益氣滌痰化瘀方對哮喘小鼠氣道炎癥及Th1/Th2平衡的影響*

趙文娟，袁嘉麗，陳 靜，邢海晶，韓妮萍

云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

支氣管哮喘是常見的慢性呼吸道疾病之一，是一種對患者、家庭和社會產(chǎn)生明顯影響的慢性疾病。近年來哮喘的患病率在全球范圍內(nèi)有不斷增加趨勢，對人類健康構(gòu)成了較大威脅,是當(dāng)今備受關(guān)注的全球性健康問題。目前，支氣管哮喘的病因和發(fā)病機制并未完全闡明，但已證實哮喘患者存在Th1/Th2分泌的細胞因子發(fā)生失衡，即促進Th1分化的細胞因子IL-12、IFN-γ減少而抑制Th1分化，促進Th2分化的細胞因子IL-4，IL-10分泌增加，導(dǎo)致Th2優(yōu)勢是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵機制之一［1］。目前，通過長期規(guī)范化治療可使哮喘癥狀得到一定控制，但并不能有效阻止病情進展。小劑量長期吸入腎上腺糖皮質(zhì)激素是目前國際首選的治療和控制哮喘的方法［2］，其不良反應(yīng)和副作用顯而易見，尋找副作用小的替代或輔助藥物，是當(dāng)前的研究熱點。中醫(yī)中藥強調(diào)標(biāo)本兼治，重在調(diào)理，在預(yù)防和治療哮喘方面有較大優(yōu)勢。本研究著重探討益氣滌痰化瘀方對哮喘小鼠氣道炎癥及Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)作用，以期初步揭示該方治療哮喘的作用機理，為中醫(yī)治療哮喘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級BALB/C小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由四川省醫(yī)學(xué)實驗動物研究所提供，許可證號：SCXK(川)2008-24，合格證號：0012504，依據(jù)分組不同分籠飼養(yǎng)，自由進食去卵白蛋白(包括雞蛋)的飼料和水，于云南中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心層流架飼養(yǎng)。

1.2 益氣滌痰化瘀方組方及制備 益氣滌痰化瘀方以玉屏風(fēng)散為基礎(chǔ)方，玉屏風(fēng)散來源于《丹溪心法》，在原方用藥劑量(黃芪30 g，防風(fēng)30 g，白術(shù)60 g)的基礎(chǔ)上加浙貝母15 g，白芥子15 g，意在“滌痰”；加丹參 30 g，莪術(shù) 12 g，意在“化瘀”。

實驗用中藥購自云南鴻翔藥業(yè)一心堂連鎖藥店，均為《中國藥典》所載品種，由本校中藥鑒定教研室鑒定其品種和質(zhì)量。全方生藥總量為192 g，在此基礎(chǔ)上經(jīng)過濃縮獲得高、中、低3個劑量。低劑量為臨床等效劑量，低、中、高劑量的比例為1∶2∶5(濃縮至 5倍劑量時，已是能濃縮的極限，故未采取常用的1∶5:10劑量)。

根據(jù)動物體表等效劑量換算法，計算小鼠給藥劑量為每日給生藥總量0.499 2 g，每次灌胃量0.4mL。故192 g生藥采用常規(guī)水煎法煎煮3次，合并3次濾液，再將濾液濃縮獲得濃度分別為1.248，2.497，6.242mg/mL(1∶2∶5)藥液，置于 4℃冰箱冷藏備用。

1.3 其他試劑 卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA，Grade II&V；Sigma公司，美國）；氫氧化鋁凝膠［Al(OH)3，Sigma公司，美國］；小鼠白介素 -4(IL-4)酶聯(lián)免疫分析試劑盒（R&B公司，美國）；小鼠干擾素-γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(R&B公司，美國)；無水乙醇(湖南匯虹試劑有限公司)；二甲苯(湖南匯虹試劑有限公司)；PBS磷酸鹽緩沖液(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。

1.4 主要儀器 醫(yī)用壓縮霧化吸入機(PARI BOYN08，德國百瑞有限公司)；霧化箱［規(guī)格(30×30×20 cm)自制］；微量移液器(Eppendor f公司，德國)；電子天平(AR124CN型，奧豪斯，美國)；離心機(Eppendor f公司，德國)；冰箱(美的，廣東美的集團)；電熱恒溫水浴箱(HH·W21·420型，天津市泰斯特儀器有限公司，中國)；病理切片機(LEICA公司，德國)；組織烘/攤片機(LEICA公司，德國)；光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，日本)；超純水系統(tǒng)(Mi l l ipore公司，美國)；干燥箱(QIC-3型，上海市實驗儀器總廠，中國)；SpectraMax 340PC酶標(biāo)儀(美國分子儀器公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 哮喘模型的制備及實驗分組 按隨機數(shù)字表法將50只BALB/c小鼠分為正常對照組、哮喘模型組及益氣滌痰化瘀方高、中、低劑量組(藥物干預(yù)組)5組，每組10只。模型制備：哮喘模型組和藥物干預(yù)組第l天，第8天，第15天各腹腔注射0.2mL致敏液(含OVA50μg)。第22天開始，2%OVA霧化液 6 mL霧化激發(fā)哮喘，1次 /d，45 min/次，霧化7天。正常對照組以生理鹽水代替OVA［3-4］。模型評價：實驗中觀察小鼠反應(yīng)，出現(xiàn)煩躁不安，呼吸深而快，腹肌抽搐，口唇紫紺，頭面部瘙癢，前肢抬起撓鼻，大小便失禁、煩躁嗆咳及點頭運動等癥狀表明激發(fā)成功。

1.5.2 藥物干預(yù) 每次激發(fā)前30分鐘對實驗小鼠灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7d：正常對照組和哮喘模型組灌胃生理鹽水0.4mL/只。藥物干預(yù)組低、中、高劑量組分別給予6.242、2.497、1.248 g/mL藥液0.4mL/只。

1.5.3 標(biāo)本采集及檢測 各實驗組于最后1次激發(fā)24小時后取材。小鼠摘除眼球采血分離血清，ELISA法檢測血清中細胞因子IL-4、IFN-γ水平。對小鼠左肺進行支氣管肺泡灌洗，離心管收集全部 BALF(回收率＞80%)，約 1.0～1.2 mL。將收集的BALF 12 000 r/min離心10分鐘，棄上清液，沉淀物用200μlPBS重懸，進行BALF炎性細胞總數(shù)計數(shù)與分類計數(shù)［5］。取小鼠右肺組織固定于10%福爾馬林液中，用于制作石蠟切片和肺組織病理學(xué)檢查。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包處理，計量資料以(χ±s)表示，進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠激發(fā)過程中的行為學(xué)觀察 正常對照組小鼠體質(zhì)量較模型組重，毛色光滑，精神好，活動頻繁，呼吸正常，未見呼吸頻率及深度改變；哮喘模型組小鼠毛色無光澤，瘦弱，激發(fā)后可見精神差，呼吸加快，點頭運動，口唇發(fā)紫，前肢撓鼻，煩躁不安，嚴(yán)重者呼吸減慢，節(jié)律不規(guī)則，俯臥少動；藥物干預(yù)組小鼠毛色光滑，激發(fā)后可見與哮喘模型組相似的行為學(xué)變化，但與哮喘模型組比較有較大改善。

2.2 肺組織病理學(xué)觀察(HE染色) 正常對照組小鼠肺組織支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)清晰，氣道黏膜上皮完整，有少量炎性細胞浸潤；哮喘模型組小鼠肺內(nèi)細支氣管及血管周圍有大量炎性細胞浸潤，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見炎性細胞浸潤，管腔狹窄，管腔內(nèi)黏液滲出物明顯增多，肺泡腔間隔擴大、增厚，周圍組織水腫及炎性細胞浸潤。益氣滌痰化瘀方高、中、低劑量組與哮喘模型組相比，肺內(nèi)細支氣管及血管周圍炎性細胞有所減少，尤其是中劑量益氣滌痰化瘀方組較明顯，氣道壁結(jié)構(gòu)完整，氣道上皮黏液分泌物減少。

2.3 各組小鼠BALF中炎性細胞總數(shù)及分類計數(shù)

益氣滌痰化瘀方中劑量組小鼠BALF中白細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞(EOS)、中性粒細胞(NEU)、淋巴細胞(LYM)分類計數(shù)都較哮喘組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

2.4 各組小鼠血清Th相關(guān)細胞因子檢測 益氣滌痰化瘀方高、中劑量組較哮喘模型組小鼠血清IL-4濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；益氣滌痰化瘀方高、中、低劑量組較哮喘模型組小鼠血清IFN-γ濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表明益氣滌痰化瘀方高、中劑量能下調(diào)哮喘小鼠血清IL-4水平，上調(diào)哮喘小鼠血清IFN-γ 水平，見表 2。

表1 益氣滌痰化瘀方對哮喘小鼠BALF中白細胞總數(shù)(×109/L)及分類計數(shù)(%)的影響

表2 益氣滌痰化瘀方對哮喘小鼠IFN-γ和IL-4濃度的影響

3 討論

支氣管哮喘(bronchial asthma，簡稱哮喘)是由多種細胞包括氣道炎性細胞、結(jié)構(gòu)細胞(如嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分(cel lular elements)參與的氣道慢性炎癥性疾?。?］。

研究表明免疫反應(yīng)在支氣管哮喘發(fā)病機制中起重要作用，而T淋巴細胞的Th1/Th2失衡貫穿于哮喘發(fā)病的整個過程。IFN-γ為Th1特征性細胞因子，IL-4為 Th2特征性細胞因子，IFN-γ、IL-4既促進相應(yīng)Th細胞活化，又是其主要效應(yīng)因子，二者相互抑制，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。當(dāng)哮喘發(fā)生時表現(xiàn)為Th2類細胞產(chǎn)生的細胞因子增加,Th1類細胞產(chǎn)生的細胞因子減少，導(dǎo)致Th1/Th2的體內(nèi)失衡，Th2細胞優(yōu)勢引發(fā)超敏反應(yīng)、氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。因此，糾正Th1/Th2失衡，對防治哮喘具有重要意義［6-8］。

支氣管哮喘屬中醫(yī)“哮病”“喘證”“痰飲”范疇，屬本虛標(biāo)實之證，“宿痰伏肺，正氣虧虛，氣滯血瘀”是哮喘的基本病機［9-12］。臨床患者出現(xiàn)喘促及胸悶、胸痛、口唇紫紺、舌質(zhì)紫絳等癥，是痰濕阻滯、瘀血壅阻，為痰瘀互結(jié)表現(xiàn)，加之久病而肺氣虛損，故哮喘病重癥的關(guān)鍵病機為“氣虛痰瘀互結(jié)”，為氣虛痰瘀互結(jié)之證［13］。據(jù)此，從整體觀念出發(fā)提出益氣滌痰化瘀法治療哮喘，擬定益氣滌痰化瘀之驗方，即以玉屏風(fēng)散為基礎(chǔ)方［14-16］，藥用黃芪、防風(fēng)、白術(shù)補益肺氣，浙貝母、白芥子宣肺降氣平喘滌痰，丹參、莪術(shù)活血化瘀，在益氣滌痰的同時，加入活血化瘀之法，消除氣道互結(jié)之痰瘀，即可有效消除因痰阻血瘀結(jié)滯所致的肺失肅降而喘促之證［17-18］。

本研究表明，益氣滌痰化瘀方可減輕氣道炎癥反應(yīng)，促進IFN-γ分泌，抑制IL-4分泌，具有糾正Th1/Th2失衡的功效。益氣滌痰化瘀方治療哮喘的作用機理之一是通過調(diào)節(jié)機體平衡而減輕哮喘急性氣道炎性病變，從而達到防治哮喘的目的。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為陰平陽秘是機體的良好狀態(tài)，陰陽失衡，各臟腑功能失和是疾病發(fā)生的根本原因，因而在治療上強調(diào)辨證施治，標(biāo)本兼顧。這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中免疫平衡的理論是一致的，這是中醫(yī)、西醫(yī)兩種不同科學(xué)體系的異曲同工所在。因此，中醫(yī)藥防治哮喘等免疫失衡性疾病有很好的應(yīng)用前景。益氣滌痰化瘀法對哮喘辨證辨病較之傳統(tǒng)的“急則治標(biāo)，緩則治本”的治則治法，開創(chuàng)性提出痰阻、氣滯、血瘀貫穿哮喘發(fā)病的各個階段，提倡在治療中應(yīng)始終注重標(biāo)本兼治，本研究在此基礎(chǔ)上充分利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)方法和手段進行中醫(yī)藥防治哮喘的實驗研究，深入揭示中醫(yī)藥防治哮喘的作用機理，對指導(dǎo)臨床合理用藥以及開發(fā)防治哮喘的中藥制劑新產(chǎn)品具有重要意義。

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