ChABC、GDNF、Nogo-A抗體聯(lián)合應(yīng)用促損傷脊髓再生修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究

丁永利，姜 勇，宋躍明，陳 星

（1．河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨傷科，河南鄭州 450000；2．四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科，四川成都 610041）

由于成年哺乳動(dòng)物脊髓的神經(jīng)細(xì)胞已經(jīng)高度分化，失去有絲分裂的能力，因此脊髓損傷后的再生修復(fù)一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題之一［1］。近年的研究表明，脊髓損傷后修復(fù)能力有限與膠質(zhì)瘢痕的空間阻礙、促神經(jīng)生長(zhǎng)因子的缺乏以及神經(jīng)抑制因子的存在有關(guān)［3］。軟骨素酶ABC（ChABC）能分解受傷區(qū)的硫酸軟骨素黏多糖（CS-GAG），清除瘢痕［3］；膠質(zhì)細(xì)胞原性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）是近年發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的新型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子［4］。本實(shí)驗(yàn)利用成年SD大鼠脊髓全橫斷損傷模型，ChABC、GDNF、抗Nogo-A抗體通過(guò)蛛網(wǎng)膜下腔置管灌注，局部單用和聯(lián)合應(yīng)用治療脊髓損傷，采用BDA示蹤及 NF-200、GAP-43、GFAP免疫組化等指標(biāo)評(píng)價(jià)藥物治療的長(zhǎng)期作用，探索損傷脊髓再生新的有效治療方法。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性Sprague-Dawley（SD）成年大鼠，體質(zhì)量200～250g，2～3月齡，由四川大學(xué)華西動(dòng)物中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室為SPF級(jí)華西臨床前藥理實(shí)驗(yàn)室，室溫18～22℃，濕度50%～65%。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前1周購(gòu)進(jìn)大鼠以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。

1．2 主要試劑及儀器 GDNF及ChABC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗Nogo-A抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA公司；BDA購(gòu)自美國(guó)Molecular Probes公司；誘發(fā)電位儀及BL-420E＋生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，PE-10導(dǎo)管購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1．3 方法

1．3．1 脊髓全橫斷損傷模型的建立 健康雌性SD大鼠，50g／L水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉（0．6mL／100g），以T7～8棘突中心做背部正中切口，顯露T7～11椎板，暴露待損傷脊髓，約長(zhǎng)4～5mm。將5．5cm長(zhǎng)PE-10導(dǎo)管經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔向頭端置入約1cm，將脊髓完全橫斷，逐層關(guān)閉切口。術(shù)后每日腹腔注射頭孢塞肟鈉1mL，每日2次（2．0g／100mL生理鹽水），并每日用艾立克行會(huì)陰部消毒，以防止傷口和泌尿系感染。并按摩膀胱排尿，每日2次，至其排尿反射恢復(fù)。2～3d換墊料1次，保持墊料干燥清潔。

1．3．2 實(shí)驗(yàn)分組 將成功造模的大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只：?jiǎn)渭儥M斷組、ChABC組（A組）、GDNF組（G組）、Nogo-A 抗體組（N 組）、ChABC＋GDNF＋Nogo-A抗體組（A＋G＋N組）），另取12只分為2組作為正常對(duì)照組和假手術(shù)組，后者只咬除椎板，暴露脊髓后蛛網(wǎng)膜下腔置管，然后逐層縫合切口。

正常對(duì)照組：放入籠中正常飼養(yǎng)觀察。單純橫斷組：每日經(jīng)放置的PE10導(dǎo)管灌注15μL生理鹽水，每日1次，共10次。A組：ChABC 6μL／次，隔日1次，共5次；G組：GDNF 4μL／次，每日1次，共10次；N組：Nogo-A抗體（200μg／mL）25μL／次，每日1次，共10次；A＋G＋N組：ChABC 6μL／次，隔日1次，共5次，GDNF：4μL／次，每日1次，共10次，Nogo-A抗體25μL／次，共10次。所有給藥均經(jīng)放置的PE10導(dǎo)管緩慢灌注，處理完畢后，局部消毒拔除導(dǎo)管，合籠飼養(yǎng)。

1．3．3 術(shù)后脊髓標(biāo)本的收集 于24周將各組動(dòng)物用50g／L水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉（0．6mL／100g），動(dòng)物進(jìn)人麻醉狀態(tài)后，采用37℃肝素生理鹽水（1支肝素／500mL生理鹽水）及灌注液（4℃）灌注后，剪開(kāi)大鼠背部皮膚，取出脊柱頸胸段，游離脊髓，放人灌注液中后固定，4℃過(guò)夜；取出脊髓置于含300g／L蔗糖的灌注液中至組織沉底；然后進(jìn)行冰凍切片。

1．3．4 生物素葡聚糖胺（BDA）順行示蹤標(biāo)記技術(shù) 取材前2周，將33．3mmol／L BDA溶液緩慢注入大腦兩側(cè)的后肢感覺(jué)運(yùn)動(dòng)區(qū)皮質(zhì)內(nèi)。2周后行心臟灌注后，取出大腦和脊髓組織，置于40g／L多聚甲醛溶液中4℃后固定過(guò)夜，組織沉底后行冰凍縱切片。行BDA染色后脫水及蓋玻片覆蓋。

1．3．5 免疫組化染色 脊髓損傷后24周，取出脊髓，脊髓損傷段行連續(xù)冰凍縱切片，片厚20μm，采用SABC法分別行NF200、GFAP、GAP-43免疫組化染色，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片。Olympus顯微鏡觀察并攝片，Image Process圖像分析軟件進(jìn)行處理。

1．3．6 體感誘發(fā)電位檢查（SEP） 各組大鼠于術(shù)后24周時(shí)取3只行SEP檢查。將大鼠用50g／L水合氯醛（劑量同前）腹腔注射麻醉后，暴露硬腦膜及雙側(cè)坐骨神經(jīng)，固定保護(hù)電極于坐骨神經(jīng)上。將引導(dǎo)電極（銀球電極）置于前囟矢狀縫旁2mm，冠狀縫后3mm，用電極操縱器在該范圍內(nèi)移動(dòng)引導(dǎo)電極，尋找能導(dǎo)出最大幅度誘發(fā)電位的中心點(diǎn)。參考電極夾在頭皮切口邊緣上，地線與動(dòng)物后肢皮膚相連，使動(dòng)物接地。記錄電極與前置放大器相連；放大后的電信號(hào)經(jīng)BL-420E＋生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，顯示并記錄于計(jì)算機(jī)上。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較在滿足正態(tài)性和方差齊性的條件下，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；若不滿足方差齊性，則采用Games-Howell檢驗(yàn)，P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 一般情況觀察 術(shù)后1周內(nèi)死亡6只，解剖發(fā)現(xiàn)腹脹明顯；術(shù)后大鼠均不同程度出現(xiàn)腹脹、便秘和尿潴留，經(jīng)注射抗生素、會(huì)陰部消毒等，癥狀消失。術(shù)后1周，3只發(fā)生自殘、自噬腹部或后肢，均死亡。另有2只于術(shù)后2周、4周自殘后肢死亡。共死亡15只，死亡鼠均予以補(bǔ)充。術(shù)后經(jīng)積極護(hù)理，如人工排便、預(yù)防感染、勤換墊料、加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)等，3～4周左右大部分大鼠恢復(fù)反射性排尿，腹脹減輕或消失。

2．2 BDA示蹤染色 正常對(duì)照組：脊髓光鏡下見(jiàn)縱形規(guī)則排列的纖維束，纖維束間無(wú)空泡，細(xì)胞核清晰，胞體無(wú)空泡樣改變。單純橫斷組：藍(lán)染的纖維在脊髓近段呈縱形規(guī)則排列，愈靠近斷端纖維排列愈紊亂；斷端的纖維呈橫行排列，損傷區(qū)及遠(yuǎn)側(cè)段未見(jiàn)藍(lán)染纖維。A組、G組、N組：損傷區(qū)近側(cè)端藍(lán)色的示蹤顆粒較多，損傷區(qū)很少有藍(lán)色的再生神經(jīng)纖維，損傷區(qū)遠(yuǎn)側(cè)無(wú)藍(lán)染的神經(jīng)纖維。AGN組：藍(lán)色的神經(jīng)纖維通過(guò)損傷區(qū)并出現(xiàn)在損傷區(qū)的遠(yuǎn)側(cè)段，損傷區(qū)中央為空泡樣變，周?chē)梢?jiàn)藍(lán)染的纖維，損傷區(qū)遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)散在的藍(lán)染纖維（圖1）。

圖1 各組大鼠脊髓組織的BDA示蹤染色Fig．1 BDA tracer staining of spinal cord in each group

2．3 NF-200免疫組化染色 NF-200免疫組化染色可見(jiàn)，損傷區(qū)以及其遠(yuǎn)近端強(qiáng)弱不等的NF-200陽(yáng)性表達(dá)，鄰近神經(jīng)元胞體NF-200著色較深。分析各組陽(yáng)性染色面積，A組、AGN治療組NF陽(yáng)性染色強(qiáng)于正常對(duì)照組及單純橫斷組（P＜0．05）；G、N治療組與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；AGN組較G組、N組顯著增強(qiáng)（P＜0．05），與A組未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（LSD法，P＞0．05，表1、圖2）。

2．4 GAP-43免疫組化染色 GAP-43的著色部位主要在神經(jīng)元胞質(zhì)和突起，呈黃色細(xì)顆粒狀，胞核區(qū)不著色。分析各組陽(yáng)性染色面積，A組、AGN治療組GAP-43陽(yáng)性染色強(qiáng)于正常對(duì)照組及單純橫斷組（P＜0．05），G組、N組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。AGN組較A、G、N組顯著增強(qiáng)（Games-Howell法，P＜0．05，表1、圖3）。

圖2 各組大鼠脊髓組織的NF200免疫組化染色Fig．2 IHC staining of NF200in spinal cord of each group

圖3 各組GAP-43免疫組化染色Fig．3 IHC staining of GAP-43in spinal cord of each group

2．5 GFAP免疫組化染色 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，有明顯的多級(jí)突起。分析各組陽(yáng)性染色面積，正常對(duì)照組及單純橫斷組GFAP陽(yáng)性染色強(qiáng)于各治療組（P＜0．05），A組、G組、N組與AGN組比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Games-Howell法，P＞0．05，表1、圖4）。

2．6 體感誘發(fā)電位檢查（SEP）分析 術(shù)后24周，僅正常對(duì)照，AGN組可記錄到SEP，其余各組信號(hào)均消失，無(wú)SEP波形。正常對(duì)照組SEP潛伏期為8～12ms，AGN組SEP潛伏期為29ms（圖5）。

表1 24周各組大鼠脊髓損傷區(qū)免疫組化陽(yáng)性面積結(jié)果Tab．1 Positive area of IHC after spinal cord injury in each group at 24weeks

圖4 各組GFAP免疫組化染色Fig．4 IHC staining of GFAP in spinal cord of each group

圖5 各組大鼠的SEP波形圖Fig．5 SEP wave in each group

3 討 論

脊髓損傷是脊柱外科的常見(jiàn)病之一。脊髓橫斷損傷模型能更好地研究脊髓損傷后軸突的再生情況，可確保橫斷的完全性，對(duì)正確評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)性治療措施對(duì)促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)的作用有重要意義［5］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生困難的原因包括中樞神經(jīng)損傷后神經(jīng)元極易死亡，損傷導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞周?chē)奈h(huán)境破壞，營(yíng)養(yǎng)因子匱乏，多種抑制因子導(dǎo)致神經(jīng)元再生困難［6］。目前的觀點(diǎn)傾向于通過(guò)尋找合理的聯(lián)合治療方案來(lái)克服神經(jīng)再生的多重障礙。

神經(jīng)元胞體是神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的代謝中心，神經(jīng)損傷后得以成功修復(fù)的前提是防止軸突損傷反應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡，維持神經(jīng)元胞體形態(tài)和功能的完整［7］。另外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生修復(fù)涉及神經(jīng)元胞體的存活、再生能力的增強(qiáng)，增加微環(huán)境中的有利因素，中和抑制性因子等多方面，是受多種因素共同作用的結(jié)果。NF是細(xì)胞骨架中間絲的一種，在結(jié)構(gòu)和功能上與微管密不可分，損傷脊髓軸突再生或神經(jīng)細(xì)胞功能改善時(shí)［8］，NF陽(yáng)性表達(dá)較強(qiáng)，提示再生的神經(jīng)纖維多。GAP-43的表達(dá)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的反應(yīng)性突觸再生有關(guān)，在軸突再生、突觸塑性和神經(jīng)傳導(dǎo)中具有重要作用［9］，其表達(dá)強(qiáng)表明該物質(zhì)生成增多，與再生修復(fù)的活躍程度有關(guān)。GFAP是觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)的重要指標(biāo)［10］，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)再生的負(fù)面效應(yīng)占優(yōu)勢(shì)地位。本研究采用ChABC、GDNF、抗Nogo-A抗體聯(lián)合應(yīng)用，可見(jiàn)NF、GAP-43表達(dá)增強(qiáng)，GFAP表達(dá)下降。目前認(rèn)為硫酸軟骨酶素ChABC是通過(guò)去除硫酸軟骨素的GAG鏈而實(shí)現(xiàn)中和CSPGs的軸突生長(zhǎng)抑制作用的［11］。ChABC可降解CSPGs，使損傷神經(jīng)元內(nèi)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)上、下行神經(jīng)纖維束再生，運(yùn)動(dòng)功能和本體感覺(jué)恢復(fù)。GDNF是近年發(fā)現(xiàn)的一種屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員的新型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子［12］，作用具有廣譜性，是目前發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子。有研究表明，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在髓磷脂降解前能促進(jìn)軸突生長(zhǎng)并通過(guò)灰質(zhì)，而且還能誘導(dǎo)各種生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)［13］。所以，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子除了對(duì)損傷神經(jīng)元有保護(hù)作用外，還可以與其他中和軸突生長(zhǎng)抑制因子的方法聯(lián)合使用以促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。GDNF可阻斷損傷軸突的中型感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞的病理?yè)p害過(guò)程，提高背根節(jié)細(xì)胞的神經(jīng)傳導(dǎo)速度［14］；還能恢復(fù)大鼠對(duì)傷害性熱覺(jué)及壓覺(jué)的敏感性。GDNF能對(duì)抗6-羥多巴胺的細(xì)胞毒性，使損傷的多巴胺能神經(jīng)元的死亡率顯著下降。局部應(yīng)用GDNF可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于自由基等損傷，并能完全阻止缺血后NO的產(chǎn)生以及再灌注造成的損傷，這表明GDNF是有效對(duì)抗缺血性損害的保護(hù)因子。因此，可以看出，①GDNF促軸突再生的能力較其他兩個(gè)因子弱；②24周時(shí)神經(jīng)細(xì)胞的再生功能趨于靜止，故局部維持有效的營(yíng)養(yǎng)因子濃度可能會(huì)更有利于損傷軸突的再生；③應(yīng)用外源性GDNF能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能。

Nogo-A抗原是已經(jīng)證實(shí)的髓磷脂中3種生長(zhǎng)抑制蛋白之一，存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞和別的一些神經(jīng)細(xì)胞中，是一種跨膜蛋白［15］，目前為止發(fā)現(xiàn)其有兩個(gè)抑制性區(qū)域，可以誘導(dǎo)生長(zhǎng)錐潰變和抑制軸突生長(zhǎng)。脊髓損傷后用單克隆抗體IN-1中和Nogo-A，可促進(jìn)長(zhǎng)纖維傳導(dǎo)束的長(zhǎng)距離的軸突再生。有研究發(fā)現(xiàn)，CNS損傷后Nogo表達(dá)不上調(diào)，由此推斷這種抑制作用是生長(zhǎng)的軸突直接與完整或斷裂的髓磷脂接觸的結(jié)果［16］。Nogo-A抗體是通過(guò)與抗原結(jié)合封閉抗原而起到中和抑制作用的，它和ChABC的作用機(jī)制不同，后者通過(guò)去除硫酸軟骨素的GAG鏈而中和抑制作用的，這種改變不是一過(guò)性的。

綜上所述，涉及神經(jīng)元胞體的存活、再生能力的增強(qiáng)，增加微環(huán)境中的有利因素，中和抑制性因子等多方面的聯(lián)合治療方案，有助于加深對(duì)脊髓再生復(fù)雜性及綜合干預(yù)策略的理解，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生修復(fù)治療方案的探索初步奠定了基礎(chǔ)。

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