MIF在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)和意義

蘇洳鋗，蔣依娜，鄧 元，李曉峰，王鴻雁

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院：1．腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061；2．病理科，陜西西安 710061）

乳腺癌患者在免疫表型、病理組織學(xué)形態(tài)、生物學(xué)特征等方面存在明顯個(gè)體化差異。對(duì)病理組織類型和術(shù)后臨床分期大致相同的乳腺癌患者，實(shí)施同一治療方案后，其治療敏感性和預(yù)后轉(zhuǎn)歸也常存迥異?；诖耍橄侔┑姆诸惙中椭鸩骄劢褂诜肿訉用妫?-2］。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一種源于T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用［3］。但MIF與不同分子分型乳腺癌的關(guān)系研究卻少有報(bào)道。本研究擬分析不同分子分型乳腺癌中MIF的表達(dá)差異，比較MIF與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系，探索不同分型乳腺癌的分子生物學(xué)特征。

1 材料與方法

1．1 病例選擇及隨訪 收集2003年1月至2006年12月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院行改良根治切除的乳腺癌標(biāo)本100例。入選病例均有完整的臨床資料，年齡30～73歲，中位年齡52．37歲。腫瘤直徑0．90～7．90cm，平均2．90cm。參照第七版AJCC／UICC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理組織學(xué)分型和術(shù)后臨床分期。非特異性浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌參照Bloom-Richardson半定量法進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)。乳腺癌患者的隨訪從切除術(shù)后開始，至少隨訪5年。終點(diǎn)定義為患者因乳腺癌死亡，排除其他原因死亡和失訪的患者。

1．2 主要試劑 兔抗人ER、PR、HER2單克隆抗體購(gòu)自福州邁新公司；鼠抗人CK5／6、CK14以及兔抗人EGFR購(gòu)自北京中杉金橋公司；鼠抗人MIF單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)圣克魯斯公司。

1．3 免疫組化SP染色 標(biāo)本蠟塊切片，厚度2～4μm。二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，及無水乙醇、950mL／L乙醇、900mL／L乙醇、850mL／L乙醇依次浸泡。30 mL／L甲醇雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水及PBS緩沖液清洗。組織抗原修復(fù)，滴加一抗80μL張，30℃孵育。滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡檢。

1．4 免疫組化陽性定位和判讀標(biāo)準(zhǔn) ①ER、PR表達(dá)定位于細(xì)胞核，呈棕黃色。ER、PR陽性標(biāo)準(zhǔn)：染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比總計(jì)分≥3，為陽性。其中染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：陰性0分，弱陽性1分，中等陽性2分，強(qiáng)陽性3分；陽性細(xì)胞百分比計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為：＜1%為1分，1%～10%為2分，11%～33%為3分，34%～66%為4分，≥67%為5分。②HER2表達(dá)定位于細(xì)胞膜，呈黃色或棕黃色。HER2陽性標(biāo)準(zhǔn)：＞30%癌細(xì)胞呈強(qiáng)且完整的細(xì)胞膜棕褐色為HER2（3＋），即HER2陽性；＞10%癌細(xì)胞呈完整細(xì)胞膜著色，但著色不均勻或強(qiáng)弱不確定為 HER2（2＋），即HER2不確定表達(dá)；癌細(xì)胞不著色或呈不完整的細(xì)胞膜著色為 HER2（-）或 HER2（1＋），即 HER2陰性。③CK5／6、CK14表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色；EGFR表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，呈棕黃色。CK5／6、CK14、EGFR陽性標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)＞10%視為CK5／6、CK14、EGFR陽性。④MIF表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。MIF陽性標(biāo)準(zhǔn)：染色程度分級(jí)與陽性細(xì)胞百分比乘積＞4者為陽性。其中染色程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：不著色0級(jí)，淡黃色1級(jí)，黃色2級(jí)，棕黃或黃褐色3級(jí)。陽性細(xì)胞百分比標(biāo)準(zhǔn)為：＜5%為0級(jí)，5%～25%為1級(jí)，25%～50%為2級(jí)，＞50%為3級(jí)。

1．5 乳腺癌分子分型標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)ER、PR、HER2、CK5／6、CK14、EGFR陽性表達(dá)，將100例乳腺癌標(biāo)本分為L(zhǎng)uminal型、HER2（＋）型、基底細(xì)胞樣型（BLs型）和正常乳腺樣型（NBLs型）。ER（＋）／PR（＋）、且 HER2（＋）者為 Luminal型；ER（-）、PR（-）、且 HER2（＋）者為 HER2（＋）型；ER（-）、PR（-）、HER2（-）、且 CK5／6（＋）／CK14（＋）／EGFR（＋）者為 BLs型；ER（-）、PR（-）、HER2（-）、CK5／6（-）、CK14（-）、EGFR（-）為 NBLs型［5］。

1．6 微血管密度（MVD）計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn) 于低倍鏡下觀察整張切片血管分布情況，選擇癌灶周圍間質(zhì)血管密集區(qū)，在200倍視野內(nèi)計(jì)算3個(gè)不同區(qū)域的MVD數(shù)，取其平均值，換算成／mm2。凡能被CD34標(biāo)記為棕色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞群，則為一個(gè)微血管。有明顯肌層的血管以及硬化區(qū)域的血管則不計(jì)數(shù)。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；樣本方差不齊時(shí)，則選用校正t檢驗(yàn)（t′檢驗(yàn)）。計(jì)數(shù)資料表示為例（百分率），組間比較采用χ2檢驗(yàn)、連續(xù)校正的χ2檢驗(yàn)或確切概率法。等級(jí)資料（腫瘤大小、術(shù)后TMN分期等）的組間比較采用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman雙變量相關(guān)性分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存曲線用Log-rank檢驗(yàn)比較。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 一般資料和分子分型 100例乳腺癌患者均為女性。非特異性浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌67例，浸潤(rùn)性小葉癌16例，髓樣癌11例，黏液癌6例。非特異性浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中Ⅰ級(jí)3例，Ⅱ級(jí)19例，Ⅲ級(jí)45例。臨床Ⅰ期34例，Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ14例。Luminal型、HER2（＋）型、BLs型和NBLs型乳腺癌分布為49%（49例）、15%（15例）、25%（25例）、11%（11例）。見圖1。

2．2 MIF與分子分型的關(guān)系 MIF在Luminal型、HER2（＋）型、BLs型和NBLs型乳腺癌中陽性表達(dá)率分別為34．6%（17／49）、73．3%（11／15）、32%（8／25）、36．3%（4／11）。各分子分型中 MIF表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05，表1）。進(jìn)一步用Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，MIF表達(dá)與HER2（＋）型乳腺癌呈正相關(guān)，提示MIF陽性者多為HER2（＋）型乳腺癌。

圖1 各免疫指標(biāo)的陽性結(jié)果Fig．1 Positive results of immunohistochemistry SP

2．3 MIF與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 MIF在不同年齡、腫瘤大小、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤組織學(xué)類型、病理組織學(xué)分級(jí)和術(shù)后臨床分期的患者間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），但在不同腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的患者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05，表1）。進(jìn)一步用Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，MIF表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示MIF陽性者易發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

表1 不同分子分型及臨床病理參數(shù)的乳腺癌患者的MIF表達(dá)Tab．1 The expression of MIF in different molecular subtypes and clinical pathological parameters of breast cancer

2．4 MIF與MVD的關(guān)系 100例乳腺癌病例中，40例 MIF陽性者 MVD均值為33．23±11．06／200倍視野，明顯高于60例陰性者 MVD均值18．44±5．08／200倍視野，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。提示MIF陽性者M(jìn)VD值較高，腫瘤血管新生明顯。

2．5 MIF與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系 100例乳腺癌患者，死亡59例，5年生存率為41%。40例MIF陽性的患者中31例死亡，中位生存時(shí)間為18個(gè)月；60例MIF陰性的患者中28例死亡，中位生存時(shí)間為36個(gè)月。Kaplan-Meier法示MIF陽性者和MIF陰性者間的生存曲線（圖2）。生存曲線用Log-rank檢驗(yàn)（Log-rank值為19．516，P＝0．000）后證實(shí)，MIF陰性者的5年生存率明顯高于MIF陽性者，提示MIF陽性的乳腺癌患者預(yù)后較差。

圖2 Kaplan-Meier法示MIF陽性者和陰性者的5年生存情況Fig．2 Kaplan-Meier method showed 5-year overall survival of the patients with positive-MIF expression and negative-MIF expression

3 討 論

乳腺癌分子分型大致為4種：Luminal型、HER2（＋）型、BLs型和NBLs。每個(gè)分型可進(jìn)一步再分類［4］。分型依據(jù)主要為各分型間蛋白標(biāo)記物表達(dá)的差異。雖有學(xué)者提出，免疫組化劃分分子亞型與標(biāo)準(zhǔn)的基因芯片劃分方法有一定差異，但前者已能基本反映乳腺癌各分子分型特征，且敏感性在76%，特異性為100%［5］，故已被普遍認(rèn)可。本研究亦采用免疫組化SP法，根據(jù)ER、PR、HER2、CK5／6、CK14、EGFR表達(dá)差異，將100例乳腺癌劃分為L(zhǎng)uminal型、HER2（＋）型、BLs型和NBLs型。因樣本量限制，未對(duì)每個(gè)分型再分類。分型操作過程簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)。各分子分型乳腺癌的發(fā)病率尚無統(tǒng)一定論［6］。KIM 等［7］對(duì)776例浸潤(rùn)性乳腺癌進(jìn)行分子分型歸類后發(fā)現(xiàn)，Luminal A型發(fā)病率約44．5%，Luminal B型7．8%，HER2（＋）型17．1%，BLs型14．7%。IHEMELANDU 等［8］同樣大樣本量分析了乳腺癌各分子分型發(fā)病率，結(jié)果顯示Luminal A 型、Luminal B型、BLs型、HER2（＋）型發(fā)病率為50%、14．1%、23．2%、12．7%。本研究樣本中Luminal型分布最多（49例），符合既往文獻(xiàn)中Luminal型高發(fā)病率的結(jié)論。

近年來，有關(guān)MIF在乳腺癌中表達(dá)及臨床意義的報(bào)道并不少見。但本研究將MIF與乳腺癌分子分型聯(lián)系起來，對(duì)此較少涉及的方向進(jìn)行探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MIF陽性者多見于 HER2（＋）型乳腺癌，提示HER2（＋）型乳腺癌的一個(gè)重要分子特征很可能是MIF陽性?；仡櫦韧芯浚煌肿臃中腿橄侔盒陨飳W(xué)特征存在明顯差異。HER2（＋）型乳腺癌多腫瘤直徑較大，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多見，病理分期較晚，預(yù)后較差［9］。乳腺癌各分型的預(yù)后研究也指出，Luminal A型預(yù)后最佳，Luminal B型和 NBLs型預(yù)后較好，而BLs型和 HER2（＋）型預(yù)后最差［10-11］。

在MIF影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究中，已證實(shí)炎癥細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間存在某種協(xié)同關(guān)系。在腫瘤細(xì)胞侵襲區(qū)域及其鄰近間質(zhì)組織中，多有巨噬細(xì)胞聚集。巨噬細(xì)胞通過分泌MIF等生物因子，協(xié)助腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶類，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，并提供腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，促進(jìn)腫瘤血管新生［12］。本研究比較了不同臨床病理參數(shù)乳腺癌患者的 MIF表達(dá)，分析了MIF陽性組和陰性組MVD值差異，并比較了MIF陽性者和陰性者的5年生存情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MIF陽性者易發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤新生血管更為明顯，且預(yù)后較差。HAWKINS等［13］研究顯示，MIF在乳腺癌中的表達(dá)程度直接關(guān)系到腫瘤的預(yù)后評(píng)估和治療策略。HLA可通過影響MIF，一定程度發(fā)揮乳腺癌免疫靶向治療的作用。SCHULZ等［14］在MIF促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究中指出，HER2／ErbB2過表達(dá)可控制HSF1活性。而 MIF、AKT和HSF1間的相互影響會(huì)促進(jìn)HER2（＋）型乳腺癌惡性生長(zhǎng)。結(jié)合本研究結(jié)果，MIF的表達(dá)程度很可能是乳腺癌惡性生物學(xué)特征的一個(gè)重要促進(jìn)因素。FERSCHING等［13］研究表明，乳腺癌預(yù)后標(biāo)記物合理篩選直接關(guān)系到手術(shù)、化療等治療策略的制定，以及有效減少化療毒副作用。而 MIF、sFAS、CEA、CA15-3等生物因子的表達(dá)程度對(duì)評(píng)估乳腺癌預(yù)后意義重大。MIF可作為一種預(yù)測(cè)癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后的標(biāo)志物。

綜上所述，基于MIF促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的正性作用和HER2（＋）型乳腺癌高于其他分型（Luminal或NBLs）的生物學(xué)特征，我們推測(cè)：MIF不僅是HER2（＋）型乳腺癌的一個(gè)分子特征，而且直接或間接影響了HER2（＋）型的惡性生物學(xué)特征。針對(duì)HER2（＋）型乳腺癌的抗MIF靶向藥物，很可能是一種乳腺癌靶向治療新思路。雖然MIF與HER2（＋）型乳腺癌惡性生物學(xué)特征的關(guān)系仍待大樣本量研究給予證實(shí)，但探索不同分型乳腺癌的分子生物學(xué)特征和潛在靶向治療靶點(diǎn)臨床意義重大。

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