小白菊內酯對人肝癌細胞HepG-2細胞Caspase-3和NF-κB蛋白表達的影響①

韓琨景，楊萬山，孫 抒，辛 悅

(1.延邊大學醫(yī)學院病理學與法醫(yī)學教研室， 吉林 延吉 133002；2.白城市鎮(zhèn)賚縣人民醫(yī)院 病理科，吉林 白城 137300 )

小白菊內酯對人肝癌細胞HepG-2細胞Caspase-3和NF-κB蛋白表達的影響①

韓琨景1，2，楊萬山1，孫 抒1，辛 悅1

(1.延邊大學醫(yī)學院病理學與法醫(yī)學教研室， 吉林 延吉 133002；2.白城市鎮(zhèn)賚縣人民醫(yī)院 病理科，吉林 白城 137300 )

目的：研究小白菊內酯對人肝癌細胞HepG-2增殖抑制和誘導凋亡作用的機制。為小白菊內酯在臨床上早日應用于肝癌患者提供理論及實驗依據(jù)。方法：用體外培養(yǎng)的方法培養(yǎng)人肝癌HepG-2細胞；用四唑鹽(MTT)比色法檢測小白菊內酯對人肝癌HepG-2細胞的抗增殖及細胞毒作用；用倒置顯微鏡、HE染色光學顯微鏡；用免疫組織化學染色法檢測小白菊內酯作用人肝癌HepG-2前后Caspase-3、NF-κB蛋白陽性表達變化的情況。通過以上實驗研究小白菊內酯在體外對人肝癌HepG-2在細胞增殖、細胞凋亡等方面的影響及其作用機制。結果：(1)MTT法結果顯示：小白菊內酯對人肝癌HepG-2細胞的作用影響具有濃度和時間依賴性；(2)細胞形態(tài)學觀察：倒置顯微鏡觀察到對照組細胞貼壁生長，伸展性良好，細胞呈梭形和多角形，細胞之間連接緊密。小白菊內酯作用人肝癌HepG-2 24h以后，增殖速度減慢，細胞貼壁能力下降，細胞之間連接疏松。藥物作用48h以后，增殖速度大大減慢，大部分細胞變圓漂浮在培養(yǎng)瓶中。藥物作用72h以后，幾乎無活細胞，并且可見死細胞碎片；HE染色光學顯微鏡下觀察：對照組細胞呈梭形和多角形，細胞之間連接緊密，細胞胞漿豐富，細胞核完整；藥物作用24h以后，細胞伸展減弱，有一部分細胞呈現(xiàn)圓形，細胞之間連接疏松，核濃縮，染色質出現(xiàn)邊聚；藥物作用48h后視野中可見凋亡細胞和死亡細胞,細胞漿濃縮、染色質濃縮成新月形和“出泡”現(xiàn)象的變化；(3)免疫組化結果顯示：實驗組Caspase-3表達增加,NF-κB表達降低,與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。結論：小白菊內酯對人肝癌HepG-2細胞有明顯的抑制增殖作用，呈現(xiàn)出濃度和時間的依賴性；小白菊內酯對人肝癌HepG-2細胞株有誘導凋亡作用，其誘導人肝癌HepG-2細胞凋亡機制可能與NF-kB、Caspase-3等信號轉導有關。

小白菊內酯；人肝癌HepG-2細胞；增殖抑制；凋亡

小白菊內酯是小白菊的主要有效成分，它屬于種半萜稀內酯化合物，也是西方的傳統(tǒng)藥物。近些年，國內科研工作者在中國特有的藥用植物—木蘭科觀光木屬植物宿軸木蘭中也發(fā)現(xiàn)了此單體成分[1，2]，并通過現(xiàn)代色譜手段對木蘭科觀光木屬植物宿軸木蘭的所有單體成分的抑瘤活性進行分析，發(fā)現(xiàn)在木蘭科觀光木屬植物宿軸木蘭的所有單體成分中，小白菊內酯的抑瘤活性最強[3，4]。近些年的研究表明：小白菊內酯對很多種腫瘤都有抑瘤活性，如乳腺癌[5]、膽管癌[6]等，但目前針對現(xiàn)有文獻來講，有關小白菊內酯對人肝癌HepG-2細胞株作用影響的報道很少，這樣就促使了我們對小白菊內酯作用于人肝癌HepG-2細胞的進一步研究。本論文中用體外培養(yǎng)的方法培養(yǎng)人肝癌HepG-2細胞；用四唑鹽比色法(MTT法)檢測小白菊內酯對人肝癌HepG-2細胞的抗增殖及細胞毒作用；用倒置顯微鏡、光學顯微鏡等觀察小白菊內酯作用人肝癌HepG-2細胞前后細胞形態(tài)的改變；用免疫組織化學染色法通過檢測藥物作用前后細胞內相關基因蛋白Caspase-3、NF-κB蛋白陽性表達變化的情況來探討小白菊內酯誘導細胞凋亡的可能機制。本研究以人肝癌HepG-2細胞為靶細胞，研究小白菊內酯對人肝癌HepG-2細胞的Caspase-3和NF-κB蛋白表達的影響并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物與主要試劑

小白菊內酯，購于北京華美生科生物技術有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)液：碧云天試劑公司；胎牛血清：北京華美生科生物技術有限公司產(chǎn)品；二甲基亞砜：美國Amresco公司產(chǎn)品；免疫組化試劑盒：Caspase-3、NF-κB(一抗工作濃度1：100)購于武漢博士德生物有限公司；PBS緩沖液：購于武漢博士德生物有限公司。

1.2 主要設備

超凈臺：上海凈化設備廠；二氧化碳培養(yǎng)箱：USA產(chǎn)品，TC2323-2E型；倒置顯微鏡：日本Olympus產(chǎn)品；離心機:Heraeus公司產(chǎn)品；酶聯(lián)免疫檢測儀：TECAN型號infiniteM200PRO；光學顯微鏡：日本Olympus產(chǎn)品。

1.3 細胞株與細胞培養(yǎng)

人肝癌HepG-2細胞株購于北京華美生科生物技術有限公司。人肝癌HepG-2細胞以適量濃度接種于含10%胎牛血清和100U/mL青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于溫度37℃，二氧化碳濃度為5%及飽和濕度95%的二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每3天傳代一次。

1.4 MTT比色法測定細胞增殖抑制率

將對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板中，每孔180μL的細胞懸液，于溫度37℃，二氧化碳濃度為5%及飽和濕度95%的二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待貼壁后每孔加入不同濃度的小白菊內酯20μL，各培養(yǎng)24、48h后，每孔加入20μL的MTT溶液。4h后再吸出液體，加入180μL的二甲基亞砜，輕微震蕩后，再用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長492nm處測其吸光值。

計算公式：細胞的增殖抑制率(%)=(1-加藥組平均吸光值/對照組平均吸光值)×100%。

1.5 倒置顯微鏡觀察

從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出對數(shù)生長期的人肝癌HepG-2的細胞，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)后，待細胞貼壁后加入終濃度為5μg/mL的小白菊內酯，并設立對照組，對照組加等量的藥物溶劑。加藥組分別培養(yǎng)24h、48h、72h，用倒置顯微鏡觀察、拍照并記錄。

1.6 HE染色光學顯微鏡下觀察

從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出對數(shù)生長期的人肝癌HepG-2細胞，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，消化后，加入新的培養(yǎng)液輕輕吹打制成濃度為10×104個/mL的細胞懸液。然后接種于6孔板中，放回二氧化碳培養(yǎng)箱中，第二天待細胞貼壁后，加藥組加入終濃度為5μg/mL的小白菊內酯，對照組加等量的藥物溶劑，48h后取出蓋玻片進行HE染色。

1.7 免疫組織化學染色

加入新的適量的培養(yǎng)液吹打最終制成濃度為10×104個/mL的細胞懸液，最終將其接種在預先放有經(jīng)多聚-L-賴氨酸處理的蓋玻片的6孔板中，每孔加入1mL的細胞懸液，顯微鏡下觀察后再放回二氧化碳培養(yǎng)箱內，第二天顯微鏡下觀察待培養(yǎng)瓶內細胞貼壁后，加藥組加入100μL最終濃度為5μg/mL的小白菊內酯，對照組加入等量的藥物溶劑，48h后取出蓋玻片按照SABC免疫組化染色試劑盒進行免疫組織化學染色。按照說明書操作。

結果判斷標準：免疫細胞化學結果判定按文獻介紹的染色強度計算法：無或染色極淡(陰性-)，淺棕黃色(弱陽性+)，棕黃色(陽性)，棕褐色(強陽性)。每張爬片以看到棕黃色為陽性表達，基因蛋白Caspase-3和NF-κB主要在胞質中或胞核與胞質中共同表達。每張爬片在40×10高倍鏡下觀察5個視野，在每個視野下分別計算陽性表達率，陽性表達率=(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。免疫細胞化學染色中以已知陽性物質的組織切片為陽性對照，各組均以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 MTT法檢測小白菊內酯對人肝癌HepG-2的抑制增殖作用

MTT法檢測結果顯示：藥物對人肝癌HepG-2細胞株有明顯的抑制增殖作用，當藥物處在同一個濃度時，隨著藥物對此細胞作用時間的延長，藥物對其細胞的抑制率逐漸增加，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；另外，同一作用時間，隨著藥物濃度的增加，藥物對細胞的抑制率也明顯升高，具有顯著性差異，見表1。

表1 小白菊內酯對人肝癌HepG-2細胞株的抗增殖作用(%

注: 相同時間不同劑量與前一組比較*P<0.05；相同濃度不同時間比較#P<0.05。

2.2 倒置顯微鏡觀察結果

對照組細胞貼壁生長，伸展性良好，細胞呈梭形或多角形，細胞輪廓清晰。細胞之間連接緊密(圖1A)；小白菊內酯作用人肝癌HepG-2 24h以后，增殖速度減慢，細胞貼壁能力下降，細胞體積縮小，細胞之間連接疏松，小部分細胞變圓漂浮在培養(yǎng)瓶中；藥物作用48h以后(圖1B)，增殖速度大大減慢，大部分細胞變圓漂浮在培養(yǎng)瓶中；藥物作用72h以后，顯微鏡下觀察幾乎找不到正常細胞，大部分細胞都從瓶壁上脫落下來，并且可見死細胞碎片。

A：對照組

B：48h實驗組

圖1 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)(400×)

2.3 HE染色光學顯微鏡下觀察結果

對照組細胞呈梭形和多角形，細胞之間連接緊密，細胞胞漿豐富，細胞核完整；小白菊內酯作用人肝癌HepG-2 24h以后，細胞伸展減弱，有一部分細胞呈現(xiàn)圓形，細胞之間連接疏松，核濃縮，染色質出現(xiàn)邊聚；藥物作用48h后視野中可見凋亡細胞和死亡細胞,細胞漿濃縮，染色質濃縮成新月形和“出泡”現(xiàn)象的變化。

2.4 小白菊內酯對肝癌細胞Caspase-3和NF-κB蛋白表達的影響

見表2。 光鏡下觀察：小白菊內酯作用于細胞后Caspase-3在細胞核和細胞質內的表達都有所增強，與對照組相比起來具有顯著性差異 。NF-κB在對照組中高表達于細胞質和細胞核中，而藥物處理后，NF-κB在細胞質中呈弱表達，與對照組相比具有統(tǒng)計學差異，見表2。

表2 用藥前后Caspase-3和NF-κB的陽性表達率

注：對照組與加藥組比較，二種蛋白陽性表達率均具有顯著統(tǒng)計學差異P<0.01。

3 討論

本論文針對不同濃度的小白菊內酯在不同時間段對人肝癌HepG-2的作用效應。相同濃度的小白菊內酯隨著作用時間的延長，藥物的抑制率逐漸增加，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在同一時間段，隨著藥物濃度的增加，藥物對細胞的抑制率也隨著增加，有顯著性差異。這就說明小白菊內酯在對人肝癌HepG-2的藥物效應具有時間和濃度依賴性。本實驗中發(fā)現(xiàn)：用5μg/mL的小白菊內酯處理人肝癌HepG-2細胞48h可以發(fā)現(xiàn)藥物對細胞生長的抑制率可達到48.7%，接近于半數(shù)抑制濃度(IC50)。本論文中通過倒置顯微鏡、光學顯微鏡方法觀察細胞各個時段的形態(tài)學變化，并從形態(tài)學上探討小白菊內酯對人肝癌HepG-2的誘導凋亡作用。本實驗通過倒置顯微鏡觀察到：對照組細胞貼壁生長，伸展性良好，細胞呈梭形和多角形，細胞之間連接緊密。藥物作用細胞24h以后，增殖速度減慢，細胞貼壁能力下降，細胞之間連接疏松，小部分細胞變圓漂浮在培養(yǎng)瓶中。藥物作用48h以后，增殖速度大大減慢，大部分細胞變圓漂浮在培養(yǎng)瓶中。藥物作用72h以后，幾乎無活細胞，并且可見死細胞碎片。在本實驗中，通過免疫組織化學染色法觀察到：實驗組中終濃度為5μg/mL的小白菊內酯作用于人HepG-2 48h以后，實驗組的Caspase-3的蛋白表達與對照組相比明顯增加，說明小白菊內酯誘導人肝癌HepG-2細胞凋亡的機制可能是通過激活Caspase家族中的Caspase-3實現(xiàn)的。小白菊內酯是NF-κB的有效抑制劑，它主要是通過阻斷IκB的降解來阻礙NF-κB通路的。進而發(fā)揮各種作用[7，8]。本實驗發(fā)現(xiàn),小白菊內酯作用于人肝癌HepG-2細胞株后,NF-κB的表達下降，這就說明小白菊內酯抗人肝癌HepG-2的機制可能與阻礙了NF-κB通路有關。

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Experimental study on the effect of parthenolide on human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells

HANKun-jing1，2,YANGWan-shan1,SUNShu1,XINYue1

(1.College of Medicine, Yanbian University College of Medicine, Yanji133002, China;2. People Hospital of Zhenlai County, Baicheng 137300, China)

Objective:To study the mechanism of action of parthenolide on human hepatocellular carcinoma HepG-2 cell proliferation inhibition and apoptosis induction effect; and to provide theoretical and experimental basis for parthenolide in clinical application as soon as possible in patients with hepatocellular carcinoma.Methods: Human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells were cultured the in vitro. cultured human hepatocellular carcinoma HepG-2cells; four tetrazolium (MTT) was used to detectthan the antiproliferative and cytotoxic effect of detection of parthenolide assay in human hepatocellular carcinoma cell line HepG-2.By inverted microscope, HE staining light microscope was used to observeation of parthenolide effect of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells and cell morphology change with the changes before and after drug detection.Immunohistochemistry staining of parthenolide was used to detect human hepatocellular carcinoma HepG-2 and expression of Caspase-3, NF- κB protein positive changes in the situation. Through the above experiment of parthenolide in vitro on human hepatocellular carcinoma HepG-2 effects on cell proliferation, apoptosis and its mechanism of action were studied.Results: (1) MTT method results showed that: the effect of parthenolide was dependent on the concentration and time in affecting human hepato cellular carcinoma HepG-2 cells. in a concentration and time dependent; (2) the morphology of cells was observed by inverted microscope observation. The : to control growth of adherent cells in control group was observed, stretching for good,Cells were spindle and polygonal cells wereare connected tightly. Parthenolide effect of human hepatocellular carcinoma HepG-2 24h, proliferation, cell adherence ability drops, loose connections between cells, some cells became round floating in the culture flask. After Ddrug effecteds after 48h, the proliferation speed slowed down considerably, Most of the cells became round floating in the culture flask. Drug effects after 72h, almost no live cells, dead cells and debris visible.We and observed under light microscope with HE staining: group cells were spindle and polygonal control, cells wereare connected tightly, rich in cytoplasm, nucleus integrity;drug effect after 24h, cell spreading weakened, some cells showed round, osteoporosis, connections between cells pyknosis, chromatin appeared margination; apoptotic cells and cell death after 48h in the view of drug effect, cytoplasm condensed, dyeing into crescent and the "bubble" phenomenon of condensation;(3) The results of immunohistochemistry showed that: the experimental group increased the expression of Caspase-3, but reduced the expression of NF- κB, which compared with the control group with significant difference (P<0.05). Conclusions: ①Parthenolide has obvious effect on inhibiting the proliferation of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells, showing a concentration and time dependence;②Parthenolide to induces the apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG-2,The possible mechanism of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells inducesd apoptosis and NF-kB, Caspase-3 and other signal transduction.

parthenolide; human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells; proliferation; apoptosis

吉林省中醫(yī)藥管理局基金項目，編號：吉中醫(yī)藥發(fā)2012-152。

韓琨景(1985～)女，吉林白城人，碩士，醫(yī)師，研究方向：腫瘤病理學。

孫抒(1961～)女，遼寧開原人，博士，教授。研究方向：腫瘤病理學。E-mail：sunshu1@126.com。

R735.7

A

1008-0104(2015)04-0046-04

2015-02-09)