谷氨酰胺對梗阻性黃疸大鼠小腸黏膜組織Akt活性的影響

尚海濤，李忠廉，張西波(天津醫(yī)科大學(xué)，天津30000;天津市南開醫(yī)院)

谷氨酰胺對梗阻性黃疸大鼠小腸黏膜組織Akt活性的影響

尚海濤1，李忠廉2，張西波2
(1天津醫(yī)科大學(xué)，天津300100;2天津市南開醫(yī)院)

摘要:目的觀察梗阻性黃疸大鼠小腸組織中蛋白激酶B(Akt)活性，探討谷氨酰胺腸保護(hù)的作用機(jī)制。方法將64只SD大鼠隨機(jī)分為4組各16只，模型組、甘氨酸組、谷氨酰胺組行梗阻性黃疸造模，假手術(shù)組游離上段膽總管后關(guān)腹;造模后1d，甘氨酸組、谷氨酰胺組均給予同等熱量的腸內(nèi)營養(yǎng)劑灌胃，同時(shí)分別給予甘氨酸、谷氨酰胺1 g/(kg·d)，模型組、假手術(shù)組給予等量生理鹽水灌胃。各組分別于術(shù)后第3、7天處死大鼠8只，采用Western blotting法檢測小腸組織Akt總蛋白及p-Akt，實(shí)時(shí)PCR檢測腸組織AktmRNA。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組、甘氨酸組、谷氨酰胺組術(shù)后第3、7天小腸組織中AktmRNA及p-Akt蛋白增加，且谷氨酰胺組高于模型組、甘氨酸組，P均＜0.05;模型組、甘氨酸組間比較，P均＞0.05。各組小腸組織Akt總蛋白比較，P均＞0.05。結(jié)論谷氨酰胺通過促進(jìn)Akt信號通路的活化，發(fā)揮對小腸上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞:梗阻性黃疸;小腸黏膜;谷氨酰胺;蛋白激酶B;腸內(nèi)營養(yǎng);大鼠

Effect of glutamine on Akt activity in small intestinemucosa of rats with obstructive jaundice

SHANG Hai-tao1，LI Zhong-lian，ZHANG Xi-bo
(1 Tianjinmedical University，Tianjin 300100，China)

Abstract:Objective To observe the activity changes of protein kinase B(Akt)in the small intestine of rats with obstructive jaundice，and to investigate themechanism of glutamine in intestinal protection.Methods Sixty-four SD rats were randomlydivided into four groups，16 rats in each group.The obstructive jaundicemodels weremade in the groups A，B and C.After freeing the upper common bileduct and then we closed the abdomen of rats in the groupd.Oneday aftermodeling，rats in the groups B and C were given the same amount of heat enteral nutrition by gavage，and at the same time，the glycine and glutamine 1 g/(kg·d)was added.Rats in the groups A andd were given the same volume of normal saline by gavage.Eight rats were sacrificed atday 3 and 7 after surgery.Western blotting was used todetect the small intestine tissue’s total protein of Akt and p-Akt，RT-PCRmethod was used todetect AktmRNA of intestine tissue.Results Compare with groupd，the AktmRNA and p-Akt protein was increased atday 3 and 7 after surgery in the groups A，B and C，and group C was higher than groups A and B(all P＜0.05).No significantdifference was found between group A and group B(all P＞0.05).No significantdifference was found in Akt total protein of small intestine among these groups(all P＞0.05).Conclusion The glutamine protects the epithelial cells of small intestine by promoting the activation of Akt signaling pathway.

Key words:obstructive jaundice; small intestinemucosa; glutamine; protein kinase B; enteral nutrition; rats

研究表明，梗阻性黃疸可致腸黏膜屏障功能障礙，繼而引起腸道細(xì)菌易位［1］，從而發(fā)生腸源性內(nèi)毒素血癥［2］。谷氨酰胺可維護(hù)腸黏膜的正常結(jié)構(gòu)和功能［3］，但其具體保護(hù)機(jī)制尚不完全清楚。2014 年4～12月，我們觀察了早期腸內(nèi)補(bǔ)充谷氨酰胺對梗阻性黃疸大鼠小腸組織蛋白激酶B(Akt)活性的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其腸保護(hù)的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料成年雄性SD大鼠64只，體質(zhì)量250～280 g，由天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所動物研究

中心提供;谷氨酰胺(安凱舒，重慶藥友醫(yī)藥有限公司)，腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液(能全力，Nutricia公司)，甘氨酸(Sigma公司);低溫臺式高速離心機(jī)(Eppendorf 5415R，Germany)，蛋白電泳槽、蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)，BCA蛋白定量試劑盒(Pierce Rockford，USA);兔抗大鼠Akt抗體、兔抗大鼠p-Akt抗體(Cell Signaling Tech，USA)，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京)。

1.2模型制作及干預(yù)將64只大鼠隨機(jī)分為四組各16只，模型組、甘氨酸組、谷氨酰胺組按張西波等［4］的方法制作梗阻性黃疸模型，假手術(shù)組游離上段膽總管后關(guān)腹。造模后1天，甘氨酸組、谷氨酰胺組均給予同等熱量的能全力灌胃，同時(shí)分別給予甘氨酸、谷氨酰胺1 g/(kg·d)。每日總熱量731.5 kJ/kg［5］，分3～5次給予，期間自由飲水。模型組、假手術(shù)組給予等量生理鹽水灌胃。各組于術(shù)后第3、7天，分別處死大鼠8只;取末段回腸4 cm，液氮速凍，－80℃冰箱儲存。

1.3小腸組織Akt總蛋白及p-Akt蛋白檢測采用Western blotting法。取小腸組織70mg，按說明書進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE垂直凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜; TBS室溫封閉洗膜后加Akt一抗、二抗處理，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光顯影，以GAPDH作為對照。用BOI-RAD Chemodoc XRS凝膠成像系統(tǒng)及Image J v1.42圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與對照蛋白條帶灰度比值表示目的蛋白表達(dá)量。

1.4小腸組織AktmRNA檢測采用實(shí)時(shí)PCR法。用TaKaRa公司提供的試劑提取RNA，轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用SYBR GreenⅠ熒光染料嵌合法，分別擴(kuò)增目的基因Akt和管家基因βactin，通過比較目的基因和管家基因進(jìn)行定量。Akt上游引物5'-GAGGTTGCCCACACGCTTA-3'，下游引物5'-GGCGTACTCCATGACAAAGCAG-3';β-actin上游引物5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游引物5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'。反應(yīng)條件: 95℃5min; 95℃30 s，60℃1min，共45個循環(huán); 60～95℃10 s，退火溫度為60℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)和Quantity one軟件進(jìn)行圖像分析。計(jì)算Akt與β-actin灰度比值，以此表示其mRNA相對表達(dá)量［6］。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，各組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1小腸組織Akt總蛋白及p-Akt蛋白表達(dá)各組小腸組織Akt總蛋白及p-Akt蛋白比較見表1。2.2小腸組織AktmRNA相對表達(dá)各組小腸組織AktmRNA相對表達(dá)比較見表2。

表1　各組小腸組織Akt總蛋白及p-Akt蛋白表達(dá)比較(n =8，)

表1　各組小腸組織Akt總蛋白及p-Akt蛋白表達(dá)比較(n =8，)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05，※P ＜0.01;與甘氨酸組比較，△P＜0.05，☆P＜0.01。

組別　Akt總蛋白p-Akt 蛋白3d　7d3d　7d模型組　110.23±12.04 115.97±12.54　58.24±8.88*　62.55±10.41*甘氨酸組　108.56±9.31 105.12±13.24　51.12±7.86*　66.59±7.92*谷氨酰胺組　109.17±16.27 103.76±9.81　76.89±10.22* #△88.32±11.14＊※☆假手術(shù)組　112.23±9.04 107.12±8.09　43.33±4.91　49.82±6.15

表2　各組小腸組織AktmRNA相對表達(dá)量比較(n =8，)

表2　各組小腸組織AktmRNA相對表達(dá)量比較(n =8，)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05;與甘氨酸組比較，△P＜0.05。

組別AktmRNA 3d　7d模型組　3.75±0.11*　3.67±0.03*甘氨酸組　4.56±0.09*　4.98±0.13* #谷氨酰胺組　6.16±0.15* #△　6.62±0.09* #△假手術(shù)組1.45±0.07　1.52±0.11

3　討論

Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為細(xì)胞的主要存活通路，參與腸上皮細(xì)胞的增殖。既往研究表明，Akt是激活NF-κB的上游分子，而NF-κB是LPS所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的下游通路，活化的NF-κB可誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)［7］。

谷氨酰胺是血液循環(huán)和組織中含量最豐富的一種氨基酸［8］，是腸黏膜增生的細(xì)胞的主要能量來源［9］。既往研究表明，谷氨酰胺可從保護(hù)腸黏膜屏障、調(diào)節(jié)腸免疫功能以及抗氧化等方面起到腸保護(hù)作用［10］;適當(dāng)劑量谷氨酰胺腸內(nèi)營養(yǎng)，可加快腸上皮細(xì)胞增值，抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，阻止腸黏膜萎縮及炎癥所致的通透性增加。研究發(fā)現(xiàn)，梗阻性黃疸發(fā)生時(shí)p-Akt蛋白表達(dá)水平增高，考慮為梗阻性黃疸后的應(yīng)激反應(yīng)［11］。本研究顯示，谷氨酰胺組小腸組織AktmRNA及p-Akt蛋白增高較A、甘氨酸組更明顯。推斷谷氨酰胺是通過激活A(yù)kt信號途徑后，從而引活其下游分子而發(fā)揮腸保護(hù)作用。研究證實(shí)，谷氨酰胺不僅是蛋白質(zhì)合成的底物，還是促進(jìn)mRNA翻譯和蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)因子［12］;mori等［13］發(fā)現(xiàn)，危重患者早期感染狀態(tài)下應(yīng)用谷氨酰胺，即可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成;術(shù)后給予富含谷氨酰胺二肽的全胃腸外營養(yǎng)后第3天可以顯著抑制其累計(jì)氮平衡［14］。在膿毒癥、全胃切除術(shù)及燒傷患者等的研究中發(fā)現(xiàn)，給予谷氨酰胺后可顯著抑制血漿中前白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的下降［15］。由此可見，谷氨酰胺不

但能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，還可抑制蛋白質(zhì)降解。

綜上所述，谷氨酰胺可通過活化梗阻性黃疸時(shí)小腸Akt信號通路，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖，修復(fù)腸黏膜，保護(hù)腸屏障功能。

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·基礎(chǔ)研究·

收稿日期:( 2015-03-12)

通信作者簡介:李忠廉(1963-)，男，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)楦闻K、膽道、胰腺等腹部疾病的臨床與基礎(chǔ)工作。E-mail: nkyylzl@163.com

作者簡介:第一尚海濤(1978-)，男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)楦鞣N膽道、胰腺疾病的治療和臨床研究。E-mail: nkyysht@126.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273952)。

文章編號:1002-266X(2015)36-0021-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R657.4

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.007