玉米單倍體誘導(dǎo)及化學(xué)加倍方法的研究

慈佳賓，楊　巍，任雪嬌，崔學(xué)宇，張　野，張艷輝，楊偉光(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118)

玉米單倍體誘導(dǎo)及化學(xué)加倍方法的研究

慈佳賓，楊巍，任雪嬌，崔學(xué)宇，張野，張艷輝，楊偉光
(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118)

摘要:【目的】玉米單倍體的誘導(dǎo)及加倍.【方法】以北方春玉米區(qū)高抗絲黑穗病自交系K88和高感絲黑穗病自交系G115的雜交F1代作為母本，以5個(gè)誘導(dǎo)系(JS6-11～JS6-15)作為父本，進(jìn)行單倍體雜交誘導(dǎo)試驗(yàn);以秋水仙素作為玉米單倍體人工染色體加倍藥劑，采取4種(浸根法、浸芽法、滴心葉法、針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法)處理方法，每種方法設(shè)置3個(gè)濃度梯度(0.2、0.4和0.6 mg·mL－1)，并分別以體積分?jǐn)?shù)2% DMSO +5%甘油溶液作為輔助藥劑，進(jìn)行單倍體加倍試驗(yàn).【結(jié)果和結(jié)論】花絲長(zhǎng)短和授粉時(shí)間對(duì)單倍體誘導(dǎo)率有重要影響.延遲授粉(長(zhǎng)花絲≥7cm)的平均單倍體誘導(dǎo)率為17.0%，約為正常授粉(短花絲≤4 cm)條件下的3.3倍;伏后授粉的誘導(dǎo)率平均為18.4%，約為伏期授粉的3.4倍，證明延遲授粉時(shí)間和較低的溫度有利于提高單倍體誘導(dǎo)率.秋水仙素加倍試驗(yàn)表明，浸根法對(duì)植株傷害較嚴(yán)重，存活率低于50%;針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法(0.6 mg·mL－1)和滴心葉法(0.4 mg·mL－1)的散粉率較高(45.9%，28.9%)，相應(yīng)的結(jié)實(shí)率也較高(15.2%，11.1%)，說(shuō)明針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法處理效果最好，滴心葉法次之.

關(guān)鍵詞:玉米;單倍體;誘導(dǎo)率;單倍體加倍

慈佳賓，楊巍，任雪嬌，等.玉米單倍體誘導(dǎo)及化學(xué)加倍方法的研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(3) : 49-53.

優(yōu)先出版時(shí)間:2015-04-14

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單倍體誘導(dǎo)技術(shù)是培育玉米新品種最快速、經(jīng)濟(jì)的手段.Stock6［1］是玉米中發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)孤雌生殖誘導(dǎo)系，利用其所選育的誘導(dǎo)系有WS14［2］、MHI［3］等.但Stock6在誘導(dǎo)率、繁殖性能等方面存在嚴(yán)重缺陷，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米育種課題組對(duì)Stock6進(jìn)行了遺傳改良，成功地獲得了誘導(dǎo)率10%以上、遺傳標(biāo)記明顯、花粉量大、持粉時(shí)間長(zhǎng)、抗病性好的新型誘導(dǎo)系JS6.本研究以誘導(dǎo)系JS6的姊妹系JS6-11～JS6-15作父本，以高抗絲黑穗病自交系K88和高感絲黑穗病自交系G115的雜交F1代作為母本材料，雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，探討不同誘導(dǎo)因素下單倍體誘導(dǎo)率的變化特點(diǎn)，對(duì)有效利用單倍體誘導(dǎo)系及單倍體誘導(dǎo)技術(shù)，提高育種效率并選育自有的單倍體誘導(dǎo)系，快速培育玉米自交系并用其選育玉米新品種具有重要意義.

可供加倍的單倍體材料有限，玉米單倍體加倍技術(shù)尚不成熟.研究報(bào)道，許多玉米材料單倍體自然加倍率低于5%，有些材料根本不發(fā)生自然加倍［4-5］.因此，要獲得大量玉米Double haploid (DH)系并從中選育出優(yōu)良自交系供生產(chǎn)上利用，必須借助單倍體人工染色體加倍.玉米單倍體的化學(xué)加倍方法有很多［5-9］，其中秋水仙素應(yīng)用最為廣泛.本研究通過(guò)設(shè)計(jì)4種秋水仙素加倍方式，進(jìn)一步探討秋水仙素加倍技術(shù)，以期為生產(chǎn)上玉米單倍體的加倍提供理論參考.

1　材料與方法

1.1雜交誘導(dǎo)試驗(yàn)

以高抗絲黑穗病自交系K88和高感絲黑穗病自交系G115的雜交F1代作為母本，以吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米育種課題組選育的5個(gè)誘導(dǎo)系JS6-11～JS6-15作為父本，于2011年在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)育種基地雜交誘導(dǎo)單倍體.試驗(yàn)設(shè)置花絲長(zhǎng)短和授粉時(shí)期2個(gè)因素.花絲長(zhǎng)短設(shè)2個(gè)處理:在長(zhǎng)花絲(≥7 cm)和短花絲(≤4 cm)條件下用誘導(dǎo)系花粉授粉;授粉時(shí)期設(shè)2個(gè)處理:伏期(07-15—08-01)和伏后(08-15—09-01)授粉.用于研究的母本材料分別于2011年5月中旬和6月上旬播種.

于母本吐絲后進(jìn)行授粉，收獲后選擇結(jié)實(shí)較好的果穗，在果穗上挑選無(wú)色胚芽、紫色粒頂、胚近三角形的準(zhǔn)單倍體，所有準(zhǔn)單倍體于2012年春種植于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)長(zhǎng)春玉米育種基地進(jìn)行鑒定.其中單倍體植株田間表現(xiàn)為矮小、葉片和莖稈均呈綠色、多為不育.根據(jù)雜交當(dāng)代子粒和單倍體子粒數(shù)，計(jì)算單倍體誘導(dǎo)率:

1.2單倍體加倍試驗(yàn)

單倍體加倍藥劑為西格瑪－奧德里奇公司生產(chǎn)的秋水仙素原藥、2% (φ) DMSO(二甲基亞砜)和5%(φ)甘油輔助劑.采取4種處理方法，每種方法分3個(gè)濃度梯度(0.2、0.4和0.6 mg·mL－1).1)浸根法:單倍體種子浸泡在清水中6 h后置于28℃培養(yǎng)箱中催根，待幼苗長(zhǎng)到2～3片葉時(shí)，將其置入4℃冰箱中煉苗2～3 h，而后用自編的帶有小孔且上面附有1層保濕濾紙的鐵絲網(wǎng)將幼芽固定，并將幼根浸泡于不同濃度(0.2、0.4、0.6 mg·mL－1)的秋水仙素+2%(φ) DMSO +5%(φ)甘油溶液中，溶液漫過(guò)幼根生長(zhǎng)點(diǎn)，浸泡6 h后，再用流水清洗2 h，移栽至大田.2)浸芽法:采用毛巾卷法催芽，當(dāng)幼芽長(zhǎng)約2 cm時(shí)用刀片將幼芽頂端胚芽鞘切掉1～2 mm，使之露出1個(gè)小口(但不要傷害到嫩芽)，將其在室溫下密閉浸泡在不同濃度(0.2、0.4、0.6 mg·mL－1)的秋水仙素+ 2% (φ) DMSO + 5% (φ)甘油溶液中6 h，流水清洗2 h后將其種在育苗盤中，幼苗長(zhǎng)到4～5片葉時(shí)移栽至大田.3)滴心葉法:選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的單倍體幼苗，待其生長(zhǎng)到3～5葉時(shí)，分別抽取約1 mL的(0.2、0.4、0.6 mg·mL－1)秋水仙素+2% (φ) DMSO +5%(φ)甘油溶液至單倍體植株的心葉處.4)針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法:長(zhǎng)勢(shì)一致的單倍體幼苗田間長(zhǎng)到6～7葉時(shí)，用微量移液器抽取5 μL的(0.2、0.4、0.6 mg·mL－1)秋水仙素+2% (φ) DMSO + 5% (φ)甘油溶液注射于幼苗莖稈的盾片節(jié)處的生長(zhǎng)點(diǎn).

加倍材料源于試驗(yàn)1.1中雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體，將準(zhǔn)單倍體均分4等份(100粒)后根據(jù)不同的秋水仙素加倍處理后種植田間，去除非單倍體植株.田間觀察成活率、散粉率、結(jié)實(shí)率和藥害情況.以單倍體植株是否散粉和結(jié)實(shí)來(lái)判斷玉米單倍體植株是否加倍成功.為防外來(lái)花粉授粉結(jié)實(shí)，試驗(yàn)選取單倍體自交后代結(jié)實(shí)較好的果穗于2012年冬和2013年春分別在三亞和長(zhǎng)春種植觀察，以進(jìn)一步鑒別其加倍情況.

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel和DPS［10］軟件進(jìn)行處理及分析.

2　結(jié)果與分析

2.1不同因素對(duì)誘導(dǎo)率的影響

2.1.1不同花絲長(zhǎng)度的單倍體誘導(dǎo)率從表1中可以看出，花絲長(zhǎng)度對(duì)單倍體誘導(dǎo)率有很大影響，花絲≥7 cm時(shí)的平均誘導(dǎo)率(17.0%)明顯大于花絲長(zhǎng)度≤4 cm時(shí)的平均誘導(dǎo)率(5.2%).其中在花絲長(zhǎng)度≤4 cm時(shí)的誘導(dǎo)系中，誘導(dǎo)率最高的是JS6-14，誘導(dǎo)率為7.9%.花絲長(zhǎng)度≥7 cm時(shí)誘導(dǎo)率最高的誘導(dǎo)系為JS6-13，誘導(dǎo)率為21.2%.誘導(dǎo)系長(zhǎng)花絲處理單倍體誘導(dǎo)率高于短花絲處理，說(shuō)明長(zhǎng)花絲誘導(dǎo)效果比短花絲效果好.

2.1.2花絲長(zhǎng)度與誘導(dǎo)系對(duì)誘導(dǎo)率的影響花絲長(zhǎng)度和誘導(dǎo)系對(duì)誘導(dǎo)率的影響的方差分析見表2.結(jié)果表明:不同誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率存在顯著差異，不同花絲長(zhǎng)度誘導(dǎo)率存在極顯著差異，說(shuō)明誘導(dǎo)系和花絲長(zhǎng)度對(duì)誘導(dǎo)率均有很大影響，且長(zhǎng)花絲條件下授粉可以提高誘導(dǎo)率.

表1　不同花絲長(zhǎng)度授粉單倍體誘導(dǎo)率Tab.1 Haploid induced rates at different silk length pollination

表2　花絲長(zhǎng)度與誘導(dǎo)系間的方差分析Tab.2 Variance analysis between the silk length and inducer

2.1.3不同授粉時(shí)期的單倍體誘導(dǎo)率由表3可知，授粉時(shí)期對(duì)單倍體誘導(dǎo)率亦有很大影響，伏后授粉時(shí)的平均誘導(dǎo)率(18.4%)明顯大于伏期授粉時(shí)的平均誘導(dǎo)率(5.4%).其中在伏期授粉時(shí)，誘導(dǎo)率最高的是誘導(dǎo)系JS6-14(8.1%).伏后授粉時(shí)誘導(dǎo)率最高的誘導(dǎo)系為JS6-13(22.8%).誘導(dǎo)系伏后授粉時(shí)單倍體平均誘導(dǎo)率(18.4%)高于伏期授粉(5.4%)，說(shuō)明伏后授粉效果更好.

2.1.4授粉時(shí)期與誘導(dǎo)系對(duì)誘導(dǎo)率的影響授粉時(shí)期和誘導(dǎo)系對(duì)誘導(dǎo)率的影響的方差分析見表4.結(jié)果表明:誘導(dǎo)系、授粉時(shí)期誘導(dǎo)率均達(dá)到了極顯著水平，說(shuō)明不同授粉時(shí)期對(duì)誘導(dǎo)率有很大影響，且伏后授粉時(shí)可以提高單倍體誘導(dǎo)率.此外，相對(duì)于花絲長(zhǎng)度，授粉時(shí)期對(duì)誘導(dǎo)率影響更大.

表3　不同授粉時(shí)期單倍體誘導(dǎo)率Tab.3 Haploid induced rates at different pollinating dates

表4　授粉時(shí)期與誘導(dǎo)系間的方差分析Tab.4 Variance analysis between the pollinating dates andinducer

2.2不同方法對(duì)單倍體加倍效果的影響

2.2.1加倍方法對(duì)單倍體植株成活率的影響從表5可知，滴心葉法的適宜濃度為0.4 mg·mL－1，浸芽法的適宜濃度為0.2 mg·mL－1.針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法的適宜濃度為0.6 mg·mL－1.在秋水仙素各濃度梯度下浸根法處理時(shí)單倍體植株受害程度比其他3種方法嚴(yán)重，0.2、0.4、0.6 mg·mL－1存活率分別為39.3%、42.2%和25.6%.

2.2.2加倍方法對(duì)單倍體植株散粉和結(jié)實(shí)的影響

由表5可知，4種加倍方法中，針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法的效果最好，散粉率均超過(guò)10%，在秋水仙素為0.6 mg·mL－1時(shí)散粉率達(dá)到45.9%;結(jié)實(shí)率也最高，為15.2%.滴心葉法在0.4 mg·mL－1下散粉率為28.9%，結(jié)實(shí)率為11.1%;浸根法的散粉率都低于10%，在秋水仙素為0.4和0.6 mg·mL－1下結(jié)實(shí)率都極低(1.1%) ;浸芽法雖在0.4 mg·mL－1下散粉率超過(guò)10%，但其結(jié)實(shí)率卻很低(1.1%).綜上可以看出，在散粉性和結(jié)實(shí)率方面，針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法和滴心葉法相對(duì)較好.

表5　不同方法、不同濃度秋水仙素處理單倍體的成活、散粉和結(jié)實(shí)情況Tab.5　 The survival，fertility and seed setting of haploid plants under different colchicines concentrations and methods　%

3　討論與結(jié)論

3.1誘導(dǎo)條件對(duì)玉米單倍體誘導(dǎo)率的影響

在花絲長(zhǎng)度≥7 cm和花絲長(zhǎng)度≤4 cm授粉時(shí)進(jìn)行雜交誘導(dǎo)，前者單倍體誘導(dǎo)率較高(21.2%) ;在伏期授粉(07-15—08-01 )時(shí)的單倍體誘導(dǎo)率(8.1%)遠(yuǎn)低于伏后授粉(08-15—09-01)的單倍體誘導(dǎo)率(22.8%).其中花絲長(zhǎng)度對(duì)玉米單倍體誘導(dǎo)率的影響可能原因是花粉中2個(gè)精細(xì)胞形成雄性生殖單位是保證2個(gè)精核同步轉(zhuǎn)運(yùn)的重要條件，較長(zhǎng)的花絲增加了2個(gè)精核在花粉管中運(yùn)輸?shù)牟煌叫裕?1］.劉志增等［12］研究表明，精核間距在誘導(dǎo)單倍體過(guò)程中起重要作用，花絲長(zhǎng)使得花粉粒萌發(fā)后花粉管到達(dá)胚囊距離延長(zhǎng)，進(jìn)而造成2個(gè)精核的間距加大，更容易誘導(dǎo)形成單倍體.授粉時(shí)期對(duì)單倍體誘導(dǎo)率的影響可能同氣溫有密切關(guān)系.授粉期早時(shí)溫度相對(duì)較高，玉米花粉管生長(zhǎng)速度快，新陳代謝非常旺盛，能量和物質(zhì)的消耗都加快了，而供給的能量和物質(zhì)不會(huì)相應(yīng)地增加，相對(duì)于本身內(nèi)含物就很少的玉米孤雌生殖誘導(dǎo)系花粉粒來(lái)說(shuō)，這種狀況會(huì)加速花粉管的衰老，不正?；ǚ鄣母?jìng)爭(zhēng)力減弱，從而導(dǎo)致單倍體的產(chǎn)生減少.而授粉晚時(shí)，溫度相對(duì)較低，新陳代謝相對(duì)較慢，玉米孤雌生殖誘導(dǎo)系的不正?；ǚ哿５?個(gè)精核在花粉管中有充足的時(shí)間分開運(yùn)輸，從而單受精產(chǎn)生玉米單倍體.

姜龍等［13］以玉米單倍體誘導(dǎo)系JS6-1為父本和8個(gè)不同母本基礎(chǔ)組合在長(zhǎng)春、長(zhǎng)嶺和三亞的研究結(jié)果表明，不同基因型誘導(dǎo)基礎(chǔ)材料的單倍體誘導(dǎo)率為海南三亞冬繁明顯高于長(zhǎng)春和長(zhǎng)嶺，表明晝夜溫差大有利于玉米單倍體的誘導(dǎo).

花絲長(zhǎng)短和授粉時(shí)期也可能影響了精卵結(jié)合的過(guò)程，隨著花絲的增長(zhǎng)，但極核和卵核接受精核的能力均減弱，極核與精核結(jié)合的能力相對(duì)較強(qiáng)，由此導(dǎo)致胚乳正常發(fā)育，而雌配子由于沒(méi)有受精而發(fā)育為單倍體.低溫對(duì)受精過(guò)程也可能有類似影響.從花絲不同時(shí)期接受花粉的能力來(lái)看，雌穗在吐絲后3～4 d內(nèi)抽出的花絲活力較強(qiáng)［14］，6～9 d后活力開始下降［15］.考慮到本研究母本基因型較少，有關(guān)溫度、花絲活力和母本基因型等因素對(duì)誘導(dǎo)性能的影響仍需進(jìn)一步研究.

3.2人工染色體加倍處理對(duì)玉米單倍體加倍的影響

Chase［16］曾提出用秋水仙素溶液注射玉米幼苗的盾片節(jié)進(jìn)行加倍，Gayen等［17］曾采用浸種法，使單倍體加倍率達(dá)到了18%.魏俊杰等［18］在6葉期和拔節(jié)期用不同濃度的秋水仙素配以DMSO注射處理莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在6葉期，以0.5% (φ)秋水仙素配以2.0%(φ)的DMSO處理效果最好，加倍率高達(dá)32.3%.敬成俊等［19］研究表明秋水仙素加倍作用是通過(guò)與幼嫩組織正在分裂的細(xì)胞接觸，引起紡錘絲縮減并且結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞整齊地被阻止在分裂中期，因而使重組核具有加倍的染色體數(shù).秋水仙素在植物組織中迅速擴(kuò)散，通過(guò)維管系統(tǒng)在植物體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)使植株組織加倍達(dá)到長(zhǎng)效的目的［9］.

本研究秋水仙素處理結(jié)果表明:浸根法對(duì)植株傷害較嚴(yán)重，存活率低于50%;針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法(0.6 mg·mL－1)和滴心葉法(0.4 mg·mL－1)的散粉率較高(45.9%，28.9%)，相應(yīng)的結(jié)實(shí)率也較高(15.2%，11.1%)，說(shuō)明針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法處理效果最好，滴心葉法次之.其生理生化機(jī)制可能是:

1)玉米根系的最重要功能是從土壤中吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)用一定濃度的秋水仙素處理后，玉米根系的發(fā)育受到一定的阻礙，而且秋水仙素也破壞了玉米根系中的根毛和根尖幼嫩組織.移栽到大田后，幼苗吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)困難，容易過(guò)早死亡.二倍體植株具有發(fā)達(dá)的根系，相對(duì)于單倍體根系具有較強(qiáng)的抵抗秋水仙素藥害的作用，因此在田間發(fā)育良好［20］.

2)針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法是處理莖尖分生組織，相對(duì)于浸根法、浸芽法來(lái)說(shuō)造成的損傷較大，其原因可能是針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法中秋水仙素注射于莖尖分生組織后并長(zhǎng)期作用于莖尖分生組織，而且田間的高溫加重了藥害，植株的死亡率也很高，即使植株存活下來(lái)也表現(xiàn)為葉片發(fā)黃、萎縮，但由于秋水仙素長(zhǎng)期有效地作用于莖尖分生組織，對(duì)植株的加倍效果也很明顯，只要植株成活都有可能加倍成功［21］.

3)針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法和滴心葉法結(jié)實(shí)率不高的原因可能是多方面的，除了上述秋水仙素造成的藥害外，還有加倍成功的植株雌雄花期不協(xié)調(diào)和生殖器官變態(tài)等原因，這樣的植株也不會(huì)散粉和結(jié)實(shí)［9］.

綜上所述，在浸根法和浸芽法中，應(yīng)該降低秋水仙素的濃度以減小藥害，同時(shí)浸根法中應(yīng)該嘗試著處理側(cè)根以使植株移栽到大田后能吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法中處理后，應(yīng)當(dāng)多澆水，做好田間管理以增加植株存活率.

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【責(zé)任編輯霍歡】

Studies on maize haploid inducing and chemical doubling monoploids

CI Jiabin，YANG Wei，REN Xuejiao，CUI Xueyu，ZHANG Ye，ZHANG Yanhui，YANG Weiguang
(College of Agronomy，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)

Abstract:【Objective】To induce maize haploid and double monoploids.【Method】The F1generation hybrids of high resistance head smut inbred line K88 and high sense of head smut inbred line G115 of North corn regional were chose as female parents，which hybridized with male parents of 5 haploid inducers (JS6-11－JS6-15) conduct maize haploid inducing test.Colchicine was used as maize haploid artificial chromosome doubling agent.Four approaches (dipping root method and dipping bud method，dipping heart leaf method and acupuncturing growing point method) were taken to conduct maize haploid doubling test and each set 3 concentration gradients (0.2，0.4，0.6 mg·mL－1)，using DMSO at volume fraction of 2% + glycerol solution 5% as auxiliary reagents.【Result and conclusion】Filament lengths and the time of pollination had significant effects on the haploid induction.The haploid induced rate of longer silk(≥7 cm) pollination was 17.0% on average，almost 3.3 times higher than that of shorter silk (≤4 cm) pollination.Haploid induced rate of pollination was 18.4% on average after midsummer，almost 3.4 times higher than that in midsummer pollination.The results showed that late pollination and low temperature increased haploid inducing frequency.Maize haploid doubling tests showed that the plant survival rates of dipping root were lower than 50%.Acupuncturing growing point method at concentration of 0.6 mg·mL－1and dipping heart leaf method at concentration of 0.4 mg·mL－1with the fertility rate of plants 45.9% and 28.9%，respectively，with maturing rate of two methods，15.2% and 11.1%，re-book=50,ebook=54spectively.Acupuncturing growing point and dipping heart leaf methods are better options for chromosome doubling.

Key words:maize; haploid; induced rate; monoploid doubling

基金項(xiàng)目:科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化基金(2011G132B100006) ;農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2011-G1-21)

作者簡(jiǎn)介:慈佳賓(1985—)，男，博士研究生，E-mail: cjb6666@163.com;通信作者:楊偉光(1960—)，男，教授，博士，E-mail: ywg789@126.com

收稿日期:2014-02-21

文章編號(hào):1001-411X(2015) 03-0049-05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):S513.032