缺氧相關(guān)蛋白HIF-1α和CAIX在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的表達(dá)

周偉華，安瑞芳

（1．西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710061；2．西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004）

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾?。╣estational trophoblastic disease，GTD）是一組來(lái)源于胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的疾病，一般包括葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨毛膜癌、胎盤(pán)部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤和上皮樣滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。我國(guó)是GTD高發(fā)國(guó)度之一，嚴(yán)重威脅育齡期婦女的健康，且發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。缺氧是進(jìn)展性實(shí)體腫瘤最常見(jiàn)的現(xiàn)象，與腫瘤的多種生物學(xué)行為密切相關(guān)［1］。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）是腫瘤細(xì)胞在缺氧調(diào)控中的核心因子，可誘導(dǎo)激活多種缺氧相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［2］。碳酸酐酶IX（carbonic anhydrase IX，CAIX）是一種跨膜糖蛋白，是HIF-1α調(diào)控的重要靶基因，通過(guò)催化H2O＋CO2和H＋＋HCO3-的相互轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的pH值變化［3］。目前已證實(shí)，HIF-1α和CAIX在人類多種固體腫瘤中存在過(guò)度表達(dá)且與其生物學(xué)行為相關(guān)，但在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)二者在正常早孕絨毛和GTD中的表達(dá)，以期為GTD的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象 正常早孕絨毛組（NP組）：2012年6月至2012年9月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院婦科人流室收集32例新鮮早期妊娠絨毛組織（6～9周），均為計(jì)劃外妊娠，無(wú)內(nèi)外科合并癥及異常妊娠史。常規(guī)甲醛液固定，石蠟包埋。

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病組：收集自1993年至2012年期間在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院組織病理學(xué)確診的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病蠟塊存檔標(biāo)本61例，其中葡萄胎33例（HM組），均為首次清宮標(biāo)本，侵襲性葡萄胎26例（IM組），均為手術(shù)標(biāo)本。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法 兔抗人HIF-1α多克隆抗體（cat＃2015-1）及兔抗人CAIX多克隆抗體（cat＃3829-1）均購(gòu)于Epitomics生化公司；SP試劑盒（GK500710）購(gòu)于基因科技上海有限公司。

標(biāo)本連續(xù)切片，厚度約4μm，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行S-P法染色。HIF-1α抗體、CAIX抗體的稀釋濃度分別為1∶20、1∶200。陰性對(duì)照：一抗由0．01mol／L PBS溶液代替；陽(yáng)性對(duì)照：前列腺癌組織切片染色。

1．3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) HIF-1α陽(yáng)性染色標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒；CAIX陽(yáng)性染色標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒；染色強(qiáng)度均由淡黃色至棕黃色。結(jié)果判定參考半定量積分方法，每張切片隨機(jī)選取觀察5個(gè)高倍視野（×400）進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度及著色細(xì)胞占觀察細(xì)胞的百分比進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，具體標(biāo)準(zhǔn)如表1。根據(jù)以下兩項(xiàng)結(jié)果之和確定每張切片的陽(yáng)性程度：≥3分為陽(yáng)性表達(dá)（＋），＜3分為陰性表達(dá)（-）。

表1 陽(yáng)性結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法Tab．1 Statistical methods of positive results

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用卡方檢驗(yàn)（當(dāng)1≤T＜5時(shí)，用連續(xù)性校正公式計(jì)算卡方值；當(dāng)N≤40或T＜1時(shí)，用Fisher's確切概率法），相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)法。P＜0．05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 HIF-1α在NP、HM、IM中的表達(dá)情況 HIF-1α主要表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核。在NP中以淡黃色顆粒表達(dá)為主，陽(yáng)性細(xì)胞呈彌散分布；在HM中以黃色顆粒表達(dá)為主，陽(yáng)性細(xì)胞呈彌散分布；在IM中以棕黃色粗大深染顆粒表達(dá)為主，陽(yáng)性細(xì)胞呈局灶性分布，且染色強(qiáng)度較正常早孕絨毛和葡萄胎組織明顯增強(qiáng)（圖1）。

圖1 HIF-1α在NP（A）、HM（B）和IM（C）中的表達(dá)Fig．1 The expression of HIF-1αin normal pregnancy villi（A），hydatidiform moles（B）and invasive hydatidiform moles（C）（×400）

HIF-1α在IM中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于HM和NP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；HM和NP組間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05，表2）。在26例IM中，術(shù)前未化療12例，化療14例，HIF-1α表達(dá)的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05，表3）。

表2 HIF-1α在NP、HM和IM中的表達(dá)情況Tab．2 The expression of HIF-1αin NP，HM and IM

表3 HIF-1α的表達(dá)水平與化療的關(guān)系Tab．3 Relationship between the expression of HIF-1αand chemotherapy

2．2 CAIX在NP、HM和IM中的表達(dá)情況 CAIX蛋白主要表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜。在NP中以淡黃色顆粒表達(dá)為主，陽(yáng)性細(xì)胞呈彌散分布；在HM中幾乎呈陰性表達(dá)；在IM中以粗大深染的棕黃色顆粒表達(dá)為主，陽(yáng)性細(xì)胞呈彌散分布，且染色強(qiáng)度較NP和HM明顯增強(qiáng)（圖2）。

圖2 CAIX在NP（A）、HM（B）和IM（C）中的表達(dá)Fig．2 The expression of CAIX in normal pregnancy villi（A），hydatidiform moles（B）and invasive hydatidiform moles（C）（×400）

CAIX在IM中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于HM和NP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；在 HM中幾乎呈陰性表達(dá)，與NP組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，表4）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在IM中術(shù)前化療組與未化療組間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05，表5）。

表4 CAIX在NP、HM和IM中的表達(dá)情況Tab．4 The expression of CAIX in NP，HM and IM

2．3 HIF-1α和CAIX在IM中表達(dá)的相關(guān)性分析在IM中，HIF-1α和CAIX的表達(dá)都明顯高于NP組及HM組，但Spearman相關(guān)性分析表明，HIF-1α和CAIX的陽(yáng)性表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（r＝-0．374，P＝0．082，表6）。

表5 CAIX的表達(dá)水平與化療的關(guān)系Tab．5 Relationship between the expression of CAIX and chemotherapy

表6 HIF-1α和CAIX在GTN中表達(dá)的相關(guān)性Tab．6 Relationship between HIF-1αand CAIX expressions in GTN

3 討 論

腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的前提和保障。缺氧是進(jìn)展性實(shí)體腫瘤微環(huán)境中最常見(jiàn)的現(xiàn)象，與腫瘤的多種生物學(xué)行為密切相關(guān)。HIF-1α和CAIX作為可靠的缺氧標(biāo)記物，在多種惡性腫瘤中存在過(guò)度表達(dá)，且與腫瘤的惡性進(jìn)展、對(duì)放化療的抵抗及不良預(yù)后相關(guān)［4-5］。目前，眾多研究都表明以HIF-1α為靶點(diǎn)的治療可能成為腫瘤治療的重要手段［6］。

本研究結(jié)果顯示，HIF-1α的表達(dá)隨著GTD疾病的進(jìn)展而呈上升趨勢(shì)，在IM中的表達(dá)明顯高于HM和NP組，特別是染色強(qiáng)度，這與既往的研究相一致［7］。區(qū)別于其他兩組，HIF-1α在IM中的陽(yáng)性細(xì)胞呈局灶性分布，這種高表達(dá)與灶性分布與其在其他惡性腫瘤中的研究一致。有學(xué)者認(rèn)為［8］，局灶性的缺氧及周圍壞死區(qū)的出現(xiàn)才是誘導(dǎo)細(xì)胞惡性表型的關(guān)鍵?？紤]到化療對(duì)于滋養(yǎng)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響，對(duì)IM組12例術(shù)前未接受化療和14例化療標(biāo)本進(jìn)行分析，HIF-1α的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．081），說(shuō)明化療對(duì)HIF-1α在IM中的表達(dá)無(wú)干擾。因此，我們認(rèn)為HIF-1α在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮作用。

既往研究表明，CAIX的表達(dá)主要位于壞死區(qū)域周圍的腫瘤組織中，呈局灶性，與缺氧分布一致［9-10］。在本研究中，CAIX在IM中表達(dá)水平明顯高于HM和NP組，特別是染色強(qiáng)度，這種腫瘤組織中的過(guò)表達(dá)與其他惡性腫瘤的研究相一致，提示CAIX在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。但是，CAIX在3組中的陽(yáng)性分布均呈彌散性，提示在GTD的發(fā)展中是否存在其他機(jī)制調(diào)控CAIX的表達(dá)。同樣的，我們分析了化療對(duì)于CAIX表達(dá)的影響，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝1．000）。

CAIX是HIF-1α的重要靶基因，其表達(dá)優(yōu)先受HIF-1α調(diào)控。研究表明，HIF-1α和CAIX的陽(yáng)性表達(dá)空間分布非常相似，且誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)可使CAIX表達(dá)增加［11］。本研究對(duì)HIF-1α和CAIX在侵襲性葡萄胎中的表達(dá)做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，二者在IM組均存在過(guò)度表達(dá)，但表達(dá)無(wú)相關(guān)性（P＞0．05）。且兩者在IM中的表達(dá)分布不一致，HIF-1α呈局灶性，而CAIX呈彌散性，由于妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)病機(jī)制不十分清楚，是否存在其他調(diào)控機(jī)制影響兩者的表達(dá)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，HIF-1α和CAIX在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)高于正常早孕絨毛和葡萄胎組織，提示兩者在GTD的發(fā)生發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮作用。隨著對(duì)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤缺氧微環(huán)境研究的深入，有望為其治療提供新的思路。

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