CHOP在間歇低氧大鼠認(rèn)知功能減退中的表達(dá)及意義

王紅陽，段麗君，趙雅寧，韓廣超，張 敏，王亞囡，王 玲，曹進麗

（河北聯(lián)合大學(xué)：1．附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科；2．康復(fù)醫(yī)學(xué)院社區(qū)護理學(xué)；3．呼吸病研究所，河北唐山 063000）

睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（sleep apnea-hypopnea syndrome，SAHS）是常見的一種呼吸系統(tǒng)疾病，其中以阻塞性（OSAHS）最多見。有文獻(xiàn)報道，OSAHS患者存在神經(jīng)心理的改變［1］。進一步的研究證實，OSAHS對大腦的精神運動功能、認(rèn)知領(lǐng)域有深刻的影響，并引起注意力、記憶力和執(zhí)行功能等方面的減退［2-3］。C／EBP同源蛋白（C／EBP homologous protein，CHOP）是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要分子之一。有實驗表明，CHOP參與了高血壓全腦缺血、局灶性腦缺血再灌注及帕金森等疾病的神經(jīng)元凋亡［4-6］，但關(guān)于CHOP在OSAHS導(dǎo)致的認(rèn)知功能減退中的意義鮮見相關(guān)報導(dǎo)。本研究通過建立慢性間歇低氧大鼠模型模擬睡眠呼吸暫停低通氣模式低氧的病理特點，結(jié)合行為學(xué)的變化觀察大鼠海馬神經(jīng)元CHOP、細(xì)胞凋亡的動態(tài)變化，探討CHOP與間歇性低氧大鼠認(rèn)知功能減退的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 主要材料 成年雄性 Wistar大鼠75只，體質(zhì)量（150±10）g，購于天津市山川紅實驗動物科技有限公司；CHOP兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；TUNEL試劑盒（Roche公司）；Morris水迷宮系統(tǒng)DMS-2型，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所HMIAS-2000。

1．2 動物分組與模型制備 用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組（NC組）、5%間歇低氧組（5%CIH組）、10%間歇低氧組（10%CIH組），各組又分為3、7、14、21、28d時間亞組，每個時間亞組各5只。參照相關(guān)文獻(xiàn)［7-8］，NC 組、10%CIH 組、5%CIH 組于每日8∶00～16∶00暴露8h。NC組：向低氧箱內(nèi)持續(xù)注入空氣120s，流速為10L／min，監(jiān)測氧濃度維持在21%；5%CIH組：向氧艙內(nèi)循環(huán)充入氮氣30s（流速為10L／min），其次輸入40s高流量壓縮空氣（流速為10L／min復(fù)氧時間），最后50s為低流量壓縮空氣（流速為5L／min常氧維持時間），每120s為1循環(huán)，使得艙內(nèi)濃度在5%～21%間循環(huán)；10%CIH組：向氧艙內(nèi)循環(huán)充入氮氣30s（流速為5L／min），其次輸入40s高流量壓縮空氣（流速為10L／min復(fù)氧時間），最后50s為低流量壓縮空氣（流速為5L／min常氧維持時間），維持氧濃度在21%，每2min為1循環(huán)，使得艙內(nèi)濃度在10%～21%間循環(huán)。用數(shù)字測氧儀監(jiān)測艙內(nèi)氧濃度變化，使艙內(nèi)氧濃度維持在各自的氧濃度內(nèi)，使其氧濃度波動范圍在±0．5%以內(nèi)。實驗結(jié)束后取出實驗動物，送入常規(guī)飼養(yǎng)箱內(nèi)自由飲水與攝食，生活環(huán)境及飼養(yǎng)條件相同。分別在實驗第3、7、14、21、28天結(jié)束后進行所設(shè)指標(biāo)檢測。

1．3 水迷宮測試大鼠學(xué)習(xí)記憶功能 采用Morris水迷宮進行檢測。每只動物晨起進行逃避潛伏期及穿越目標(biāo)象限訓(xùn)練5次后，分別在上午、下午各測試6次，分別記錄各組大鼠逃避潛伏期時間（s）及撤去平臺后動物穿越目標(biāo)象限的時間，取檢測記錄的總均值。

1．4 海馬CA1區(qū)CHOP的免疫組化檢測 常規(guī)麻醉動物，開胸、暴露心，40g／L多聚甲醛行心灌流，斷頭取腦，在視交叉后1mm和6mm處冠狀面切開，取中間塊入40g／L多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片（片厚5μm）。切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽高壓修復(fù)，滴加CHOP抗體（1∶200），濕盒中4℃過夜，IgG抗體-HRP多聚體（PV二步法），37℃溫箱40min，DAB顯色，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片，取各組各時間點10張標(biāo)本片在光學(xué)顯微鏡下以相同倍數(shù)（40×10）分別選取不同部位攝片，利用Motic醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對免疫組化分析模塊行單點分割法分析，取相同面積陽性目標(biāo)的積分吸光度值（IA）。

1．5 海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的測定及判定 采用DNA末端原位標(biāo)記法（TUNEL）檢測，切片常規(guī)脫蠟水化，30mL／L H2O2室溫處理10min后Proteinase K 37℃消化20min，TBS洗5min×3次，滴加TUNEL工作液20μL置于濕盒中，37℃標(biāo)記70min，TBS洗5min×3次，滴加POD-轉(zhuǎn)化液20μL，置于濕盒中，37℃孵育30min，TBS洗5min×3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染、酸化、水化，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察，每張切片在相同倍數(shù)（20×10）鏡下隨機選取10個高倍視野，分別計算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）＝凋亡細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，采用Pearson相關(guān)進行相關(guān)分析，雙側(cè)檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的比較 與NC組比較，5%、10%CIH組動物逃避潛伏期的時間均延長，跨越目標(biāo)象限的時間均縮短；與10%CIH組比較，5%CIH組的變化有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；模型組各時間亞組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義，且動物逃避潛伏期的時間隨觀察時間的延長而延長，跨越目標(biāo)象限的時間隨觀察時間的延長而縮短（P＜0．05，表1、表2）。

表1 各組大鼠逃避潛伏期時間的比較Tab．1 Comparison of the rats'escape latency time in each group（s，±s）

表1 各組大鼠逃避潛伏期時間的比較Tab．1 Comparison of the rats'escape latency time in each group（s，±s）

與NC組比較，▲P＜0．05；與10%CIH 組比較，▼P＜0．05；與3 d組比較，＊P＜0．05；與7 d組比較，＃P＜0．05；與14 d組比較，■P＜0．05；與21 d比較，●P＜0．05．

組別 NC組 10%CIH組 5%CIH組3 d 21．05±1．09 26．79±1．12▲ 28．97±1．59▲▼7 d 21．08±1．34 31．45±0．61▲＊ 38．45±1．12▲▼＊14 d 21．81±2．07 36．43±1．23▲＃ 45．70±1．22▲▼＃21 d 21．90±1．78 41．58±3．09▲■ 55．70±4．15▲▼■28 d 23．30±3．91 48．67±4．93▲● 69．28±3．61▲▼●

2．2 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞CHOP蛋白表達(dá)的變化 間歇性低氧／復(fù)氧損傷后，CHOP于各組、各時間段均有表達(dá)。光學(xué)顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞以胞質(zhì)表達(dá)為主，呈棕黃色或棕褐色。NC組有微量的表達(dá)，10%CIH組CHOP蛋白表達(dá)3d時少，于28d出現(xiàn)強表達(dá)；5%CIH組CHOP蛋白表達(dá)3d時少，于21d出現(xiàn)最強表達(dá)后下降（表3、圖1）。

表2 各組大鼠跨越目標(biāo)象限時間的比較Tab．2 Comparison of the rats'time spent crossing the target quadrant in each group（s，±s）

表2 各組大鼠跨越目標(biāo)象限時間的比較Tab．2 Comparison of the rats'time spent crossing the target quadrant in each group（s，±s）

與NC組比較，▲P＜0．05；與10%CIH 組比較，▼P＜0．05；與3 d組比較，＊P＜0．05；與7 d組比較，＃P＜0．05；與14 d組比較，■P＜0．05；與21 d比較，●P＜0．05．

組別 NC組 10%CIH組 5%CIH組3 d 54．44±2．57 50．90±1．86▲ 46．00±3．10▲▼7 d 54．43±3．50 47．96±0．90▲＊ 39．34±0．73▲▼＊14 d 51．19±5．67 42．55±2．24▲＃ 33．80±1．89▲▼＃21 d 49．64±4．35 36．23±3．17▲■ 28．32±1．83▲▼■28 d 50．24±3．83 29．80±1．83▲● 23．74±1．99▲▼●

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)CHOP蛋白的表達(dá)Tab．3 The expression of CHOP protein in the rats'hippocampal CA1area in each group（±s）

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)CHOP蛋白的表達(dá)Tab．3 The expression of CHOP protein in the rats'hippocampal CA1area in each group（±s）

與NC組比較，▲P＜0．05；與3 d組比較，＊P＜0．05；與7 d組比較，＃P＜0．05；與14 d組比較，■P＜0．05；與21 d比較，●P＜0．05。

組別 NC組 10%CIH組 5%CIH組3 d 6．14±0．82 9．64±4．87▲ 14．54±8．27▲7 d 6．24±0．66 34．67±21．44▲＊ 41．81±13．34▲＊14 d 6．31±0．67 46．14±15．05▲＃ 50．11±14．07▲＃21 d 6．17±0．61 60．28±10．15▲■ 90．70±33．04▲■28 d 6．20±0．69 78．61±19．21▲● 62．62±8．52▲

圖1 不同程度間歇低氧后CHOP在海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)中的表達(dá)變化Fig．1 Changes of CHOP expression in the rats'hippocampal CA1neurons after different degree of intermittent hypoxia（SP，×400）

2．3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化間歇性低氧／復(fù)氧損傷后，各時間段均出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)生凋亡的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，大小不一致，呈圓形或橢圓形，胞核呈棕黃色或棕褐色，而非凋亡細(xì)胞胞核被蘇木素復(fù)染呈藍(lán)色，核相對較大，形態(tài)大小較為一致。與NC組比較，5%、10%CIH組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡均增多，與10%CIH組比較，5%CIH組變化有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；3d時細(xì)胞凋亡不明顯且3組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；模型組各時間亞組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），且隨著低氧時間的延長，凋亡指數(shù)逐漸升高，凋亡均逐漸加重（表4，圖2）。

2．4 CHOP表達(dá)與細(xì)胞凋亡、動物學(xué)習(xí)記憶功能的相關(guān)分析 雙變量相關(guān)分析顯示，兩個間歇低氧組其CHOP蛋白表達(dá)與凋亡指數(shù)、動物逃避潛伏期均呈正相關(guān)，與跨越目標(biāo)象限時間均呈負(fù)相關(guān)（表5）。

表4 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)的比較Tab．4 Comparison of neuronal apoptosis index in the rats'hippocampal CA1area in each group（±s）

表4 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)的比較Tab．4 Comparison of neuronal apoptosis index in the rats'hippocampal CA1area in each group（±s）

與NC組比較，▲P＜0．05；與10%CIH 組比較，▼P＜0．05；與3 d組比較，＊P＜0．05；與7 d組比較，＃P＜0．05；與14 d組比較，■P＜0．05；與21 d比較，●P＜0．05。

組別 NC組 10%CIH組 5%CIH組3 d 0．042±0．016 0．046±0．011 0．050±0．019 7 d 0．074±0．023 0．160±0．020▲＊ 0．248±0．029▲▼＊14 d 0．073±0．024 0．271±0．055▲＃ 0．390±0．052▲▼＃21 d 0．077±0．020 0．445±0．047▲■ 0．506±0．046▲▼■28 d 0．073±0．021 0．503±0．045▲● 0．580±0．053▲▼●

圖2 不同程度間歇低氧后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況Fig．2 Different degree of intermittent hypoxia neuron apoptosis in hippocampal CA1area（TUNEL，×200）

表5 間歇低氧組CHOP表達(dá)與細(xì)胞凋亡、動物學(xué)習(xí)記憶功能的相關(guān)分析Tab．5 Correlation of the expression of CHOP with cell apoptosis and learning and memory function detection in CIH groups

3 討 論

認(rèn)知功能減退的病理基礎(chǔ)是各種理化、生物、社會心理等因素引起的學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)：前額葉、邊緣系統(tǒng)、海馬等神經(jīng)元、突觸數(shù)目減少，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)合成下降、突觸間信息傳遞障礙。張存雪等［9］研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致間歇低氧幼鼠認(rèn)知功能障礙的主要機制，而李琳等［10］在成年大鼠的研究亦證實間歇性低氧伴有認(rèn)知功能減退，并推測與缺氧后海馬神經(jīng)元及突觸丟失等有關(guān)。本實驗中Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶結(jié)果顯示，在不同程度間歇低氧組中隨著時間的延長，大鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能嚴(yán)重受損，以5%CIH組為著，與既往研究結(jié)果一致。

研究表明，缺氧、氧化應(yīng)激等刺激可誘導(dǎo)CHOP高表達(dá)，并激活其介導(dǎo)的上調(diào)BAX、下調(diào)Bcl-2，GADD43，活化 Caspases等細(xì)胞凋亡途徑［11-12］。認(rèn)知功能的減退與相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)元丟失密切相關(guān)，有關(guān)的實驗性研究已證實［13-15］，高血糖、腦缺血或缺血／再灌注及急性低壓低氧等損傷可引起海馬神經(jīng)元數(shù)量減少、形態(tài)異常或生化改變，進而導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙。在HIV-1相關(guān)認(rèn)知障礙研究中發(fā)現(xiàn)，CHOP同源蛋白之一C／EBPβmRNA及其蛋白質(zhì)異形體在腦內(nèi)表達(dá)增加，可刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌TIMP-1，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和細(xì)胞生長／凋亡［16］。GORDON等［17］研究表明，糖原合酶-3（glycogen synthase kinse-3）抑制劑能顯著的降低CHOP的表達(dá)，進而改變應(yīng)激后神經(jīng)元凋亡的命運［17］。在實驗中，我們同時觀察到隨著間歇低氧時間的延長模型組海馬神經(jīng)元中CHOP蛋白表達(dá)逐漸升高，神經(jīng)元的凋亡也逐漸增多，認(rèn)知功能減退也逐漸加重，同時5%CIH組晚期CHOP表達(dá)下降可能與其神經(jīng)元大量凋亡有關(guān)。由此我們推測：在間歇低氧損傷的初期，CHOP表達(dá)弱，海馬神經(jīng)元凋亡并不顯著，認(rèn)知功能減退也較輕，隨著低氧損傷的持續(xù)存在，CHOP的表達(dá)增強，并激活了其介導(dǎo)的各種凋亡通路，導(dǎo)致神經(jīng)元大量凋亡、神經(jīng)元丟失過多，認(rèn)知功能減退也隨之加重。CHOU等［18］的研究亦認(rèn)為減少內(nèi)源性CHOP的表達(dá)可以對OSA的神經(jīng)元起到保護作用。同時本實驗中的相關(guān)研究結(jié)果還顯示，CHOP表達(dá)趨勢與細(xì)胞凋亡、動物逃避潛伏期時間呈明顯正相關(guān)（P＜0．01），與動物穿越目標(biāo)象限時間呈明顯負(fù)相關(guān)（P＜0．01），更進一步說明了CHOP與間歇低氧所致認(rèn)知功能減退存在著緊密的聯(lián)系。

綜上所述，本研究表明間歇性低氧復(fù)氧后CHOP表達(dá)水平上調(diào)，其介導(dǎo)的凋亡途徑可能是導(dǎo)致低氧損傷后認(rèn)知功能減退的重要機制之一。這可能對OSAHS患者認(rèn)知功能障礙的治療具有潛在的意義。

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