用細胞學(xué)方法評價10種抗生素的寒熱藥性

王思文，劉建利

（西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室，西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069）

“西藥中藥化”［1］不僅可以擴大中藥品種，而且中藥化了的西藥具有中藥和西藥的雙重優(yōu)勢，不僅具有西藥成分明確、質(zhì)量可控，作用靶點清楚等特點，也具有中藥的性質(zhì)，可以在中醫(yī)理論指導(dǎo)下辨證用藥，必將提高臨床治療效果。西藥中藥化的研究方法主要是通過臨床觀察、總結(jié)獲得西藥的中藥屬性。已經(jīng)對阿托品［2］、利血平［3］、頭孢菌素［4-5］、吲達帕胺（壽比山）［6］、嗎丁啉［7］、氨茶堿［8］等進行了研究。結(jié)果證明西藥確可具有中藥特性，進行西藥中藥化研究是可行的。通過臨床觀察研究西藥中藥化的主要難點在于，其一使用西藥的主要是西醫(yī)，他們大部分人不懂或者對西藥中藥化不感興趣。其二，西藥臨床用藥時常多種藥物配合使用，這樣難以區(qū)分每個藥的中藥屬性。雖然西藥中藥化研究進行了三十多年，也只有極少數(shù)的西藥被賦予了中藥的藥性。因此，不難看出限制西藥中藥化進程的主要原因是缺乏相對應(yīng)的實驗方法。如果有了實驗方法將會大大加快西藥中藥化研究的進程。本文用細胞學(xué)方法評價西藥抗生素的寒熱藥性，為西藥中藥化研究提供實驗方法，促進西藥中藥化的進程。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 儀器：CO2培養(yǎng)箱（Sanyo公司）、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、Quant酶標儀（美國Bio-Tek）、細胞96孔培養(yǎng)板與普通倒置光學(xué)顯微鏡。

藥品與試劑：10種抗生素：氨芐西林（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司）、頭孢克肟片（江蘇正大清江制藥有限公司）、頭孢泊肟酯片（重慶科瑞制藥有限公司）、頭孢氨芐膠囊（石藥集團歐意藥業(yè)有限公司）、頭孢克洛片（石藥集團歐意藥業(yè)有限公司）、阿奇霉素片（石藥集團歐意藥業(yè)有限公司）、克拉霉素片（宜昌長江藥業(yè)有限公司）、羅紅霉素（北京康蒂尼藥業(yè)有限公司）、土霉素片（西安利君制藥有限責任公司）、鹽酸多西環(huán)素（陜西西岳制藥有限公司）。試劑：HyClone改良型RPMI-1640培養(yǎng)液（賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、DMSO（二甲基亞砜）、磷酸緩沖液（PBS）、MTT（Simga公司）、2．5g／L胰蛋白酶（西安舟鼎國生物技術(shù)有限公司）。

1．2 細胞株 由第四軍醫(yī)大學(xué)提供的人肝癌細胞株SMMC7721以及人乳腺癌細胞MCF-7。

1．3 受試藥品溶液的制備 將所選藥物分別碾成粉末，有糖衣的需先刮去糖衣，再分別稱取20mg，將其溶解于1mL DMSO中，制成20mg／mL的儲備液。再用DMSO逐級稀釋至各個待用濃度，于常溫保存。

1．4 實驗方法

1．4．1 確定藥物濃度范圍 將各藥物20mg／mL的儲備液都稀釋為16個濃度梯度，通過多次預(yù)實驗進行濃度篩選，實驗發(fā)現(xiàn)當藥物終濃度低于0．1μg／mL時，多數(shù)藥物對細胞的增殖沒有顯著影響，而當濃度高于100μg／mL時，所有藥物均表現(xiàn)為抑制細胞的增殖。故而將藥物濃度范圍定在0．1～100μg／mL之間，從中選擇8個濃度梯度，使其加入細胞后的終濃度分別為0．1、0．5、1、5、10、20、50、100μg／mL。

1．4．2 MTT法 分別取對數(shù)生長期的兩種細胞，將它們的細胞密度都調(diào)整為5×107／L并接種于96孔板上，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)24h待細胞貼壁。更換新鮮培養(yǎng)基（198μL／孔），同時實驗組每孔加2μL的藥液，對照組加2μL的DMSO，每個加樣組均設(shè)置3個平行孔。加藥完畢后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，更換新鮮培養(yǎng)基（180μL／孔），并加入新鮮配制的 MTT溶液（20μL／孔），繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去上清液，每孔加入150μL DMSO后震蕩，用酶聯(lián)免疫標定儀測定490nm處吸光值。細胞抑制率的計算公式為：細胞抑制率＝（1-實驗組A值／對照組A值）×100%，抑制率為正值時表示為抑制細胞的生長增殖，負值時則為促進細胞的增殖，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2．1 10種抗生素對細胞增殖率的影響 加藥培養(yǎng)48h后用MTT法分別檢測10種抗生素在0．1～100 μg／mL濃度范圍內(nèi)對SMMC7721細胞體外生長增殖的影響，所得實驗數(shù)據(jù)通過t檢驗處理后如表1至表3所示。

表1 抗生素氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢克肟、頭孢克洛對SMMC7721細胞體外增殖的影響Tab．1 Effects of antibacterial drugs ampicillin，cefalexin，cefixime and cefaclor on the proliferation of SMMC7721cells in vitro（±s）

表1 抗生素氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢克肟、頭孢克洛對SMMC7721細胞體外增殖的影響Tab．1 Effects of antibacterial drugs ampicillin，cefalexin，cefixime and cefaclor on the proliferation of SMMC7721cells in vitro（±s）

與對照組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

質(zhì)量濃度（μg／mL）氨芐西林A值 抑制率（%）頭孢氨芐A值 抑制率（%）頭孢克肟A值 抑制率（%）頭孢克洛A值 抑制率（%）0．1 0．209±0．003 3．69 0．324±0．004＊＊ 11．48 0．210±0．002 3．23 0．326±0．004＊＊10．93 0．5 0．191±0．004＊ 11．98 0．293±0．005＊＊ 19．95 0．205±0．003＊ 5．23 0．321±0．003＊＊ 12．30 1 0．181±0．004＊＊ 16．59 0．287±0．005＊＊ 21．85 0．193±0．005＊ 11．06 0．311±0．005＊＊ 15．03 5 0．177±0．005＊＊ 18．43 0．236±0．005＊＊ 35．52 0．184±0．005＊＊ 15．21 0．284±0．004＊＊ 22．40 10 0．161±0．006＊＊ 25．81 0．239±0．006＊＊ 34．70 0．153±0．004＊＊ 29．49 0．275±0．004＊＊ 24．86 20 0．143±0．004＊＊ 34．10 0．214±0．005＊＊ 41．53 0．141±0．003＊＊ 35．02 0．258±0．003＊＊ 29．51 50 0．127±0．005＊＊ 41．47 0．195±0．004＊＊ 46．72 0．133±0．005＊＊ 38．71 0．241±0．004＊＊ 34．15 100 0．117±0．005＊＊ 46．02 0．171±0．006＊＊ 53．28 0．124±0．003＊＊ 42．56 0．235±0．005＊＊ 35．79對照組 0．217±0．005 - 0．336±0．004 - 0．217±0．005 - 0．336±0．004-

表2 抗生素頭孢泊肟酯、土霉素、多西環(huán)素對SMMC7721細胞體外增殖的影響Tab．2 Effects of antibacterial drugs cefpodoxime proxetil，oxytetracycline and doxycycline on the proliferation of SMMC7721 cells in vitro（±s）

與對照組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

質(zhì)量濃度（μg／mL）頭孢泊肟酯A值 抑制率（%）土霉素A值 抑制率（%）多西環(huán)素A值 抑制率（%）0．1 0．344±0．005＊ 6．01 0．316±0．005＊＊ 11．98 0．403±0．005＊＊19．24 0．5 0．329±0．005＊＊ 10．11 0．239±0．004＊＊ 18．38 0．296±0．005＊＊ 40．68 1 0．319±0．003＊＊ 12．84 0．300±0．003＊＊ 16．43 0．342±0．005＊＊ 31．46 5 0．306±0．004＊＊ 16．39 0．244±0．009＊＊ 32．03 0．217±0．005＊＊ 56．51 10 0．289±0．004＊＊ 21．04 0．239±0．003＊＊ 33．43 0．103±0．002＊＊ 79．36 20 0．273±0．004＊＊ 25．41 0．192±0．005＊＊ 46．52 0．104±0．003＊＊ 79．16 50 0．265±0．004＊＊ 27．60 0．153±0．004＊＊ 57．38 0．102±0．004＊＊ 79．56 100 0．211±0．004＊＊ 42．35 0．090±0．004＊＊ 74．93 0．104±0．004＊＊ 79．16對照組 0．336±0．004 - 0．359±0．005 - 0．499±0．06-

表3 抗生素阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素對SMMC7721細胞體外增殖的影響Tab．3 Effects of antibacterial drugs azithromycin，roxithromycin and clarithromycin on the proliferation of SMMC7721cells in vitro（±s）

表3 抗生素阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素對SMMC7721細胞體外增殖的影響Tab．3 Effects of antibacterial drugs azithromycin，roxithromycin and clarithromycin on the proliferation of SMMC7721cells in vitro（±s）

與對照組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

質(zhì)量濃度（μg／mL）阿奇霉素A值 抑制率（%）羅紅霉素A值 抑制率（%）克拉霉素A值 抑制率（%）0．1 0．408±0．004＊＊ 7．06 0．427±0．002＊ 2．73 0．408±0．003＊＊7．06 0．5 0．374±0．003＊＊ 14．81 0．415±0．003＊＊ 5．47 0．400±0．004＊＊ 8．88 1 0．368±0．002＊＊ 16．17 0．407±0．003＊＊ 7．29 0．329±0．003＊＊ 25．06 5 0．333±0．005＊＊ 24．83 0．411±0．003＊＊ 6．38 0．322±0．004＊＊ 26．65 10 0．349±0．001＊＊ 20．50 0．353±0．003＊＊ 19．59 0．316±0．003＊＊ 28．02 20 0．325±0．002＊＊ 25．97 0．295±0．004＊＊ 32．80 0．264±0．004＊＊ 39．86 50 0．291±0．004＊＊ 33．71 0．236±0．004＊＊ 46．24 0．245±0．005＊＊ 44．19 100 0．212±0．005＊＊ 51．71 0．197±0．005＊＊ 55．13 0．199±0．003＊＊ 54．67對照組 0．439±0．005 - 0．439±0．005 - 0．439±0．005-

通過表1～表3的數(shù)據(jù)可以看出這10種抗生素在該濃度范圍內(nèi)對SMMC7721細胞的生長抑制率都為正值，說明這些藥在整個濃度范圍內(nèi)都抑制細胞的生長，并有明顯的濃度依賴關(guān)系，即隨著濃度的增大抑制作用也隨之增強，故判定它們的藥性為寒性。

同樣，用MTT法檢測10種抗生素在0．1～100 μg／mL濃度范圍內(nèi)對MCF-7細胞體外生長增殖的影響，所得實驗數(shù)據(jù)通過t檢驗處理后如表4～表6所示。

表4 抗菌藥氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢克肟、頭孢克洛對MCF-7細胞體外增殖的影響Tab．4 Effects of antibacterial drugs ampicillin，cefalexin，cefixime and cefaclor on the proliferation of MCF-7cells in vitro（±s）

表4 抗菌藥氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢克肟、頭孢克洛對MCF-7細胞體外增殖的影響Tab．4 Effects of antibacterial drugs ampicillin，cefalexin，cefixime and cefaclor on the proliferation of MCF-7cells in vitro（±s）

與對照組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

質(zhì)量濃度（μg／mL）氨芐西林A值 抑制率（%）頭孢氨芐A值 抑制率（%）頭孢克肟A值 抑制率（%）頭孢克洛A值 抑制率（%）0．1 0．213±0．004＊ 9．36 0．205±0．005 2．84 0．224±0．004＊4．69 0．201±0．006 4．74 0．5 0．203±0．005＊＊ 13．62 0．194±0．006＊ 8．06 0．207±0．005＊＊ 11．91 0．194±0．006＊ 8．06 1 0．184±0．005＊＊ 21．70 0．182±0．004＊＊ 13．74 0．198±0．004＊＊ 15．74 0．178±0．003＊＊ 15．64 5 0．185±0．005＊＊ 21．28 0．177±0．004＊＊ 16．11 0．173±0．003＊＊ 26．38 0．172±0．005＊＊ 18．48 10 0．162±0．005＊＊ 31．06 0．162±0．006＊＊ 23．22 0．159±0．005＊＊ 32．34 0．163±0．006＊＊ 22．75 20 0．134±0．004＊＊ 42．98 0．165±0．004＊＊ 21．80 0．144±0．006＊＊ 38．72 0．142±0．005＊＊ 32．70 50 0．121±0．004＊＊ 48．51 0．145±0．005＊＊ 31．28 0．126±0．004＊＊ 46．38 0．114±0．004＊＊ 45．97 100 0．111±0．005＊＊ 52．77 0．121±0．005＊＊ 42．65 0．114±0．005＊＊ 51．49 0．109±0．003＊＊ 48．34對照組 0．235±0．005 - 0．211±0．002 - 0．235±0．005 - 0．211±0．002 -

表5 抗生素頭孢泊肟酯、土霉素、多西環(huán)素對MCF-7細胞體外增殖的影響Tab．5 Effects of antibacterial drugs cefpodoxime proxetil，oxytetracycline anddoxycycline on the proliferation of MCF-7cells in vitro（±s）

表5 抗生素頭孢泊肟酯、土霉素、多西環(huán)素對MCF-7細胞體外增殖的影響Tab．5 Effects of antibacterial drugs cefpodoxime proxetil，oxytetracycline anddoxycycline on the proliferation of MCF-7cells in vitro（±s）

與對照組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

質(zhì)量濃度（μg／mL）頭孢泊肟酯A值 抑制率（%）土霉素A值 抑制率（%）多西環(huán)素A值 抑制率（%）0．1 0．202±0．005 4．27 0．345±0．003＊＊ 13．32 0．374±0．002＊＊12．62 0．5 0．193±0．003＊＊ 8．53 0．339±0．006＊＊ 14．82 0．344±0．002＊＊ 19．63 1 0．189±0．006＊ 10．43 0．361±0．004＊＊ 9．30 0．311±0．003＊＊ 27．34 5 0．179±0．006＊＊ 15．17 0．329±0．003＊＊ 17．34 0．295±0．002＊＊ 31．07 10 0．154±0．006＊＊ 27．01 0．235±0．006＊＊ 40．95 0．219±0．003＊＊ 48．83 20 0．145±0．004＊＊ 31．28 0．207±0．003＊＊ 47．99 0．233±0．002＊＊ 45．56 50 0．148±0．005＊＊ 29．86 0．184±0．003＊＊ 53．77 0．187±0．002＊＊ 56．31 100 0．117±0．005＊＊ 44．55 0．162±0．006＊＊ 59．30 0．155±0．003＊＊ 63．79對照組 0．211±0．002 - 0．398±0．006 - 0．428±0．004-

表6 抗生素阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素對MCF-7細胞體外增殖的影響Tab．6 Effects of antibacterial drugs azithromycin，roxithromycin and clarithromycin on the proliferation of MCF-7cells in vitro（±s）

表6 抗生素阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素對MCF-7細胞體外增殖的影響Tab．6 Effects of antibacterial drugs azithromycin，roxithromycin and clarithromycin on the proliferation of MCF-7cells in vitro（±s）

與對照組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

質(zhì)量濃度（μg／mL）阿奇霉素A值 抑制率（%）羅紅霉素A值 抑制率（%）克拉霉素A值 抑制率（%）0．1 0．338±0．004 0．88 0．322±0．003＊＊5．57 0．332±0．005 2．64 0．5 0．318±0．004＊＊ 6．74 0．313±0．003＊＊ 8．21 0．335±0．004 1．76 1 0．275±0．005＊＊ 19．35 0．285±0．004＊＊ 16．42 0．309±0．002＊＊ 9．38 5 0．226±0．003＊＊ 33．72 0．288±0．005＊＊ 15．54 0．285±0．003＊＊ 16．42 10 0．205±0．003＊＊ 39．88 0．245±0．003＊＊ 28．15 0．159±0．003＊＊ 53．37 20 0．181±0．006＊＊ 46．92 0．204±0．003＊＊ 40．18 0．138±0．003＊＊ 59．53 50 0．158±0．004＊＊ 53．67 0．159±0．005＊＊ 53．37 0．121±0．003＊＊ 64．52 100 0．149±0．005＊＊ 56．30 0．125±0．004＊＊ 63．34 0．102±0．002＊＊ 70．09對照組 0．341±0．004 - 0．341±0．004-0．341±0．004 -

通過表4～表6的數(shù)據(jù)可以看出10種抗生素在該濃度范圍內(nèi)對MCF-7細胞的生長抑制率都為正值，說明這些藥物在整個濃度范圍內(nèi)都抑制細胞的生長，并有明顯的濃度依賴關(guān)系，即隨著濃度的增大，抑制率逐漸增大，抑制作用增強，因而認為這10種抗生素的藥性為寒性。

2．2 10種抗生素對SMMC7721細胞以及MCF-7細胞形態(tài)的影響 選取6種抗生素在最大濃度時（100 μg／mL），對SMMC7721細胞以及 MFC-7細胞抑制效果的照片，并和空白組與對照組比較。照片放大倍數(shù)均為100倍，分別如圖1及圖2所示。

圖2 所選抗生素對MCF-7細胞形態(tài)及密度的影響Fig．2 Effects of the selected antibacterial drugs on the shape and density of MCF-7cells

通過圖1及圖2可以看出，正常的SMMC7721細胞在倒置顯微鏡下觀察，其形態(tài)呈不規(guī)則多邊形，顆粒較大且堆積生長；而MCF-7細胞呈狹長狀，顆粒較小，致密。分別與空白組及對照組比較，發(fā)現(xiàn)以上抗生素均能抑制細胞生長，使得細胞密度均明顯降低，且細胞間結(jié)構(gòu)松散，細胞顆粒感增強。

3 討 論

中藥最重要的藥性當屬寒熱，《神農(nóng)本草經(jīng)》中曾有記載，“療寒以熱藥”，“療熱以寒藥”。古代中醫(yī)名家陶弘景說“藥物甘苦之味可略，唯冷熱須明”。那么，西藥中藥化研究首先要搞清楚的也應(yīng)該是寒熱屬性，至于五味、歸經(jīng)、配伍等可在以后的臨床使用中補充。傳統(tǒng)上中藥寒熱藥性是通過人體對臨床用藥的反應(yīng)總結(jié)獲得的。近年來，研究者應(yīng)用基因組學(xué)技術(shù)［9］、紅外成像原理［10］、生物熱動力學(xué)技術(shù)等［11］對中藥寒熱性進行研究，建立了動物實驗［12-13］、微量熱法［14-15］、紅外掃描［16］、冷熱板示差［17］、細胞學(xué)（MTT法）［18］等方法研究中藥寒熱藥性。對于離體培養(yǎng)的細胞，熱藥促進其生長增殖，寒藥抑制，說明細胞學(xué)方法評價中藥寒熱藥性是切實可行的，且具有簡便、快速、重現(xiàn)性好等諸多優(yōu)點。把它用于西藥寒熱屬性的評價也應(yīng)該可行。

現(xiàn)代西藥高度發(fā)達、品種繁多，而且每年還有數(shù)十種新藥上市。如果能夠把西藥納入中藥的范疇應(yīng)用，無疑會迎來中藥的大發(fā)展。西藥中藥化的障礙是缺乏簡便、可靠的實驗方法，只是依靠臨床總結(jié)，所以進展緩慢。我們所建立的細胞學(xué)方法評價寒熱藥性經(jīng)過數(shù)十種公認寒熱藥性中藥檢驗是可靠的。推廣應(yīng)用于西藥寒熱藥性的評價必將促進西藥中藥化的進程。本文結(jié)果顯示這種嘗試是成功的。

藥物作用于細胞可能會促進細胞的生長，也可能會抑制。以往對公認寒熱性中藥的驗證實驗表明促進表示熱性，而抑制表示寒性。但也有例外，如附子公認為大熱之藥，而對細胞則表現(xiàn)為抑制。后來經(jīng)過反復(fù)實驗驗證發(fā)現(xiàn)熱性太強也會表現(xiàn)為抑制，但這種抑制當將濃度再稀釋時就會變?yōu)榇龠M。即部分熱藥它們濃度大時表現(xiàn)為抑制，而濃度小時則表現(xiàn)為促進。

本文對10種抗生素進行了寒熱藥性的初步評價，該結(jié)果與喬福渠［5］總結(jié)的氨芐西林、頭孢菌素、紅霉素、土霉素等抗菌藥為寒性的結(jié)果一致。從臨床用藥情況看抗生素主要針對熱證患者，其藥性理應(yīng)屬于寒性。

西藥中藥化不僅有利于中藥品種和使用范圍的擴大，也對于西醫(yī)或者患者使用西藥有很強的指導(dǎo)意義。例如，可根據(jù)患者的體質(zhì)來選擇相應(yīng)的藥物，寒性體質(zhì)的患者適宜熱性藥物，反之亦然。由于大部分抗生素顯示寒性，遇到寒性體質(zhì)可供選擇的熱性抗生素非常有限，這時可以考慮配伍其他熱藥，這樣將提高藥物的臨床效果，減少副作用。雖然完整的中醫(yī)辨證需要很有經(jīng)驗的中醫(yī)師，但簡單的寒熱辨證對具有中國文化背景的人都應(yīng)該不難。因此，了解西藥寒熱藥性將是非常有用的，結(jié)果對臨床用藥也很有意義。

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