Fas／FasL／Caspase-9凋亡基因多態(tài)性和環(huán)境危險因素的交互作用與腰椎間盤突出癥的關系

袁啟令，李新友，劉 亮，蔡永松，葉茂林，張銀剛

（1．西安交通大學醫(yī)學部第一附屬醫(yī)院骨科，陜西西安 710061；2．西安交通大學附屬紅會醫(yī)院關節(jié)外科，陜西西安 710054；3．河南中醫(yī)學院，河南鄭州 450000）

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）的發(fā)病率較高，是引起腰腿痛最主要的原因，其致殘及社會負擔已成為一項重大的公共衛(wèi)生難題［1］。LDH的基本病理是腰椎間盤退變（LDD）。以往對LDH病因?qū)W的研究大多集中于環(huán)境危險因素，如重體力作業(yè)、抬舉重物、彎腰扭腰、全身震動及靜態(tài)作業(yè)姿勢等職業(yè)因素均可加速椎間盤退變，導致椎間盤內(nèi)壓力增高，使得纖維環(huán)強度減弱，形成腰椎間盤突出的病理基礎。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，腰椎負荷、家族史、平均體重指數(shù)、業(yè)余活動、業(yè)余運動、社會心理等是重要的風險因素［2］。然而，環(huán)境風險因素難以完全解釋LDH的發(fā)病機制。近期研究發(fā)現(xiàn)，LDH的遺傳力達到52%～68%［3］，提示遺傳因素可能在LDH的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。目前，多數(shù)學者認為LDH很可能是由遺傳因素和環(huán)境因素相互協(xié)同導致的一種復雜性疾病。近年來，隨著高通量測序技術的快速發(fā)展，復雜性疾病易感基因的定位與功能研究已成為當前研究熱點之一，大量常見疾病的易感基因被相繼定位出來。目前，在椎間盤退變方面的研究雖然也取得了一些進展［4-5］，但LDH的易感基因與環(huán)境風險因素在LDH發(fā)病中的聯(lián)合作用機制仍存在空白。闡明LDH環(huán)境-基因的聯(lián)合作用途徑，將有助于闡明LDH的發(fā)病機制，進而開發(fā)有效的早期預防及治療措施。

既往對椎間盤退變的病理過程研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡是其重要的環(huán)節(jié)之一［6-7］。對于腰椎間盤退變的凋亡通路，目前研究發(fā)現(xiàn)主要涉及兩條途徑：Fas／FasL介導的死亡受體途徑，也叫外源性途徑；線粒體途徑，也稱內(nèi)源性途徑。在死亡受體通路中，F(xiàn)as（也稱CD95）介導的凋亡通路最為典型，F(xiàn)asL通常以三聚體的形式出現(xiàn)，3個Fas受體與1個FasL結(jié)合，三聚體與配體結(jié)合后，F(xiàn)as通過其胞內(nèi)的死亡結(jié)構域與其銜 接 子 蛋 白 FADD（Fas-associated protein with death domain）梭基端的死亡結(jié)構域相互作用，募集細胞中的FADD，同時FADD的死亡效應結(jié)構域與Caspase-8酶原中的死亡效應結(jié)構域相互作用，從而募集細胞中Caspase-8酶原，形成死亡誘導信號復合體（death-inducing signing complex，DISC）［8］。在凋亡的線粒體依賴途徑中，Caspase接受死亡信號，啟動凋亡，激活下游分子，降解細胞骨架、蛋白質(zhì)和核酸等，是凋亡的真正執(zhí)行者。而Caspase-9是處在該途徑頂端的關鍵蛋白酶。效應Caspase無法選擇性地結(jié)合凋亡蛋白酶活化因子（Apaf-1），因此它們對Caspase-9具有依賴性［9］?；诖耍覀兺茰yFAS、FASL、Caspase-9在椎間盤退變中可能有重要作用。

在本研究中，我們采用病例-對照研究設計，探討凋亡相關基因FAS、FASL和Caspase-9的多態(tài)性與腰椎間盤突出癥的相關性，鑒定陽性關聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點，并分析其與環(huán)境危險因素的交互致病模式。在預實驗中（30個病例和對照），我們發(fā)現(xiàn)CASP-9rs2308941、rs2308950、FASL INV2nt-124A＞G rs5030772多態(tài)性在中國漢族人群不存在。因此，在本研究中，我們僅探討了Fas-1377G／A rs2234767、Fas-670G／A rs1800682、Fas rs2147420、Fas rs2296603、Fas rs7901656、Fas rs1571019、FasL-844C／T rs763110、CASP-9-1263A＞G rs4645978、CASP-9-712C＞T rs4645981 9個SNP位點。

1 材料與方法

1．1 研究對象 病例組由131例來源于在2005年1月至2007年1月間西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院、陜西省人民醫(yī)院和西安唐都醫(yī)院的門診LDH患者組成。這些患者由于各種相關癥狀或體征來院就診，例如腰腿疼、CT和（或）MRI診斷的腰椎間盤突出且伴有坐骨神經(jīng)痛。排除了腰椎椎管狹窄、腰椎先天發(fā)育異常、腰椎內(nèi)腫瘤和腰椎滑脫。從住院患者或接受醫(yī)學檢查的患者當中采用電腦軟件隨機選取137例對象作為對照組，這些對象在目前或一個多月內(nèi)沒有腰痛史和（或）坐骨神經(jīng)痛，沒有腰椎創(chuàng)傷導致的腰椎不穩(wěn)，沒有腰椎側(cè)凸和腰椎滑脫。所有研究對象都為中國北方漢族，對照組和病例組按照性別、年齡和生活環(huán)境進行了1∶1匹配。

1．2 環(huán)境危險因素 根據(jù)前期研究結(jié)果，選擇LDH潛在環(huán)境風險因素，并采用問卷調(diào)查進行定量評估。主要包括：①腰椎負荷的分級：以瑞典斯德哥爾摩肌肉骨骼疾病研究中心的體力負荷評估問卷為核心，并根據(jù)BATTIE等［10］對職業(yè)分級積分標準并結(jié)合國內(nèi)實際情況將腰椎負荷大小用職業(yè)積分代替：（很輕）＝（無固定職業(yè)，且很少有體力勞動）；（輕）＝（工作以坐位為主）；（中）＝（工作以彎腰扭腰和全身震動為主）；（重）＝（工作以提舉重物和重體力勞動為主）。②吸煙的定義：每天至少吸1支煙并持續(xù)1年，或每年累計量大于18包為吸煙，并依次計算吸煙指數(shù)（包年）＝吸煙年限×每天吸煙支數(shù)×20-1。③飲酒的定義：平均每周飲酒達到兩次，每次至少2兩且持續(xù)1年以上為飲酒。④業(yè)余活動：主要指工作之余的活動，如家務勞動。⑤業(yè)余運動：即健身鍛煉，要求每次持續(xù)≥20min，直至心跳加快和出汗。

1．3 SNP基因型分型 采集外周靜脈血，用蛋白酶K和苯酚／氯仿從白細胞中提取DNA。用分光光度計（NanoDrop ND-100，F(xiàn)oster，USA）對提取的DNA進行定性和定量。用Mass ARRAY Assay設計軟件（Sequenom，Salt Lake City，USA）設計擴增及等位基因引物延伸。表1中為寡核苷酸引物。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）混合物包括5ng基因組DNA（5ng／μL），每種特異性引物各1μL，每種dNTP各2．5mmol／L，3．25mmol／L MgCl2，和0．5U的 Hot-Star Taq DNA聚合酶（5U／μL，Qiagen，Valencia，CA，USA）。PCR擴增程序：94℃15min；變性94℃20s，延伸56℃30s，退火72℃1min，共計45個循環(huán)；最后，72℃3min。用改良基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析法（Brucker，Billerica，MA，USA）對產(chǎn)物進行分析。

表1 質(zhì)譜分析的凋亡基因多態(tài)性位點的引物Tab．1 The primers of single nucleotide polymorphic（SNP）sites of apoptosis genes analyzed by mass spectrometer

1．4 環(huán)境-基因交互作用分析 本研究采用多因素Logistic回歸模型檢測環(huán)境風險因素與候選基因的交互致病作用?；貧w模型中包括遺傳因素、環(huán)境危險因素、兩者交互組成的變量，以及年齡、性別、身高和體重協(xié)變量。假設：在沒有環(huán)境危險因素的條件下，基因多態(tài)性和疾病危險性的增加無關，只有在暴露于環(huán)境危險因素條件下，基因突變才會影響疾病的患病風險；KHOURY等［11］將這稱為2型交互作用，根據(jù)交互系數(shù)（＝βeg／βe）來判斷是否有交互作用、交互方式和強度。判定依據(jù)1：OReg＝ORe＋ORg為相乘模型；OReg＞ORe＋ORg為超相乘模型；OReg＜ORe＋ORg為次相乘模型；OReg＝ORe＋ORg-1為相加模型。判定依據(jù)2：在病例-對照研究中，g為兩變量交互作用系數(shù)。若＞1，表示遺傳因素對環(huán)境暴露的效應有放大作用；若＜1，則表示遺傳因素對環(huán)境暴露的效應有減弱作用；若＝1，則表示遺傳因素與環(huán)境暴露沒有交互作用。如果所研究的環(huán)境因素是危險因素，此時βe大于0，為負值，則表示基因有保護作用。

1．5 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 17．0統(tǒng)計學軟件進行χ2檢驗，比較病例組和對照組之間年齡、性別、吸煙和各基因型分布差異。采用Excel進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。以年齡、性別、身高和體重作為協(xié)變量，采用非條件Logistic回歸模型分析各SNP位點多態(tài)性和LDH患病風險的關系，并以比值比（odds rations，ORs）及其95%可信區(qū)間（confidence intervals，CIs）表示相對危險度。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2．1 研究對象的基本資料 本研究收集了病例131例，對照137例；DNA樣品經(jīng)PCR-RFLP的電泳和質(zhì)譜分析后有8例（其中病例組3例，對照組5例）不符合要求，故將此8例樣本排除，最終有128例LDH患者和132例正常對照進入研究，其基本資料見表2。分析發(fā)現(xiàn)，年齡、性別、體重、吸煙和飲酒在病例組與對照組分布差異無統(tǒng)計學意義，而病例組與對照組在業(yè)余勞動（P＝0．011）、睡床類型（P＝0．003）和脊柱負荷指數(shù)上差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．001）。

表2 研究對象的基本資料Tab．2 The basic characteristics of the subjects

2．2 凋亡基因的多態(tài)性和腰椎間盤突出癥患病風險的相關性 Hardy-Weinberg平衡檢驗發(fā)現(xiàn)，3個基因9個SNP位點在病例組和對照組，男性和女性及全體研究樣本中3種基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0．05），提示研究樣本有較好的代表性，即能代表一般人群。關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，3個基因9個多態(tài)性位點中，只有FasL-rs763110、CASP-9-rs4645978和腰椎間盤突出癥風險顯著關聯(lián)（P＜0．05）。FasL-844中CT基因型者患LDH的危險性是 CC者的1．227倍（χ2＝0．615；95%CI：0．736～2．048），TT基因型者患 LDH 的危險性是CC者的3．128倍（χ2＝4．601；95%CI：1．059～9．242），T等位基因攜帶者患LDH的危險性是C等位基因者的1．329倍（χ2＝2．047；95%CI：0．900～1．963），TT基因型與CC基因型相比差別有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。CASP-9-rs4645978中 AG基因型者患LDH 的危險性是AA者的1．570倍（χ2＝2．701；95%CI：0．915～2．692），GG 基因型者患LDH的危險性是 AA者的2．760倍（χ2＝10．08；95%CI：1．464～5．203），G等位基因攜帶者患LDH的危險性是A等位基因者的1．572倍（χ2＝9．122；95%CI：1．171～2．110），GG基因型與 AA 基因型相比差別有統(tǒng)計學意義（P＜0．05，圖1、圖2）。

2．3 凋亡基因的多態(tài)性和環(huán)境危險因素的交互作用FasL-844C／T基因多態(tài)和環(huán)境危險因素的交互作用分析見圖3。在多種環(huán)境因素中，可以確定腰椎負荷與FasL-844C／T為超相乘模型。我們用輕表示腰椎負荷1～2級，用重表示腰椎負荷3～4級。調(diào)整了年齡、性別、身高、體重、家族史、吸煙、睡床類型、業(yè)余活動和業(yè)余運動后，單獨暴露于腰椎負荷3～4級的ORe為3．49（95%CI：1．58～7．69）；單獨FasL-844TT基因型的 ORg為3．16（95%CI：0．73～13．75）；FasL-844TT基因型和腰椎負荷3～4級同時存在的OReg為21．1（95%CI：2．43～182．67）。OReg21．0＞3．49×3．16，提示FasL-844TT基因型和腰椎負荷3～4級交互作用機制在LDH發(fā)生中為超相乘模型（P＝0．006）。

CASP-9-rs4645978基因多態(tài)和環(huán)境危險因素的交互作用分析結(jié)果如圖4所示。在多種環(huán)境因素中，可以確定腰椎負荷與CASP-9-rs4645978為次相乘模型。調(diào)整了年齡、性別、身高、體重、吸煙、睡床類型、業(yè)余活動和業(yè)余運動后，單獨暴露于腰椎負荷3～4級的ORe為5．67（95%CI：2．08～15．45）；單獨CASP-9-rs4645978GG基因型的 ORg為1．55（95%CI：0．51～4．69）；CASP-9-rs4645978GG基因型和腰椎負荷3～4級同時存在的OReg為7．40（95%CI：1．77～30．94）。OReg7．40＜1．55×5．67，提示CASP-9-rs4645978GG基因型和腰椎負荷3～4級交互作用機制在LDH發(fā)生中為次相乘模型，有統(tǒng)計學意義（P＝0．006）。

圖1 凋亡基因的多態(tài)性和腰椎間盤突出癥風險（第一部分）Fig．1 The risk of lumbar disc herniation associated with polymorphisms of apoptosis genes（Part 1）

圖2 凋亡基因的多態(tài)性和腰椎間盤突出癥風險（第二部分）Fig．2 The risk of lumbar disc herniation associated with polymorphisms of apoptosis genes（Part 2）

圖3 FasL-844C／T基因多態(tài)性和環(huán)境危險因素的交互作用Fig．3 Interaction between polymorphisms of FasL-844C／T gene and environmental risk factors

3 討 論

在本研究中，我們采用病例-對照關聯(lián)研究方法探討凋亡相關基因Fas、FasL、CASP-9 3個基因9個SNP位點與腰椎間盤突出癥患病風險的關系。結(jié)果顯示，只有FasL-844C／T（rs763110）、CASP-9-1263A＞G（rs4645978）與腰椎間盤突出癥風險顯著關聯(lián)，其中FasL-844C／T TT基因型、CASP-9-1263A＞G GG基因型可能是腰椎間盤突出癥的危險因素。進一步對 FasL-844C／T（rs763110）、CASP-9-1263A＞G（rs4645978）和環(huán)境危險因素的交互作用分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)asL-844TT基因型和腰椎負荷3～4級交互作用在LDH發(fā)生中為超相乘模型，CASP-9-rs4645978 GG基因型和腰椎負荷3～4級交互作用在LDH發(fā)生中為次相乘模型。

對于環(huán)境與基因交互作用的評價，最重要是對環(huán)境因素的量化評價。雖然脊柱負荷（應力）是腰椎間盤突出癥的最重要的危險因素，但脊柱負荷的評價缺乏體內(nèi)生物標記物。目前，國內(nèi)外無較權威和通用的關于腰椎負荷等級的定義，我們所定義的腰椎負荷等級分類還需進一步檢驗，還需制定更合理的腰椎負荷等級分類。腰椎間盤突出癥是個復雜性疾病，涉及基因-基因，基因-環(huán)境，基因-年齡等眾多模式，由于樣本量的原因，我們僅對基因-環(huán)境的交互作用進行了分析。為了獲得機制的全貌，需要更大的樣本量。

圖4 CASP-9-rs4645978基因多態(tài)和環(huán)境危險因素的交互作用Fig．4 Interaction between polymorphisms of CASP-9-rs4645978gene and environmental risk factors

對于凋亡相關基因與腰椎間盤突出癥風險的研究，顯 示 只 有 FasL-844C／T（rs763110），CASP-9-1263A＞G（rs4645978）和腰椎間盤突出癥風險有關聯(lián)。已發(fā)現(xiàn)的Fas啟動子區(qū)存在2個SNP：-1377G／A多態(tài)和-670A／G多態(tài)，這兩個多態(tài)在功能上有重要的意義。Fas-1377G／A多態(tài)位于轉(zhuǎn)錄子SP-1的結(jié)合部位，-1377A等位基因可破壞SP-1的結(jié)合部位，啟動子活性下降。Fas-670A／G多態(tài)則位于IFN γ活 化 信 號 （gamma interferon activation signal，GAS）中，GAS在IFNγ-STAT-1通路中有重要作用，細胞轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT-1）與GAS結(jié)合，可激活啟動子。Fas-670G等位基因可破壞GAS，影響STAT-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，因而降低啟動子活性，F(xiàn)as基因表達下降。但是這兩個位點并沒有發(fā)現(xiàn)與腰椎間盤突出癥有關聯(lián)，這可能是廣泛表達于椎間盤細胞表面的Fas基因微小的變化尚不足以分析出其與LDH風險的關系。因此，需要更大的樣本量和更有效的統(tǒng)計工具進一步深入研究。FasL-844T／C存在FasL啟動子區(qū)，位于CAAT／enhancer-binding proteinβ轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序。FasL-844C等位基因可比T等位基因產(chǎn)生更高水平的FasL表達。有研究提示攜帶FasL-844CC基因型者Fas表達下降和／或FasL表達增加，發(fā)生腫瘤的風險增大［12］。而我們的結(jié)果顯示FasL-844C／T TT基因型與腰椎間盤突出癥的風險有關，攜帶FasL-844TT基因型者患LDH的風險是攜帶FasL-844CC基因型者的3．128倍。我們推測，對于攜帶FasL-844TT基因型的個體，其椎間盤髓核中FasL的表達較攜帶FasL-844CC基因型的個體低，過低表達的FasL與浸潤到椎間盤內(nèi)活化的淋巴細胞表面Fas結(jié)合的機會減少，致使活化的淋巴細胞凋亡降低，即椎間盤組織獲得免疫赦免的機會降低，引起椎間盤組織發(fā)生破壞性的免疫反應，最終導致LDD加速。

PARK等［13］進行了一項關于朝鮮族CASP-9基因多態(tài)性和原發(fā)性肺癌發(fā)病風險的研究。結(jié)果表明，與-1263AA基因型或結(jié)合的-1263AA和AG基因型相比，CASP-9-1263GG基因型與肺癌風險顯著降低存在相關性。但是，與含有CC基因型的個體相比，至少有1個CASP-9-712C／T的T等位基因者的肺癌風險顯著增高。凋亡失活是癌癥特征之一，它允許有基因損傷傾向的細胞繼續(xù)存活［14］。相反，凋亡激活導致退變椎間盤中細胞的減少。我們猜測，在攜帶CASP-9-1263GG基因型的個體中，CASP-9的表達和（或）活性可能相對較高，椎間盤細胞的凋亡會明顯增強。椎間盤細胞維持著大量細胞外基質(zhì)。因此，當細胞數(shù)量大量減少，椎間盤易于退變就顯得不足為奇。在退變加速過程中，可能最終會發(fā)生椎間盤放射狀撕裂。

由于人類疾病多是由遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，機體損傷反應不僅與暴露于環(huán)境有害因素的程度有關，同時還與遺傳易感性或耐受性有著密切聯(lián)系，即存在環(huán)境與基因交互作用。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)asL-844C／T（rs763110）、CASP-9-1263A＞G（rs4645978）和腰椎負荷有交互作用。這提示，LDH可能是由多種環(huán)境危險因素和遺傳易感基因協(xié)同作用所致，不同基因型和同一環(huán)境因素或不同環(huán)境因素的交互作用機制不同。所以，針對LDH高危人群制定預防措施時，應把環(huán)境因素和基因型結(jié)合起來考慮。對于我們的研究，仍需要許多工作來做，下一步將對本研究獲得的易感基因多態(tài)性通過更直接的方式驗證，如將含凋亡多態(tài)性基因的細胞在不同應力下進行培養(yǎng)以觀察其凋亡率等。

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