泳動(dòng)至玻璃板下沿時(shí)停止。

1.2.4 圖像分析 膠塊采用考馬斯亮藍(lán)染色后小心移至ImageScanner掃描儀的成像臺(tái)上，啟動(dòng)掃描儀。圖像采用ImageMaster 2D Platium軟件分析，每一研究時(shí)刻所獲標(biāo)本進(jìn)行3次平行重復(fù)，將3塊實(shí)際膠圖結(jié)果形成1張?zhí)摂M平均膠，在3次重復(fù)膠圖中至少表達(dá)2次者被定義為有效表達(dá)點(diǎn)。最后將虛擬平均膠上的蛋白質(zhì)表達(dá)點(diǎn)進(jìn)行組間和組內(nèi)的比較，差異表達(dá)的定義如下：(1)未能匹配的表達(dá)點(diǎn)；(2)雖然匹配，但二者蛋白質(zhì)點(diǎn)錐狀圖體積比(v%比值)達(dá)到2.5以上。

1.2.5 質(zhì)譜鑒定 在超凈工作臺(tái)上用切膠筆仔細(xì)將差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)切下，膠粒用超純水清洗3遍，37 ℃浸泡30 min，加入脫色液脫色2次；加入胰蛋白酶消化后，采用70%乙腈和0.1%三氟乙酸提取，真空冷凍抽干。采用Bruker公司的AutoFlex型MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，使用混合標(biāo)準(zhǔn)肽作為外標(biāo)效正。獲得的肽段數(shù)據(jù)用Mascot軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，數(shù)據(jù)庫地址為：www.matrixscience.com 或http://agilentl/mascot/cgi。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠基本情況 實(shí)驗(yàn)組5只大鼠全部成功建立CPB模型，CPB結(jié)束后存活觀察2 h以上。對(duì)照組5只大鼠在實(shí)驗(yàn)觀察過程中生命體征平穩(wěn)。

2.2 兩組大鼠2-DE結(jié)果比較 膠圖上大部分蛋白質(zhì)點(diǎn)聚焦良好。在同一血漿樣品的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，膠圖上蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)、分布、點(diǎn)數(shù)、染色、背景噪音等方面差異不明顯。匹配分析發(fā)現(xiàn)，CPB后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血漿蛋白質(zhì)表達(dá)點(diǎn)數(shù)均有較明顯增加。CPB前，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組未能匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)有10個(gè)。其中，在對(duì)照組中高表達(dá)的有6個(gè)，在實(shí)驗(yàn)組中高表達(dá)的有4個(gè)(圖1)，但這10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在CPB后均未出現(xiàn)差異性表達(dá)。CPB后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組未能匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)共有17個(gè)，全部為實(shí)驗(yàn)組中高表達(dá)(圖2)，這17個(gè)點(diǎn)被認(rèn)為是CPB引起的差異性表達(dá)蛋白質(zhì)。

2.3 質(zhì)譜分析 將上述被認(rèn)定為表達(dá)差異的17個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行切膠、酶解、肽段提取，經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜儀鑒定，共鑒定出5種蛋白質(zhì)，分別為：凝溶膠蛋白(gelsolin)、結(jié)合珠蛋白(haptoglobin)、載脂蛋白A1(apolipoprotein A-1，Apo A1)、免疫球蛋白(immunoglobulin gamma-2b)和Ba1-647。

A：注釋部分為對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組表達(dá)增高的血漿蛋白質(zhì)斑點(diǎn)；B：注釋部分為對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組表達(dá)降低的血漿蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。

圖1 CPB前兩組大鼠2-DE凝像圖比較

圖2 CPB后實(shí)驗(yàn)組表達(dá)升高的蛋白點(diǎn)

3 討 論

CPB會(huì)嚴(yán)重干擾機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡，常導(dǎo)致以急性肺損傷為主的重要器官、系統(tǒng)功能障礙[3-4]。由于缺乏明確的預(yù)警信號(hào)或早期標(biāo)志物，導(dǎo)致臨床上對(duì)某些CPB相關(guān)并發(fā)癥的預(yù)防和治療缺乏足夠的預(yù)見性。從血液(血漿或血清)中發(fā)現(xiàn)生命現(xiàn)象的執(zhí)行者——蛋白質(zhì)的變化，是目前臨床上最簡(jiǎn)單、最常用和最有效的疾病診斷、監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷方法。通過對(duì)模型鼠的研究，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了CPB引起的血漿差異性表達(dá)蛋白質(zhì)，有可能成為監(jiān)測(cè)CPB損傷效應(yīng)的候選標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，CPB后，2-DE凝膠圖上所識(shí)別的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)較CPB前增加了120～150個(gè)(20%)，表明在CPB這種非生理狀態(tài)下，大鼠機(jī)體內(nèi)發(fā)生了一系列基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)的合成與釋放過程。同時(shí)，對(duì)照組經(jīng)假手術(shù)處理后，凝膠圖上所識(shí)別的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)也出現(xiàn)了明顯增加，這說明實(shí)驗(yàn)組CPB后血漿蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，還可能與麻醉、手術(shù)操作等非CPB因素有關(guān)。作為一種應(yīng)用價(jià)值巨大的模式生物，大鼠體型微小，對(duì)手術(shù)創(chuàng)傷耐受力相對(duì)較弱，因此在本實(shí)驗(yàn)中，采用了經(jīng)過改良的閉胸式、自主呼吸CPB模型，以盡量減少非CPB因素對(duì)機(jī)體的干擾，突出CPB的“孤立”作用[2]。

經(jīng)過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，CPB后17個(gè)被判定為差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)中，共鑒定出5種蛋白質(zhì)，分別為凝溶膠蛋白、結(jié)合珠蛋白、ApoA1、免疫球蛋白和Ba1-647。(1)凝溶膠蛋白：CPB中，白細(xì)胞向肺部的浸潤、激活，是引起肺組織損傷的基本環(huán)節(jié)[5-7]。凝溶膠蛋白是一種重要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，控制細(xì)胞質(zhì)在凝膠態(tài)和溶膠態(tài)之間轉(zhuǎn)換，從而調(diào)控包括炎癥細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)[8]。提示CPB中凝溶膠蛋白水平的變化，可能與肺組織損傷程度存在關(guān)聯(lián)。此外，CPB期間，細(xì)胞破壞導(dǎo)致大量肌動(dòng)蛋白進(jìn)入血液循環(huán)，可通過聚合成微絲或形成微血栓，參與術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生[9-10]。而凝溶膠蛋白能夠阻止微絲的形成。因此，凝溶膠蛋白表達(dá)水平的變化，有可能成為CPB中肺部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的潛在標(biāo)志物。(2)結(jié)合珠蛋白：結(jié)合珠蛋白屬于一種急時(shí)相反應(yīng)蛋白，其主要功能就是與血液中的游離血紅蛋白相結(jié)合。游離血紅蛋白為一具有活潑氧化效應(yīng)的成分，能直接引起細(xì)胞膜和組織損傷，加重炎性反應(yīng)。結(jié)合珠蛋白可與CPB中出現(xiàn)的游離血紅蛋白不可逆結(jié)合，經(jīng)清道夫受體介導(dǎo)，被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所清除。因此，推測(cè)其在減輕CPB相關(guān)的全身炎性反應(yīng)中具有積極的作用。(3)Apo A1：Apo A1為243個(gè)氨基酸殘基組成的非糖基化蛋白質(zhì)，除了參與脂質(zhì)代謝，對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化之外，它還具有強(qiáng)大的抗炎癥效應(yīng)。在CPB過程中，由于黏膜屏障功能下降，導(dǎo)致內(nèi)毒素吸收入血或胃腸菌群轉(zhuǎn)位，產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥[11-12]。內(nèi)毒素激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，促使其釋放出各種炎性細(xì)胞因子，引起和加重CPB中的全身炎性反應(yīng)。而Apo A1可能對(duì)此具有拮抗作用，Apo A1分子結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)內(nèi)毒素結(jié)合位點(diǎn)，分別對(duì)內(nèi)毒素和內(nèi)毒素結(jié)合蛋白具有親和力，因此，能夠同時(shí)阻斷游離內(nèi)毒素和內(nèi)毒素-內(nèi)毒素結(jié)合蛋白復(fù)合物的作用，抑制內(nèi)毒素的致炎效應(yīng)。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Apo A1能顯著降低小鼠內(nèi)毒素肺損傷模型的死亡率，延長存活時(shí)間[13]。(4)Ba1-647：Ba1-647為肝臟再生相關(guān)蛋白LRRG173。目前，國內(nèi)外與之相關(guān)的研究報(bào)道非常少見[14-15]，其是否與CPB后肝臟功能變化有內(nèi)在聯(lián)系，需通過進(jìn)一步研究來予以明確。(5)免疫球蛋白：屬于Ig重鏈恒定區(qū)，它在血漿中的增加，是體液免疫功能增強(qiáng)的表現(xiàn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了CPB引起的某些血漿蛋白質(zhì)表達(dá)變化，從功能上分析，它們可能成為CPB中全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)發(fā)生、發(fā)展和消退過程的標(biāo)志物，進(jìn)一步研究它們?cè)贑PB圍術(shù)期的表達(dá)變化規(guī)律，對(duì)今后臨床工作具有重要的參考意義。

[志謝：衷心感謝西農(nóng)生(北京)生物科技有限公司周建軍、張京強(qiáng)二位老師在蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中給予的指導(dǎo)和幫助。]

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Plasma protein differential expression before and after cardiopulmonary bypass*

WangShouyong1,MaLinyu2,WangYing1,ZhangZhou1,DengWeifei1

(1.DepartmentofAnesthesiology;2.DepartmentofHemotology,AffiliatedChildren′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China)

Objective To understand the plasma protein differential expression before and after cardiopulmonary bypass(CPB) through conducting the comparative proteomics study on rats in order to find the plasma markers with potential value in the early diagnosis of CPB resulted complications.Methods 10 adult male SD rats were divided into the experiment group and the control group randomly (n=5),and took food and water freely before operation.The rat models of CPB were constructed in the experiment group.But no any CPB operation was administered in the control group in addition to anesthesia induction,arterial and venous puncture procedure.1 mL of blood sample was extracted for separating plasma before CPB and at the end of CPB in the two groups.The total plasma protein was purified.Then the 2-dimensional electrophoresis and the scanning imaging by ImageScanner were performed.The protein spots verified to be differential expression were performed the cutting,enzymolysis and peptide fragment extraction.Finally the mass spectrometer was adopted to conduct the analysis and identification.Results The number of visualized spots was increased significantly after CPB.17 protein spots with up-regulated expression were identified as differential expression caused by CPB.5 proteins were verified by mass spectrometer analysis and database research.They were gelsolin,haptoglobin,apolipoprotein A-1,immunoglobulin gamma-2b and Ba1-647 respectively.Conclusion CPB can cause the differential expression of plasma proteins in rat model.According to the function analysis,gelsolin,haptoglobin and apolipoprotein A-1 have the potentiality of being the plasma markers for studying CPB complications.

plasma;proteomics;biomarker;cardiopulmonary bypass;models,animal;rats

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.005

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30700785)；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(200704100779)。 作者簡(jiǎn)介：王壽勇(1972-)，副主任醫(yī)師、副教授，博士研究生，主要從事體外循環(huán)并發(fā)癥發(fā)生機(jī)制研究。

R

A

1671-8348(2015)10-1311-03

2014-11-08

2014-12-28)