柚皮素脂質(zhì)體凍干粉的制備及其藥效學(xué)評價

季　鵬，趙文明

遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州 121000

?

柚皮素脂質(zhì)體凍干粉的制備及其藥效學(xué)評價

季鵬，趙文明

遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州 121000

摘要：目的制備柚皮素脂質(zhì)體凍干粉，并觀察其對急性肺損傷(ALI)大鼠模型的治療效果。方法乙醇注入法制備柚皮素脂質(zhì)體并進(jìn)行質(zhì)量評價，加入凍干保護(hù)劑甘露醇(5%，W/V)，凍干并進(jìn)行相關(guān)粉體學(xué)評價。大鼠氣管噴注脂多糖(LPS)(5 mg/kg)制備急性肺損傷模型，將48只SD雌性大鼠隨機(jī)分成6組(n=8)，分別為空白對照組(A組)、模型組(B組)、柚皮素原料藥+LPS組(C組)、脂質(zhì)體凍干粉+LPS組(D組)、地塞米松+LPS組(E組)和空白脂質(zhì)體凍干粉+LPS組(F組)，光學(xué)顯微鏡觀察給藥后各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變，并測定肺組織濕/干重比。結(jié)果最佳處方制得的柚皮素脂質(zhì)體包封率為(82.44±0.98)%，平均粒徑為(133±11)nm，Zeta電位為(-35.9±5)mV。凍干粉的休止角為36°，堆密度為0.3 g/ml。光鏡觀察結(jié)果顯示，與A組空白對照比較，B～F組肺組織均出現(xiàn)不同程度炎性細(xì)胞的浸潤、毛細(xì)血管充血、出血和肺泡壁增厚，其中以B組和F組改變最為顯著，C組次之，D組和E組最輕。LPS誘導(dǎo)后B~F組肺組織濕/干重比均有不同程度增加，但D組和E組濕/干重比的增加量明顯低于B組(P=0.0012，P=0.0018)。結(jié)論乙醇注入法制備柚皮素脂質(zhì)體工藝簡單可行，其凍干粉對大鼠急性肺損傷療效顯著。

關(guān)鍵詞：柚皮素；脂質(zhì)體；冷凍干燥；急性肺損傷

ActaAcadMedSin，2015,37(2)：208-214

柚皮素(4’，5，7-三羥基二氫黃酮)是一類天然二氫黃酮類化合物。該類物質(zhì)廣泛存在于水薄荷[1]、大戟屬植物[2]、枳實(shí)[3]等植物中。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，柚皮素具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗肺損傷等作用[4]。但是，由于柚皮素水溶性較差、口服生物利用度較低以及體內(nèi)半衰期短，限制了其臨床應(yīng)用。據(jù)文獻(xiàn)報道柚皮素在兔體內(nèi)的生物利用度以游離柚皮素計算僅為4%[5]。目前，制備柚皮素合適的制劑，提高其生物利用度是藥劑學(xué)工作者亟待解決的問題。脂質(zhì)體是一種具有類似生物膜結(jié)構(gòu)的雙分子層囊泡，主要由磷脂和膽固醇構(gòu)成，其作為藥物載體具有很多優(yōu)勢，如可以增加藥物的溶解性，提高藥物的生物利用度和減少藥物的治療劑量等。目前，國內(nèi)外柚皮素脂質(zhì)體的相關(guān)研究報道較少，本研究采用乙醇注入法制備柚皮素脂質(zhì)體，再經(jīng)冷凍干燥制備成柚皮素粉霧劑，測定該脂質(zhì)體及其凍干粉的理化性質(zhì)；同時，通過建立大鼠急性肺損傷(acute lung injury，ALI)模型，觀察柚皮素游離藥的藥效學(xué)特性，為柚皮素治療急性肺損傷提供實(shí)驗數(shù)據(jù)。

材料和方法

材料SPF級SD雌性大鼠48只，體重(180～220)g，平均體重(200±20)g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心提供，實(shí)驗前動物適應(yīng)環(huán)境至少3 d。室溫保持在25 ℃，自由進(jìn)食和飲水。柚皮素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，南京康維盛生物技術(shù)有限公司)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(美國Sigma公司)；大豆卵磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司，批號：20130427)；甲醇和乙腈為色譜純；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或藥用。L- 2000Elite型高效液相色譜儀(日立高新技術(shù)公司)；TU- 1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Mastersizer2000激光粒度測定儀(英國Malvern公司)；JEM- 1400高襯度透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)；LGJ- 30F型冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)。

柚皮素脂質(zhì)體的處方優(yōu)化根據(jù)預(yù)實(shí)驗和單因素考察，篩選出磷脂濃度(g/ml)、柚皮素和磷脂重量比(簡稱藥脂比)(W/W)、緩沖液pH值、溶解溫度(℃)為主要考察因素，每個因素又選取3個水平，以包封率為評價指標(biāo)，L9(34)正交試驗法優(yōu)化脂質(zhì)體的制備。

乙醇注入法制備柚皮素脂質(zhì)體按最優(yōu)處方，精密稱取柚皮素原料藥3 mg，大豆磷脂60 mg和膽固醇20 mg溶于適量的乙醇中，在渦旋條件下將所得混合液迅速注入55 ℃的10 ml 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(pH=7.4)溶液中，超聲1 min后倒入小燒杯，在磁力攪拌器上攪拌30 min，除去少量乙醇，得到淡藍(lán)色混懸液，過0.45 μm微孔濾膜，即得柚皮素脂質(zhì)體，4 ℃下保存，備用。空白脂質(zhì)體除不加藥物外，其他條件一樣。

脂質(zhì)體含量測定精密稱取柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加入到50 ml容量瓶中，乙醇稀釋定容，得到0.1 mg/ml的儲備液。乙醇逐步稀釋成質(zhì)量濃度為 1、5、10、20、40、80 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用高效液相色譜法測定。

色譜條件：色譜柱為Hypersil BDS C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(40∶60)；檢測波長288 nm；柱溫40 ℃；流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量20 μl。

專屬性實(shí)驗：加入適量甲醇破乳，55 ℃恒溫?fù)u床振蕩15 min，得到澄清透明溶液即可。分別取空白脂質(zhì)體破乳后溶液(α)、柚皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液(β)以及柚皮素脂質(zhì)體破乳后溶液(γ)，0.45 μm濾膜過濾后取濾液20 μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。

藥物含量的測定：取2 ml脂質(zhì)體混懸液于10 ml容量瓶中，加甲醇適量破乳，超聲約5 min使澄清后，甲醇稀釋至刻度，0.45 μm濾膜過濾后取濾液20 μl進(jìn)樣，按上述色譜條件測定樣品峰面積，計算藥物含量。

脂質(zhì)體包封率的測定采用微型凝膠柱離心法[6]。精密稱取脂質(zhì)體混懸液2 ml于10 ml量瓶中，加甲醇適量破乳，超聲5 min，澄清后甲醇稀釋至刻度，進(jìn)樣，計算總的藥物含量(W0)。取2 ml加至Sephadex G- 50凝膠微柱的頂端后離心3 min(2000 r/min，離心半徑為6.1 cm)，再加入PBS 0.5 ml離心3 min(2500 r/min，離心半徑為6.1 cm)，收集洗脫液于10 ml量瓶中，重復(fù)2次，加入適量甲醇超聲破乳，后用甲醇稀釋至刻度，進(jìn)樣，計算藥物的質(zhì)量濃度(W1)。根據(jù)公式計算包封率(EE%)：EE%=W1/W0× 100%。式中，W1為包封在脂質(zhì)體中的柚皮素質(zhì)量濃度；W0為脂質(zhì)體中柚皮素的總質(zhì)量濃度。

初步穩(wěn)定性考察取柚皮素脂質(zhì)體混懸液3批，在(4±2)℃條件下放置 2個月，分別于0、1、2個月末取樣并觀察外觀，用納米激光粒度儀測量粒徑，用微型凝膠柱離心法測量包封率。

脂質(zhì)體凍干粉的制備及質(zhì)量考察在脂質(zhì)體制備過程中，先將5%(W/V)甘露醇作為凍干保護(hù)劑溶解于PBS溶液中，其他過程不變，將制得的柚皮素脂質(zhì)體混懸液用移液管分裝于西林瓶中，凍干即可。

凍干粉相關(guān)性質(zhì)測定：柚皮素凍干粉的休止角、堆密度測定參考第7版《藥劑學(xué)》[7]。

脂質(zhì)體凍干前后的形態(tài)觀察：取柚皮素脂質(zhì)體混懸液適量，以水為分散介質(zhì)稀釋約10倍，滴于銅網(wǎng)上用2%磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，透射電鏡下觀察其形態(tài)；取柚皮素凍干粉樣品適量，加PBS溶液適量，振搖至完全分散，同上觀察。

粒徑和Zeta電位的測定：取100 μl柚皮素脂質(zhì)體凍干前后混懸液用水稀釋至10 ml后，用納米激光粒度儀測定粒徑和Zeta電位。

動物模型的建立及分組用氣管內(nèi)噴注脂多糖(5 mg/kg)建立大鼠ALI模型[8]。將48只SD雌性大鼠隨機(jī)分成6組，每組8只，分別為空白對照組(A組，氣管內(nèi)噴注生理鹽水)、模型組(B組，氣管內(nèi)噴注LPS)、柚皮素原料藥+LPS組(C組，氣管內(nèi)噴注LPS前1 h給予柚皮素100 mg/kg，臨用前加適量生理鹽水分散)、柚皮素脂質(zhì)體凍干粉+LPS組(D組，氣管內(nèi)噴注LPS前1 h給予柚皮素脂質(zhì)體凍干粉100 mg/kg)，地塞米松+LPS組(E組，氣管內(nèi)噴注LPS前1 h給予地塞米松5 mg/kg)、空白脂質(zhì)體凍干粉+LPS組(F組，氣管內(nèi)噴注LPS前1 h給予空白脂質(zhì)體凍干粉100 mg/kg)。每一組注射完后7 h時，用3%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠并解剖，取肺組織測定指標(biāo)。

肺組織評價指標(biāo)處死大鼠解剖取出左肺組織，以4%的多聚甲醛固定，常規(guī)脫水包埋蘇木素-伊紅(HE)染色后，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變[9]。同時取出右上肺葉，立即稱濕重，再在80 ℃下加熱48 h稱干重，計算濕/干重比。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

柚皮素脂質(zhì)體優(yōu)化處方的確定采用4因素3個水平(表 1)，根據(jù)極差 R可知，各因素對包封率的影響大小依次為：磷脂濃度>藥脂比>溶解溫度>緩沖液 pH值。再根據(jù)均值K，可以確定乙醇注入法制備柚皮素脂質(zhì)體的最佳處方工藝組合為磷脂的質(zhì)量濃度為0.06 g/ml，藥脂比為1∶20，類脂溶液的溶解溫度為55 ℃，緩沖液pH值為7.40(表2)。

柚皮素脂質(zhì)體含量及包封率經(jīng)高效液相色譜法測得的柚皮素峰面積(A)對質(zhì)量濃度(C，μg/ml)進(jìn)行線性回歸，得到柚皮素的回歸方程為A=29.95 C+1.13(n=3，r=0.9995)。即柚皮素質(zhì)量濃度在1～80 μg/ml內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。低、中、高濃度的回收率分別為100.87%、98.23%和99.16%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)=1.34%(n=3)。平均日內(nèi)、日間RSD分別為0.20%、0.54%(n=3)。專屬性測定結(jié)果可見柚皮素峰值(圖1)。按最優(yōu)處方，測得脂質(zhì)體中柚皮素質(zhì)量濃度為(287.75±0.23)μg/ml(n=3)，柚皮素脂質(zhì)體的包封率為(82.44±0.98)%，RSD為0.64%(n=3)。

表 1　柚皮素脂質(zhì)體處方篩選正交試驗因素水平

表 2　L9(34)正交實(shí)驗結(jié)果

1：柚皮素

1：naringenin

圖 1空白脂質(zhì)體(A)、柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品(B)、柚皮素脂質(zhì)體(C)的高效液相色譜圖

Fig 1High performance liquid chromatography of liposome without naringenin(A)，standard substance of naringenin(B)，naringenin-loaded liposome(C)

脂質(zhì)體凍干前后的粒徑、Zeta電位凍干前脂質(zhì)體平均體粒徑為(133±11)nm，表面帶負(fù)電，Zeta電位為(-35.9±5)mV。凍干后脂質(zhì)體平均體粒徑為(151±17)nm，Zeta電位為(-26.3±1)mV，凍干粉復(fù)溶后粒徑有所變大，電位有所降低。

脂質(zhì)體凍干前后的形態(tài)觀察脂質(zhì)體凍干前后，脂質(zhì)體均多為球形及類球形粒子，粒徑較小，外觀圓整，分布均勻(圖2)。

脂質(zhì)體凍干粉的外觀、流動性及再分散性柚皮素脂質(zhì)體為帶有淡藍(lán)色乳光的混懸液(圖3A)，經(jīng)冷凍干燥后呈白色疏松粉末(圖3B)，測得休止角為36°，流動性較好；量筒法測得凍干粉堆密度為0.3 g/ml；凍干粉加入PBS溶液后重新分散較好，呈淡藍(lán)色透明混懸液(圖3C)。

A.柚皮素脂質(zhì)體混懸液；B.柚皮素脂質(zhì)體凍干粉再分散后得到的混懸液

A. naringenin liposomal suspension；B.naringenin lyophilized liposomal suspension obtained after redispersion

圖 2柚皮素脂質(zhì)體透射電鏡照片

Fig 2Transmission electron microscope photo of naringenin liposomes

初步穩(wěn)定性柚皮素脂質(zhì)體低溫放置2個月，結(jié)果顯示0、1、2個月的平均包封率分別為82.13%、81.42%、81.04%；粒徑分別為131.2、147.3、151.3 nm。

肺組織外觀及評價光鏡觀察結(jié)果顯示，與A組空白對照比較，B～F組肺組織均出現(xiàn)不同程度炎性細(xì)胞的浸潤、毛細(xì)血管充血、出血和肺泡壁增厚，其中以B組和F組改變最為顯著，C組次之，D組和E組最輕(圖4)。

肺組織濕/干重比與A組(2.36±0.24)相比，濕/干重比在B組(5.08±0.32，P=0.0001)和F組(5.02±0.15，P=0.0001)顯著增加；與B組(5.08±0.32)相比，C組(4.13±0.27，P=0.037)濕/干重比增加的量被抑制，而D組(2.82±0.25，P=0.0012)和E組(2.76±0.21，P=0.0018)濕/干重比增加的量被顯著抑制。

A.柚皮素脂質(zhì)體混懸液；B.柚皮素脂質(zhì)體凍干粉；C.柚皮素脂質(zhì)體凍干粉再分散得到的混懸液

A.naringenin liposome suspension；B.lyophilized powder of naringenin liposome; C.re-suspension of naringenin lyophilized powder

圖 3柚皮素制劑外觀形態(tài)比較

Fig 3Comparison of different naringenin formulations

LPS：脂多糖

LPS：lipopolysaccharide

A.空白組；B.模型組；C.柚皮素原料藥+LPS組(100 mg/kg)；D.脂質(zhì)體凍干粉+LPS組(100 mg/kg)；E.地塞米松+LPS組(5 mg/kg)；F.空白脂質(zhì)體凍干粉+LPS組(100 mg/kg)

A.control group；B.model group；C.naringenin+LPS group(100 mg/kg)；D.lyophilized liposome+LPS group(100 mg/kg)；E.dexamethasone+LPS group(5 mg/kg)；F.blank lyophilized liposome+LPS group(100 mg/kg)

圖 4各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果(× 200)

Fig 4The results of hematoxylin-eosin staining of rat lung tissues in different groups(× 200)

討論

柚皮素是柚皮甙的甙元，屬二氫黃酮類化合物，在抗菌、抗炎、抗腫瘤等方面具有較強(qiáng)的生物活性。柚皮素的生物活性主要與其對血漿和肝臟中代謝酶的作用相關(guān)[4]。柚皮素治療急性肺損傷的作用機(jī)制可能與其能治療急性肺損傷所引起的炎癥有關(guān)。

徐新榮等[10]制備了柚皮素β-環(huán)糊精包合物，增加了柚皮素水溶性，但制備工藝復(fù)雜、粒徑較大，不適合肺部給藥；王章姐等[11]采用Box-Behnken設(shè)計—效應(yīng)面法優(yōu)化處方并制備了柚皮素自微乳，提高了藥物溶解度和腸滲透性，但穩(wěn)定性不好，輔料PEG- 400等對胃腸有刺激作用，限制了其臨床應(yīng)用發(fā)展。脂質(zhì)體是由脂類材料形成的具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡，類似于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的雙分子層[12]。由于其特殊的結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)體作為藥物遞送系統(tǒng)使用時具有一些優(yōu)勢，如提高藥物的穩(wěn)定性，增強(qiáng)水難溶性藥物的生物利用度，持續(xù)或控制藥物釋放，具有優(yōu)異的生物降解性和細(xì)胞親和性等[13- 15]。劉曉旭等[16]用薄膜分散—冷凍干燥法制備鴉膽子油脂質(zhì)體，其體內(nèi)外抑制癌細(xì)胞的能力均優(yōu)于市售鴉膽子油乳注射液；張?zhí)m等[17]采用銅離子梯度法制備鹽酸米托蒽醌脂質(zhì)體，藥效實(shí)驗結(jié)果表明，鹽酸米托蒽醌脂質(zhì)體可顯著延長荷瘤鼠的生存時間，且毒性小于鹽酸米托蒽醌游離藥?？梢?，把藥物制成脂質(zhì)體給藥，可明顯提高藥效和生物利用度。

本研究選擇乙醇注入法制備脂質(zhì)體，簡單快速、條件溫和、不易使藥物成分變性、不使用高壓均質(zhì)和超聲等耗能手段，避免了藥物的污染和磷脂雙分子層的破壞。處方中加入的少量無水乙醇在制劑成型后加熱攪拌一定時間即可揮發(fā)除去，避免了殘留有機(jī)溶劑的潛在毒性。脂質(zhì)體混懸液理化性質(zhì)不穩(wěn)定，在貯存過程中可能發(fā)生粒徑增長和藥物泄漏，為方便將其制備成其他劑型，通常需要冷凍干燥。本研究先將柚皮素制備成脂質(zhì)體混懸液，加入凍干保護(hù)劑進(jìn)一步制備成粉霧劑，用于吸入治療急性肺損傷。一般來說，Zeta電位(絕對值)越高，脂質(zhì)體分散體系的穩(wěn)定性就越好[18]。本研究制得脂質(zhì)體和凍干粉復(fù)溶液平均電位分別為-35.9 mV和-26.3 mV，表明體系較為穩(wěn)定。復(fù)溶后電位絕對值變小可能與加入凍干保護(hù)劑有關(guān)。透射電鏡照片進(jìn)一步表明所制得的柚皮素脂質(zhì)體分布較均勻，粒徑較小，穩(wěn)定性好。

最新調(diào)查表明，全世界每100 000人有1.5～75例ALI患者，死亡率高達(dá)35%～40%[19]。急性肺損傷是由直接傷害肺或通過全身性的炎癥過程開始[20]，其特征一般表現(xiàn)為：毛細(xì)血管通透性增加、間質(zhì)和肺泡水腫、炎癥介質(zhì)釋放、廣泛的中性粒細(xì)胞浸潤[21]。LPS氣管內(nèi)給藥已被廣泛認(rèn)為是一種理想的且可重復(fù)的急性肺損傷模型構(gòu)建方法而被應(yīng)用于相關(guān)研究中[22]。濕/干重比對肺水腫的評估十分重要[23]，本研究表明柚皮素脂質(zhì)體凍干粉可明顯降低脂多糖誘導(dǎo)的肺水腫。光鏡觀察證實(shí)，與空白對照組比較，LPS誘導(dǎo)模型組的肺切片形態(tài)學(xué)特性發(fā)生了明顯變化，包括炎性細(xì)胞的浸潤、毛細(xì)血管充血、出血和肺泡壁顯著增厚，表明脂多糖誘導(dǎo)造模成功。空白脂質(zhì)體凍干粉+LPS組的肺組織切片形態(tài)與模型組類似，表明空白脂質(zhì)體對急性肺損傷無治療作用。相反，當(dāng)增加柚皮素或地塞米松后，肺泡毛細(xì)血管充血擴(kuò)張、炎癥細(xì)胞浸潤和局灶性肺間隔增寬均較模型組有所減輕和緩和，符合藥理學(xué)特點(diǎn)[6]，其中柚皮素脂質(zhì)體凍干粉的療效接近地塞米松，遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于原料藥。本研究引入普遍接受的對脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷有很好療效的地塞米松做為對照，有利于進(jìn)一步評估柚皮素脂質(zhì)體凍干粉的藥效。地塞米松組和脂質(zhì)體凍干粉組治療效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明制備成脂質(zhì)體能極大地提高藥物生物利用度，增強(qiáng)藥效。肺組織病理切片和干濕重比結(jié)果表明，將柚皮素制備成脂質(zhì)體混懸液克服了其水溶性差的缺點(diǎn)，提高了制劑穩(wěn)定性，并直接作用于病灶部位，對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷有很好的保護(hù)作用，療效明顯好于柚皮素原料，為臨床研究提供了新思路。

綜上，本研究采用乙醇注入法制備了包封率高、載藥量大、粒徑分布均勻的柚皮素脂質(zhì)體混懸液，采用冷凍干燥制備得到凍干粉。凍干粉流動性好，質(zhì)輕，適合于肺部給藥。加入PBS溶液后粉霧劑能夠迅速分散成混懸液，其性質(zhì)與凍干前脂質(zhì)體混懸液相比，無明顯變化。藥效學(xué)實(shí)驗表明柚皮素脂質(zhì)體凍干粉對急性肺損傷療效遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于原料藥，為今后可能的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Olsen HT，Stafford GI，van Staden J，et al. Isolation of the MAO-inhibitor naringenin from Mentha aquatica L [J].J Ethnopharmacol，2008，117(3)：500- 502.

[2]Batrakova EV，Li S，Alakhov VY，et al. Sensitization of cells overexpressing multidrug-resistant proteins by pluronic P85 [J].Pharm Res，2003，20(10)：1581- 1590.

[3]Zhou DY，Xu Q，Xue XY，et al. Rapid qualitative and quantitative analyses of flavanone aglycones in Fructus aurantii by HPLC ion-trap MS [J].J Sep Sci，2007，30(6)：858- 867.

[4]張?zhí)熘?，馬春華，樊湘澤.柚皮素對脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用研究 [J].中藥藥理與臨床，2013，29(6)：30- 31.

[5]馬燕，林寶琴，李衛(wèi)中，等.柚皮素大鼠在體腸吸收動力學(xué)的研究 [J].中成藥，2012，34(8)：1487- 1491.

[6]龔素娟，蔣艷博，楊琳琳，等.冬凌草甲素脂質(zhì)體的制備及其影響因素考察 [J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2010，27(2)：87- 92.

[7]崔福德.藥劑學(xué) [M].7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：94- 100.

[8]Sua ZQ，Moa ZZ，Liao JB，et al. Usnic acid protects LPS-induced acute lung injury in mice through attenuating inflammatory responses and oxidative stress [J].Int Immunopharmacol，2014，22(8)：371- 378.

[9]Ahmet G，Umit N，Burhan A，et al. Protective effects of methylisothiourea sulfate on different aspiration materials-induced lung injury in rats [J].Int J Pediat Otorhinolaryngol，2008，72(8)：1241- 1250.

[10]徐新榮，于海濤，杭麗，等.柚皮素β-環(huán)糊精包合物的制備及對模型大鼠脈絡(luò)膜新生血管形成的抑制作用 [J].中國藥房，2014，25(11)：981- 983.

[11]王章姐，胡容峰，王國凱，等.Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化柚皮素自微乳給藥系統(tǒng) [J].中草藥，2014，45(17)：2461- 2466.

[12]Sessa G，Weissmann G.Phospholipid spherules(liposomes)as a model for biological membranes [J].J Lipid Res，1968，9(3)：310- 318.

[13]Mohammed AR，Weston N，Coombes AG，et al. Liposome formulation of poorly water soluble drugs：optimization of drug loading and ESEM analysis of stability [J].Int J Pharm，2004，85(2)：23- 34.

[14]Kim CK，Han JH.Lymphatic delivery and pharmacokinetics of methotrexate after intramuscular injection of differently charged liposome-entrapped methotrexate to rats [J].J Microencapsul，1995，12(4)：437- 446.

[15]Samad A，Sultana Y，Aqil M.Liposomal drug delivery systems：an update review [J].Curr Drug Deliv，2007，4(4)：297- 305.

[16]劉曉旭，倪睿，劉建平.鴉膽子油脂質(zhì)體凍干粉的制備及其藥效學(xué)評價 [J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2009，40(1)：37- 40.

[17]張?zhí)m，杜艷玲，劉勛濤，等.鹽酸米托蒽醌脂質(zhì)體的制備及藥效學(xué)、藥動學(xué)研究 [J].中國藥學(xué)雜志，2013，48(17)：1283- 1287.

[18]Bai GZ，Yu HT，Ni YF，et al. Shikonin attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice [J].J Surg Res，2013，182(2)：303- 311.

[19]Wheeler AP，Bernard GR.Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome：a clinical review [J].Lancet，2007，369(9572)：1553- 1564.

[20]Griffith B，Pendyala S，Hecker L，et al. NOX enzymes and pulmonary disease [J].Antioxid Redox Signal，2009，11(10)：2505- 2516.

[21]Zhang X，Huang H，Yang T，et al. Luo chlorogenic acid protects mice against lipopolysaccharide-induced acute lung injury [J].Injury，2010，41(7)：746- 752.

[22]Chen X，Yang X，Liu T，et al. Kaempferol regulates MAPKs and NF-kappaB signaling pathways to attenuate LPS-induced acute lung injury in mice [J].Int Immunopharmacol，2012，14(2)：9- 16.

[23]Zhang B，Liu ZY，Li YY，et al. Antiinflammatory effects of matrine in LPS-induced acute lung injury in mice [J].Eur J Pharm Sci，2011，44(5)：573- 579.

·論著·

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.02.012

Preparation and Pharmacodynamic Evaluation of Naringenin Lyophilized Liposome

JI Peng，ZHAO Wen-ming

College of Pharmacy of Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning 121000，China

Corresponding author：ZHAO Wen-mingTel：0416- 4673439，E-mail：zhaowenming1957@163.com

ABSTRACT：ObjectiveTo prepare the lyophilized powder of naringenin liposome and investigate its pharmacodynamics in rat models of acute lung injury(ALI).MethodsNaringenin liposome was prepared by ethanol injection method and then its quality was evaluated.Also，the related characteristics was evaluated by adding mannitol(5%，W/V)as lyoprotectant to be freeze-dried.The rat ALI models were established by inhaling lipopolysaccharide(LPS)(5 mg/kg).Totally 48 female Sprague-Dawley rats were randomly divided into six groups：control group(A)，LPS group(B)，LPS+naringenin group(C)，LPS+lyophilized liposome group(D)，LPS+dexamethasone group(E)，and LPS+blank liposome group(F)，with 8 rats in each group.Lung wet/dry weight ratio was calculated，and the histopathological morphologies were observed under the light microscope.ResultsThe encapsulation efficiency of the prepared liposome was(82.44±0.98)%，the average particle size was(133±11)nm，and the Zeta potential was(-35.9±5)mV.The angle of repose of lyophilized powder was 36° and the bulk density was 0.3 g/ml.Compared with the group A，the lung tissues from groups B to F showed different remarkable histopathological changes under a light microscope，including infiltration of inflammatory cells，capillary congestion，hemorrhage，and marked thickening of the alveolar wall，among which group B and F changed the most significant，followed by group C，whereas groups D and E were the lightest.The wet/dry weight ratios increased in groups B to F compared with group A in some degree，and the increase of the lung wet/dry weight ratio in group D and E was significantly lower than in group B(P=0.0012，P=0.0018).ConclusionThe technology of preparing naringenin liposome by ethanol injection is simple and feasible，and lyophilized powder has an obvious therapeutic effect on ALI.

Key words：naringenin；liposome；freeze-drying；acute lung injury

(收稿日期：2014- 11- 16)

中圖分類號:R944.1+5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號：1000- 503X(2015)02- 0208- 07

通信作者：趙文明電話：0416- 4673439，電子郵件：zhaowenming1957@163.com