金釵石斛多糖對(duì)髓系白血病細(xì)胞WT1基因表達(dá)的影響*

葛曉軍，鄭麗梅，王永倫，唐彥萍

(遵義醫(yī)學(xué)院：1.第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科；3.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州遵義 563003)

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金釵石斛多糖對(duì)髓系白血病細(xì)胞WT1基因表達(dá)的影響*

葛曉軍1，鄭麗梅2，王永倫1，唐彥萍3△

(遵義醫(yī)學(xué)院：1.第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科；3.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州遵義 563003)

目的 探討金釵石斛多糖對(duì)髓系白血病細(xì)胞WT1基因表達(dá)的影響。方法 用CCK8方法檢測(cè)金釵石斛多糖在3種白血病細(xì)胞中的IC50值；3種細(xì)胞各分兩組，對(duì)照組和處理組，對(duì)照組細(xì)胞保持正常生長(zhǎng)，處理組給予金釵石斛多糖刺激。Hoechst33258染色檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡情況，用RT-PCR檢測(cè)WT1表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)WT1、P53和BAX蛋白表達(dá)。結(jié)果 金釵石斛多糖在3種白血病細(xì)胞中具有相近的IC50值，HL-60、WEHI-3、K562細(xì)胞的IC50分別為(110.71±6.49)、(104±48.50)、(96.66±5.10)mg/mL，3種細(xì)胞的IC50值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；處理組凋亡率高于對(duì)照組(P<0.05)；與對(duì)照組比較，處理組WT1基因、蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，P53和BAX蛋白表達(dá)增高。結(jié)論 金釵石斛多糖能明顯降低WT1蛋白表達(dá)水平，且對(duì)白血病細(xì)胞有一定殺傷作用。

石斛；多糖；基因，腎母細(xì)胞瘤；白血病

腎母細(xì)胞瘤(wilms tumor，WT1)基因位于染色體11p13位點(diǎn)，研究者早期認(rèn)為該基因?yàn)閃ilms瘤的抑癌基因[1]。然而，隨后越來(lái)越多的研究提示W(wǎng)T1 基因可能作為調(diào)控造血細(xì)胞增生和(或)分化基因的轉(zhuǎn)錄抑制劑或激活劑，并且在白血病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起重要的作用[2-4]。金釵石斛為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是中國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，金釵石斛有益胃生津、延年益壽、抗衰老、抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[5]。它被制成石斛夜光丸等成品藥。金釵石斛的藥用成分主要是石斛堿及多糖類物質(zhì)[6]。多糖類成分是石斛中具有免疫增強(qiáng)作用的活性成分[7]。本研究旨在探討髓系白血病細(xì)胞在金釵石斛多糖干預(yù)下，采用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)WT1基因表達(dá)水平，確定金釵石斛多糖在髓系白血病中的藥用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 急性早幼粒細(xì)胞白血病HL-60，慢性骨髓性白血病細(xì)胞系K-562，骨髓單核細(xì)胞白血病WEHI-3由華西科技園信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。均用RPMI-1640含10% FBS培養(yǎng)；Hoechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒、RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR-greenⅠ試劑盒購(gòu)自TIGEN公司；WT、p53、BAX和內(nèi)參GAPDH單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司。采用水提醇沉的方法提取金釵石斛多糖[8]。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測(cè)金釵石斛多糖對(duì)3種細(xì)胞的IC50分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞HL-60，K-562，WEHI-3重懸于10%小牛血清的PRIM-1640完全培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，置于96孔培養(yǎng)板，每孔4 000個(gè)/100 μL，輕搖混勻，37 ℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h；次日將金釵石斛多糖按10、30、60、100、200、300 mg/L加入各孔內(nèi)，每種細(xì)胞每種濃度各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)48 h；48 h后取出96孔板，每孔按10∶1的比例加入培養(yǎng)基與CCK-8的混合物，同時(shí)在無(wú)細(xì)胞的孔內(nèi)加入該混合物作為空白對(duì)照，在無(wú)菌孵箱中避光培養(yǎng)3 h；用Micro-ELISA儀測(cè)定每個(gè)孔的吸光度值，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm/630 nm；以藥物濃度為橫坐標(biāo)，3個(gè)孔的平均相對(duì)吸光度值為縱坐標(biāo)，觀察各細(xì)胞系的IC50。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 Hoechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3種細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×104個(gè)/ mL，以每孔0.5 mL接種于24孔板，RPMI-1640含10% FBS培養(yǎng)24 h后，分為處理組和對(duì)照組，處理組加入100 mg/kg金釵石斛多糖，對(duì)照組不加藥物處理。24 h后，去除培養(yǎng)液，每孔加入0.5 mL固定液，固定10 min；去除固定液，用PBS清洗2遍，每次清洗3 min，去除液體；加入0.5 mL Hoechst33258染色液，染色5 min，吸盡液體；滴1滴抗熒光猝滅劑于24孔板內(nèi)，熒光顯微鏡觀察。顯微鏡下每組細(xì)胞記數(shù)5個(gè)視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取平均值，計(jì)算凋亡率。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)3組細(xì)胞WT1基因表達(dá)水平 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，用Trizol試劑盒提取對(duì)照組和處理組總RNA，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-80 ℃冰箱或是繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RT-PCR檢測(cè)處理組和對(duì)照組WT1基因表達(dá)水平。WT1基因序列參照 Tamaki等[9]報(bào)道方法，WT1上游引物序列：5′-CCA CAG CAC AGG GTA CGA GAG-3′，下游引物序列：5′-TCT CAG ATG CCG ACC GAT CAA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度152 bp；內(nèi)參基因β-actin上游引物：5′-CGC TGC TTG CCA ATA GTA AT-3′，下游引物：5′-CCA CAG GCA TTG TGA TGG-3′。RT-PCR反應(yīng)條件為：2×SYBR-green mix 20 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板1 μL，用超純水?dāng)U容至40 μL。條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；93 ℃變性45 s；60 ℃退火1 min；72 ℃延伸30 s；共40個(gè)循環(huán),每組DNA內(nèi)參基因、目的基因各3管，同批次擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算定量結(jié)果。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測(cè)WT1蛋白表達(dá)情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照上述分組，藥物作用24 h后提取蛋白，根據(jù)BCA蛋白測(cè)試試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品與loading buffer按1∶1混合后于100 ℃中煮沸5 min；取20～40 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V；濕法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，恒流260 mA，120 min；5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h；PBS稀釋一抗，4 ℃緩慢振蕩孵育過(guò)夜，PBS洗3次，每次10 min；TBST稀釋二抗，于室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次5～10 min，避光；Odyssey紅外熒光檢測(cè)儀掃描。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 3種細(xì)胞系IC50檢測(cè)結(jié)果比較CCK-8測(cè)得3種細(xì)胞在不同藥物濃度下的吸光度值，繪制藥物劑量效應(yīng)曲線，根據(jù)曲線估計(jì)各細(xì)胞系IC50范圍，再以該范圍內(nèi)的藥物濃度處理細(xì)胞，最終測(cè)得HL-60細(xì)胞的IC50為(110.71±6.49)mg/mL，WEHI-3細(xì)胞的IC50為(104±48.50)mg/mL，K562細(xì)胞的IC50為(96.66±5.10)mg/mL，3種細(xì)胞的IC50值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 3種細(xì)胞的金釵石斛多糖IC50值

圖2 Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡(×200)

2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 由于3種白血病細(xì)胞對(duì)金釵石斛多糖的IC50值接近，約為100mg/mL，故在Hoechst33258凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中，處理組均給予100mg/mL金釵石斛多糖處理，對(duì)照組不加藥物。經(jīng)過(guò)Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，染色結(jié)束后，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞，每組細(xì)胞觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞，3種白血病細(xì)胞處理組凋亡率均高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖2。

表1 兩組細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果比較(%)

a：P<0.05，與對(duì)照組比較。

2.3 3種細(xì)胞系在金釵石斛多糖作用下WT1基因及蛋白表達(dá)比較 金釵石斛多糖(100mg/mL)刺激后，3種白血病細(xì)胞處理組WT1基因表達(dá)水平均低于對(duì)照組(圖3)；3種白血病細(xì)胞處理組WT1蛋白表達(dá)降低，凋亡相關(guān)蛋白P53和BAX蛋白表達(dá)增加，見(jiàn)圖4。

a：P<0.05，與對(duì)照組比較。

圖3 兩組細(xì)胞WT1基因表達(dá)比較

-：對(duì)照組；+：處理組。

圖4 兩組細(xì)胞WT1、P53 和BAX蛋白表達(dá)比較

3 討 論

近幾十年來(lái)，WT1基因一直受到研究者和臨床醫(yī)生的關(guān)注，諸多的研究結(jié)果表明，WT1基因與白血病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后和耐藥方面都有相關(guān)性[10]。金釵石斛為蘭科多年生草本植物，是中國(guó)的傳統(tǒng)名貴中藥材，具有極高的藥用價(jià)值。金釵石斛的有效成分主要是石斛多糖和石斛堿，在本研究中，主要探討石斛多糖的藥理活性，多糖是生物有機(jī)體的主要成分之一，維持著生命的主要功能和活動(dòng)，目前的研究指出，多糖可以增強(qiáng)生物體的免疫能力，且具有抗炎、抗腫瘤的作用[11]。本研究所用的金釵石斛產(chǎn)于貴州省赤水市，是國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局批準(zhǔn)的地理標(biāo)志產(chǎn)品，并認(rèn)定金釵石斛為赤水道地藥材。在前期的研究中，本課題組探討了金釵石斛多糖對(duì)炎癥因子脂多糖的作用，最終證明金釵石斛多糖具有抗炎的作用[12]；隨后，在糖尿病研究中，也發(fā)現(xiàn)金釵石斛多糖可以改善糖尿病患者的生存狀態(tài)和緩解患者的癥狀[13]。有研究報(bào)道，大黃多糖、香菇多糖等可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞免疫活性的機(jī)制來(lái)達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的[14]，因此，認(rèn)為金釵石斛多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞應(yīng)該也具有較好的抑制作用。在本研究中，主要探討了金釵石斛多糖對(duì)髓性白血病細(xì)胞的影響，首先通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)，確定金釵石斛在3種白血病細(xì)胞中的IC50值；隨后用100mg/L的金釵石斛多糖刺激白血病細(xì)胞，經(jīng)過(guò)Hoechst33258染色觀察凋亡情況，可以明顯看出，金釵石斛多糖刺激細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡增加；通過(guò)熒光定量PCR和蛋白表達(dá)分析，加入金釵石斛多糖后，白血病細(xì)胞WT1蛋白表達(dá)減低。細(xì)胞凋亡和蛋白分析結(jié)果均表明，金釵石斛多糖對(duì)白血病細(xì)胞具有一定殺傷作用。很多研究都是通過(guò)RT-PCR或是熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)WT1基因的表達(dá)情況[15-16]，嚴(yán)格來(lái)講，這兩種實(shí)驗(yàn)方法只能反映WT1基因的RNA的表達(dá)情況，不能客觀的反映實(shí)際的WT1蛋白表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR和Westernblot兩種技術(shù)來(lái)檢測(cè)WT1蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在金釵石斛多糖刺激后，3種白血病細(xì)胞的WT1表達(dá)減低，且凋亡相關(guān)的蛋白P53和BAX表達(dá)都是增高的，這也支持了Hoechst33258檢測(cè)的凋亡結(jié)果。有研究表明，WT1基因可以通過(guò)上調(diào)bcl-2的表達(dá)水平，來(lái)達(dá)到抗凋亡的目的[17]，在本研究中未見(jiàn)該蛋白表達(dá)。以往的報(bào)道中，WT1作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，不僅可以上調(diào)很多生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平，如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)和胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)等，還可以上調(diào)這些生長(zhǎng)因子的受體表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖速度增加[18]。本研究結(jié)果顯示，金釵石斛多糖可以通過(guò)抑制WT1的表達(dá)水平使白血病細(xì)胞凋亡增多，而WT1是否通過(guò)這些生長(zhǎng)因子或是其受體來(lái)導(dǎo)致腫瘤的惡性增生，金釵石斛是否通過(guò)抑制WT1基因的表達(dá)水平進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤相關(guān)的生長(zhǎng)信號(hào)表達(dá)下調(diào)，以及金釵石斛多糖對(duì)常規(guī)的化療藥物是否具有增敏作用，都需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Study on effect of dendrobium nobile polysaccharides on expression of WT1 gene in myeloid leukemia cells*

GeXiaojun1,ZhengLimei2,WangYonglun1,TangYanping3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospital;2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,FirstAffiliatedHospital;3.DepartmentofMolecularBiologyandBiochemistry,ZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China)

Objective To explore the effect of dendrobium nobile polysaccharides on the expression of the WT 1 gene in myeloid leukemia cells.Methods The CCK8 assay was used to detect the half maximal inhibitory concentration(IC50) of dendrobium nobile polysaccharides in 3 kinds of leukemia cells;the each kind of leukemia cells were divided into the treatment group and the control group.The cells in the control group maintained the normal growth,while which in the treatment group were given the dendrobium nobile polysaccharides stimulation.The Hoechst33258 staining was used to detect the apoptosis situation of the cells in the two groups.The WT l gene expression level was detected by the real-time PCR and the protein expression levels of WT1,53 and BAX were detect the Western blot.Results Dendrobium nobile polysaccharides had the similar IC50values in 3 kinds of myeloid leukemia cells,which were (110.71±6.49),(104±48.50),(96.66±5.10)mg/mL respectively,the difference among them had no statistical significance (P>0.05);the apoptosis rate of the treatment group was higher than that of the control group (P<0.05);the expression levels of WT1 gene and protein in the treatment group were decreased compared with the control group(P<0.05),while the expression of P53 and BAX protein was increased.Conclusion Dendrobium nobile polysaccharides can obviously decrease the expression level of WT1 protein,and has a certain killing effect on myeloid leukemia cells.

dendrobium nobile;polysaccharide;gene,Wilms tumor;leukemia

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.003

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30960509/C190704)。 作者簡(jiǎn)介：葛曉軍(1981-)，主管技師，博士研究生，主要從事白血病發(fā)病原因和耐藥機(jī)制研究?！?/p>

，Tel：13312307061；E-mail：bifeng199421@126.com。

R733.71

A

1671-8348(2015)10-1305-03

2014-10-18

2014-12-15)