消痔靈注射液促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用的研究①

李善昌,梁顯峰,姜炳華,閆 磊,寧尚波

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科，黑龍江 佳木斯 154002 )

消痔靈注射液促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用的研究①

李善昌,梁顯峰,姜炳華,閆 磊,寧尚波

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科，黑龍江 佳木斯 154002 )

目的：檢測不同濃度的消痔靈注射液(HemorrhoidInjection)對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(hemangiomaendothelialcells)凋亡的影響。方法：設(shè)立對照組和不同濃度的消痔靈注射液3個實(shí)驗(yàn)組，采用細(xì)胞培養(yǎng)MTT法 流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測不同濃度消痔靈注射液對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用的影響。結(jié)果：對照組及實(shí)驗(yàn)組HECS均呈現(xiàn)生長狀態(tài)，隨著藥物濃度的增加及時(shí)間的延長，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)凋亡改變。消痔靈注射液對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的干預(yù)與給藥劑量及處理時(shí)間呈正相關(guān)，其能使血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞停滯在G0/G1期，從而使血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的死亡率顯著增加(P<0.05)。流式分析結(jié)果表明給藥后血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著增加，差異顯著(P<0.05)。 結(jié)論:消痔靈注射液促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其凋亡率與藥物濃度密切相關(guān)。

血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞;消痔靈注射液;細(xì)胞凋亡

血管瘤(hemangioma)是嬰幼兒最常見的先天性良性腫瘤，確切發(fā)病機(jī)理不明，新生兒發(fā)病率2%～3%，一歲以下兒童約為10%[1]。目前治療血管瘤的方法主要有手術(shù)治療、 激素藥物治療、 激光治療、 冷凍 、介入治療等[2],由于上述治療方法對于血管瘤治療的創(chuàng)傷過大，或者伴有嚴(yán)重的副作用。因此，尋找有效的治療方法是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)的研究通過檢測消痔靈注射液對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響作用，旨在驗(yàn)證消痔靈注射液在血管瘤中的作用機(jī)理，為尋找血管瘤新的治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞株QDC397由上?？谇会t(yī)學(xué)研究所提供。M199培養(yǎng)基(Gibco,美國)， 0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，美國)、鼠抗人CD34單克隆抗體(CST公司，美國)，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記二抗 胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)(Hyclone公司，美國) 肝素。甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT)(Promega公司，美國)，流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)GBB16CO2清潔型培養(yǎng)箱(Heraeus公司，德國)，超凈工作臺。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞株QDC397，采用10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、1%雙抗 的199培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至鋪滿瓶底80%后，用0.25%胰蛋白酶PBS溶液消化貼壁生長的細(xì)胞株，按1：2比例傳代培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.2 免疫熒光染色鑒定人HECS的來源

將傳代后的人HECS爬片后進(jìn)行免疫熒光染色。4%多聚甲醛室溫固定30min，10%胎牛血清37℃封閉30min后滴加適量稀cd34鼠抗人單克隆抗體(1：400)，以PBS作為一抗做陰性對照，置于濕盒中4℃過夜。次日在37℃避光孵育1h，加入FITC熒光標(biāo)記二抗，避光孵育1h，PBS沖洗四遍，每遍5min。加入0.5μg/mLDAPI染色10min，用PBS洗3遍后，進(jìn)行免疫熒光檢測。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖情況

血管瘤細(xì)胞消化后培養(yǎng)在96孔板，每孔加細(xì)胞1000個。同時(shí)采用10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基將消痔靈注射液稀釋成40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL三個濃度的實(shí)驗(yàn)組和空白對照組，共四組。分別于細(xì)胞接種后48h加藥，然后在加藥后的24、48、72h進(jìn)行測定，測定前加入濃度為5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育4h，之后棄去上清加入150μL的二甲基亞砜(DMSO)37℃孵育10min后，通過酶標(biāo)儀測定OD490，細(xì)胞生長抑制率公式為(1-不同濃度組平均值/陰性對照組平均值)×100.00%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

將不同濃度消痔靈注射液處理過的細(xì)胞，分為空白組(只加入培養(yǎng)基)實(shí)驗(yàn)組：培養(yǎng)基中分別加入含有(40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL)濃度的消痔靈注射液。接種細(xì)胞至六孔板，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞一次，加入0.025%的胰酶消化成單細(xì)胞懸液，1000rpm離心5min，棄上清。加入 300μL的裂解緩沖液(BindingBuffer)懸浮細(xì)胞。加入 5μLAnnexinV-FITC混勻后，加入 5μLPropidiumIodide，混勻； 室溫、避光、反應(yīng) 5～15min，在1h內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HECS的鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：一種細(xì)胞疏松排列，胞膜明顯，呈放射狀生長，胞核較淡的長梭形細(xì)胞；另一種細(xì)胞緊密排列，細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞膜明顯，胞核較淡的不規(guī)則角形細(xì)胞。采用CD34 單克隆抗體對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光法檢測，細(xì)胞胞漿內(nèi)(核周圍)呈現(xiàn)綠色熒光，熒光較強(qiáng)，陽性率達(dá)90%以上。

2.3 不同濃度藥物的細(xì)胞抑制率及細(xì)胞周期的影響

40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL三個濃度的消痔靈注射液分別在24、48、72h進(jìn)行測定細(xì)胞抑制率結(jié)果表明消痔靈注射液對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的干預(yù)與給藥劑量和處理時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)。

MTT法測定消痔靈注射液對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞具有生長抑制作用，并呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較在72h差異均有顯著性意義(均P<0.05)。

表1 不同濃度消痔靈注射液對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長抑制率與陰性對照組的比較(%，n=4)

注：與陰性對照組相比，※P<0.05。

流式分析結(jié)果表明，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞停滯在G0/G1期，從而使血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的死亡率顯著增加。(圖a、b、c、d)

圖a 陰性對照組調(diào)往率 圖b 陰性對照組調(diào)往率

圖c 陰性對照組調(diào)往率 圖d 陰性對照組調(diào)往率

注：流式檢測細(xì)胞凋亡率 圖a示UL=5.73 %UR=6.37 %LL=85.79%LR=2.11% . 圖b示UL=14.75 %UR=11.42%LL=66.62%LR=7.21% . 圖c示UL=17.75%UR=11.42 %LL=66.62%LR=7.21% . 圖d示UL=22.29%UR=16.23%LL=47.09%LR=14.39% .

3 討論

消痔靈注射液(hemorrhoidinjection)是一種硬化劑，主要治療內(nèi)外痔瘡，由明礬、五倍子等中藥配制而成,具有較強(qiáng)的消贅去腫、收斂止血、消炎等作用。消痔靈注射液在臨床上治療血管瘤的實(shí)驗(yàn)性研究較多，但是沒有明確的細(xì)胞學(xué)研究作為其細(xì)胞理論學(xué)基礎(chǔ)。消痔靈注射液能使毛細(xì)血管及小靜脈血管發(fā)生栓塞、纖維化、萎縮以達(dá)到治療血管瘤性病變的目的，它的這種藥理作用就是本課題利用此藥研究誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的理論依據(jù)[3]。

Mulliken和Glowacki[4]將血管瘤病變分為血管瘤和血管畸形兩大類，其分類依據(jù)是從病理學(xué)角度，及其血管瘤的臨床表現(xiàn)、自然衍變 細(xì)胞生物學(xué)特性，及預(yù)后不同提出。此分類被國際血管異常研究協(xié)會(InternationalSocietyoftheStudyofVascularAnomalies,ISSVA)所采納并已逐漸被臨床醫(yī)生廣泛認(rèn)同。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，并應(yīng)用免疫熒光法檢測血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞。鼠抗人CD34單克隆抗體已被認(rèn)為是鑒定血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[5]，通過激光顯微鏡觀察，觀察到所培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)(核周圍)呈現(xiàn)較強(qiáng)綠色熒光表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)使用鼠抗人CD34單克隆抗體對培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了免疫熒光鑒定，結(jié)果陽性表達(dá)率達(dá)90%以上，與文獻(xiàn)報(bào)告相符，從而確定為所培養(yǎng)的細(xì)胞為血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，為進(jìn)一步試驗(yàn)提供基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法對不同濃度組分別進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，伴隨消痔靈注射液濃度增大及作用時(shí)間的延長，血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制，為了進(jìn)一步探討消痔靈注射液對血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長抑制作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀對不同濃度消痔靈注射液作用后的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡程度進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示消痔靈注射液中的活性成分能有效促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，其藥效與劑量和作用時(shí)間呈正相關(guān)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析顯示，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞主要被抑制在G0/G1期，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這為臨床醫(yī)生使用消痔靈注射液治療血管瘤患者提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]JacobsAH,WaltonRG.Theincidenceofbirthmarksintheneonate[J].Pediatrics,1976,58(2)：218-222

[2]中華口腔醫(yī)學(xué)會口腔頜面外科專業(yè)委員會脈管性疾病學(xué)組.口腔頜面部血管瘤治療指南[J].中國口腔頜面外科雜志,2011,9(1)：61-67

[3]崔超 ，張榮明. 地塞米松聯(lián)合消痣靈局部注射治療血管瘤和血管畸形療效觀察[J].中國美容醫(yī)學(xué),2011,20(4)：630-631

[4]MullikenJB,glowackiJ.Hemangiomasandwascularmalformationsininfantsandchildren:Aclassificationbasedonendothelialcharacteristics[J].PlastTeconstrSurg,1982,69:412

[5]AchauerBA,ChangCJ,VanderKamVM.Managenmentofhemangiomaofinfancy:reviewof245patients[J].Plastreconstrsurg,1997,99(5):1301-1308

Study of Xiaozhiling injection in hemangioma endothelial cell promote apoptosis tumor

LIShan-chang,LIANGXian-feng,JIANGBing-hua,YANLei,NINGShang-bo

(The Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Hospital of Stomatological Jiamusi University, Jiamusi 154002, China)

Objective:To detect different concentrations of xiaozhiling injection (Hemorrhoid Injection) of hemangioma endothelial cells (hemangioma endothelial cells) apoptosis. Method: To set up the control group and different concentrations of xiaozhiling injection three experimental group, and the methods of cell culture determined by MTT method, flow cytometry to detect different concentrations xiaozhiling influenced by injection of hemangioma endothelial cell apoptosis. Results:The control group and experimental group HECS showed growth state, with the increase of drug concentration and the extension of time, the cell morphology change present apoptosis. Xiaozhiling injection of interference from the hemangioma endothelial cell apoptosis and give medicine dose and treatment time were positively correlated.It can make the stagnation of hemangioma endothelial cells in G0/ G1phase, so that the mortality of hemangioma endothelial cells increased significantly (P<0.05).Flowanalysisresultsshowedthatthehemangiomaendothelialcellapoptosisrateincreasedsignificantlyafterthetreatment,withthesignificantdifference(P< 0.05). Conclusion: Xiaozhiling injection promotes hemangioma endothelial cell apoptosis, the apoptosis rate is closely related to the drug concentration.

hemangioma endothelial cells;Xiaozhiling injection;cell apoptosis

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號：LM2014-044。

李善昌(1947～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。

梁顯峰(1983～)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。E-mail:306365799@qq.com。

R543

A

1008-0104(2015)04-0040-03

2015-02-28)