大鼠彌漫性軸索損傷后高遷移率族蛋白1的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

龐宏剛，宋錦寧，李丹東，孫 鵬，趙永林，黃廷欽，翟海程，安吉洋

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061）

彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）是腦外傷患者重要的死亡原因，但是其具體機(jī)制仍不清楚。近來(lái)研究證實(shí)，在DAI后軸索損傷部位存在明顯的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，IL-1、IL-6和TNF-a等炎癥因子表達(dá)顯著升高［1-2］，證明炎癥反應(yīng)在DAI后腦損傷中起著重要作用。探索DAI后炎癥誘導(dǎo)機(jī)制是目前DAI研究亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1，HMGB-1）是病理情況下誘導(dǎo)多種炎癥因子表達(dá)的上游激活分子。在動(dòng)物研究中已證實(shí)腦缺血或蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦組織中HMGB-1的水平明顯升高，并且抑制HMGB-1可以顯著減輕缺血后炎癥反應(yīng)，改善預(yù)后［3-5］。腦外傷的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)，患者外周血清中HMGB-1的水平明顯升高，并且與預(yù)后明顯相關(guān)［6］。上述研究結(jié)論均證實(shí)，作為重要的炎性分子，HMGB-1可能是DAI后導(dǎo)致腦組織炎性損傷的重要潛在機(jī)制。但是，DAI后腦組織中HMGB-1的表達(dá)水平及分布的動(dòng)態(tài)變化目前還不清楚，也未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究采用瞬時(shí)機(jī)械旋轉(zhuǎn)制作大鼠DAI模型，通過(guò)免疫組化、Western blot、RT-PCR等方法全面測(cè)定DAI后腦組織中HMGB-1的表達(dá)，并采用TUNEL觀(guān)察DAI后細(xì)胞凋亡水平，探討HMGB-1在DAI后腦組織損傷中的作用機(jī)制，為臨床治療DAI提供靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 雄性健康成年Sprague-Dawley大鼠84只，體質(zhì)量280～300g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK（陜）2007-001）。采用隨機(jī)數(shù)表法將實(shí)驗(yàn)大鼠隨即分為正常組（12只）和DAI組6h、1、3、7d組各18只，共84只。兔抗HMGB-1抗體（美國(guó)Epitomics公司）和小鼠抗β-actin（美國(guó)Santa Cruz公司），TUNEL凋亡試劑盒（美國(guó)Promega公司），過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（SP）染色試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒（北京中杉金橋生物公司），光鏡（CX21，日本Olympus公司），圖像采集及分析系統(tǒng)（Leica-Q550CW，德國(guó)）。

1．2 大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)損傷模型 大鼠DAI模型的制作采用劉曉斌等［7］的方法：DAI組大鼠首先使用100g／L水合氯醛（3mL／kg）腹腔注射麻醉，然后將其置于高約20cm的硬質(zhì)平臺(tái)上，將大鼠門(mén)齒固定于門(mén)齒孔，其次將耳棒插入雙側(cè)耳道并適度旋緊，將大鼠頭部水平固定于造模儀橫向桿上，軀干與平臺(tái)呈25～30°。限位孔設(shè)置于90°（即造模時(shí)旋轉(zhuǎn)90°），拔除卡位條，限位盤(pán)迅速旋轉(zhuǎn)復(fù)位并與限位銷(xiāo)發(fā)生劇烈撞擊產(chǎn)生瞬時(shí)停止，以此來(lái)模仿DAI發(fā)病過(guò)程中的剪切力作用。上述固定-卡位-打擊-復(fù)位為1個(gè)致傷周期，重復(fù)8次。

1．3 常規(guī)組織病理學(xué)檢測(cè)與免疫組化檢測(cè) 正常組及DAI組大鼠分別于術(shù)后6h、1、3、7d經(jīng)生理鹽水左心室灌注取腦，40g／L多聚甲醛固定24h，石蠟包埋并自后向前連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，裱于載玻片，用于HE、Glees-Marsland鍍銀染色、Mallory磷鎢酸蘇木素染色及免疫組化染色。免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶鏈接法。首先將切片脫蠟水化，30mL／L過(guò)氧化氫去離子水室溫孵育30min，通過(guò)微波加熱抗原修復(fù)，血清封閉后，加抗HMGB-1單克隆抗體（1∶200），4℃恒溫過(guò)夜。生物素化二抗37℃孵育30min，HRP標(biāo)記鏈霉卵白素37℃孵育30min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水并中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀(guān)察皮層腦組織HMGB-1的表達(dá)及分布，Leica-Q550CW圖像分析系統(tǒng)采集圖像。

1．4 RT-PCR檢測(cè)HMGB-1mRNA的表達(dá) 各組大鼠于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)灌注取腦，分離皮層組織。采用RNAiso Plus提取總 RNA，提取總 RNA 500ng，合成cDNA，應(yīng)用Premix Taq酶以cDNA為模板加入HMGB-1及GAPDH引物（HMGB-1及GAPDH引物序列：HMGB-1上游ATGGGCAAAGGAGATCCTA，下游 ATTCATCATCATCATCATCTTCT；GAPDH 上游 TGGTGGACCTCATGGCCTAC，下游CAGCAACTGAGGGCCTCTCT），通過(guò)如下反應(yīng)條件：94℃5min，94℃50s，56℃ 60s，72℃60s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。瓊脂糖凝膠電泳確定反應(yīng)產(chǎn)物，溴化乙錠顯色，運(yùn)用Gel Pro 3．1分析軟件計(jì)算HMGB-1與內(nèi)參GAPDH的吸光度比值，以此表示各組HMGB-1的mRNA水平。

1．5 Western blotting檢測(cè)HMGB-1的表達(dá) 各組大鼠于造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)灌注取腦，提取皮層腦組織蛋白，BCA法蛋白定量。取50μg蛋白樣品，SDSPAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，隨后將膜置于50g／L脫脂牛奶中37℃封閉2h，一抗（HMGB-1，1∶3 000；β-actin，1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗膜3次，將膜與HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1h，TBST洗膜3次后，化學(xué)發(fā)光法顯影，并采用Quantity One軟件測(cè)定條帶吸光度并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1．6 TUNEL檢測(cè)皮層神經(jīng)元凋亡 各組大鼠在造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)灌注取腦，40g／L多聚甲醛溶液中固定24h，石蠟包埋后連續(xù)冠狀切片，片厚5μm。按照TUNEL凋亡試劑盒提供步驟進(jìn)行TUNEL染色。圖像分析系統(tǒng)采集圖像，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，各時(shí)間點(diǎn)上實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比較，在滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性的條件下，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若不滿(mǎn)足條件，則采用秩和檢驗(yàn)，P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 DAI后腦組織的病理學(xué)改變 HE染色顯示，正常腦組織皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整，呈球形或錐形，核大而圓，核異染質(zhì)少，著色淺（圖1A）；DAI后皮層腦組織間質(zhì)明顯水腫，神經(jīng)元呈明顯收縮變形，胞核固縮，胞質(zhì)深染，呈明顯嗜酸性（圖1B）。Glees-Marsland鍍銀染色可見(jiàn)，正常神經(jīng)軸突走形平滑，未見(jiàn)明顯迂曲及軸索球（圖1C）；DAI后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)軸索斷裂及軸索球形成（圖1D）。Mallory磷鎢酸蘇木素染色可見(jiàn)，正常軸突走形均勻平滑（圖1E）；DAI后出現(xiàn)明顯軸突腫脹，走形迂曲，并伴有斷裂（圖1F）。

圖1 大鼠DAI后腦組織的病理學(xué)改變Fig．1 Microscopic observation of the cross-sections of the brain of rats subjected to DAI（×400）

2．2 DAI后大鼠腦組織中HMGB-1的表達(dá)及分布

2．2．1 免疫組化染色觀(guān)察 HMGB-1陽(yáng)性染色呈棕黃色，在正常大鼠腦皮層組織中HMGB-1有少量表達(dá)，主要分布于細(xì)胞核，胞質(zhì)及間質(zhì)均未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)（圖2A）。DAI后6h及1d組，HMGB-1陽(yáng)性細(xì)胞減少（圖2B、2C），DAI后3d及7d組，HMGB-1陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多（圖2D、2E）。

圖2 HMGB-1在DAI大鼠腦組織中的表達(dá)Fig．2 Immunohistochemical observation of HMGB-1on the cross-sections of the cortex following DAI（×200）

2．2．2 Western blot定量分析結(jié)果 DAI后大鼠皮層HMGB-1水平在6h、1d時(shí)間點(diǎn)呈顯著降低，在DAI后3d時(shí)間點(diǎn)HMGB-1水平達(dá)到峰值，并持續(xù)至DAI后7d，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示DAI各亞組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖3）。

圖3 DAI后大鼠皮層HMGB-1水平的時(shí)相性改變Fig．3 The dynamic expression of HMGB-1in the cortex of rats subjected to DAI

2．2．3 DAI后腦組織HMGB-1mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)改變 DAI后HMGB-1mRNA表達(dá)于造模后6h開(kāi)始較對(duì)照組升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；DAI后1d開(kāi)始HMGB-1mRNA水平較對(duì)照組明顯升高，并于DAI后3、7d呈顯著的持續(xù)升高。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，DAI后1、3、7d腦組織HMGB-1mRNA水平與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖4）。

2．3 DAI對(duì)腦組織細(xì)胞凋亡的影響 正常情況下，腦組織中僅有很少TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（圖5A）。DAI后6h，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加（圖5B），并持續(xù)增加，至3d時(shí)達(dá)到最多（圖5D），一直持續(xù)至DAI后7d（圖5E）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析DAI后各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）（圖6），并且進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示細(xì)胞凋亡數(shù)量與HMGB-1的表達(dá)水平并無(wú)明顯相關(guān)性。

圖4 DAI后HMGB-1mRNA的時(shí)相性表達(dá)Fig．4 The time course of HMGB-1mRNA expression in the cortex after DAI

3 討 論

本研究采用大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置制作大鼠DAI模型，該模型制作方法的穩(wěn)定性已被大量研究證實(shí)［8］。在實(shí)驗(yàn)中我們采用了HE、Glees-Marsland鍍銀染色、Mallory磷鎢酸蘇木素染色3種組織病理學(xué)染色對(duì)該模型進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示造模后腦組織出現(xiàn)典型的軸索損傷斷裂及軸索球的形成，均證實(shí)模型的可靠性與穩(wěn)定性。

圖5 TUNEL染色觀(guān)察DAI后腦組織中的細(xì)胞凋亡情況Fig．5 TUNEL staining of the cortex in DAI groups（×400）

圖6 DAI模型組與對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較Fig．6 Cell count of TUNEL-positive cells in DAI and control groups

HMGB-1是一種DNA結(jié)合蛋白，在腦組織中HMGB-1主要存在于神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞胞核。既往研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后HMGB-1可被壞死的神經(jīng)元或激活的膠質(zhì)細(xì)胞釋放至細(xì)胞外間隙，與細(xì)胞表面炎性受體 RAGE（receptor for advanced glycation end products）及 TLR2／4（Toll-like receptor2／4）受體結(jié)合［9-10］，激活下游炎性反應(yīng)信號(hào)通路［11］，從而誘導(dǎo)多種炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β等）的表達(dá)［12-13］。本實(shí)驗(yàn)免疫組化觀(guān)察結(jié)果顯示，HMGB-1在正常腦組織中主要存在于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)及組織間質(zhì)中幾乎無(wú)表達(dá)；DAI后6h，皮層腦組織中的HMGB-1陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，可能為HMGB-1細(xì)胞外間隙釋放所致，但是隨后呈現(xiàn)了逐漸增加的趨勢(shì)，直到造模后7d，仍然處于較高水平。而采用Western blot對(duì)DAI后皮層腦組織中HMGB-1水平進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，DAI后6h及1d，皮層腦組織中HMGB-1水平呈顯著降低，直到3d時(shí)間點(diǎn)才開(kāi)始顯著升高，一直持續(xù)到DAI后7d。分析其原因，首先可能是由于DAI后細(xì)胞壞死釋放HMGB-1至細(xì)胞外發(fā)揮作用，導(dǎo)致腦組織中原有的HMGB-1水平降低，而HMGB-1的表達(dá)此時(shí)并未升高，因此呈現(xiàn)HMGB-1陽(yáng)性細(xì)胞的減少；其次可能是HMGB-1在早期就轉(zhuǎn)錄激活并表達(dá)升高，而升高的HMGB-1可能與相應(yīng)的受體結(jié)合發(fā)揮其作用，從而導(dǎo)致無(wú)法測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用RTPCR對(duì)HMGB-1mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DAI后早期（6h）HMGB-1mRNA表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯增加，1d時(shí)間點(diǎn)增加幅度雖較對(duì)照有顯著差異，但是仍處于較低水平，直到DAI后3d，HMGB-1mRNA的表達(dá)才開(kāi)始大幅度顯著升高，一直持續(xù)至DAI后7d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了DAI后HMGB-1水平的這種先降低，后期才開(kāi)始逐漸升高的動(dòng)態(tài)變化與其mRNA轉(zhuǎn)錄激活較晚有關(guān)。這也恰好解釋了DAI后早期HMGB-1水平僅輕度升高，而到了3d后開(kāi)始大幅度升高。

近來(lái)的研究已經(jīng)證實(shí)多種炎癥因子在DAI后表達(dá)增加［2］。但是既往研究證實(shí)TNF-α等屬于早期炎癥因子［14］，抑制 TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子并不能顯著改善腦外傷患者的預(yù)后。在本實(shí)驗(yàn)中，DAI后早期釋放至細(xì)胞外間隙的僅是細(xì)胞核原有的少量HMGB-1，其mRNA及蛋白水平的表達(dá)在DAI后3d才開(kāi)始大幅度顯著升高。這也與既往研究結(jié)果一致。HMGB-1屬于一種晚期階段的促炎因子，它早期階段主要由壞死的細(xì)胞釋放，而在晚期則主要由激活的炎性細(xì)胞表達(dá)釋放［14］。既往研究證實(shí)，在腦缺血后HMGB-1主要來(lái)自于壞死的神經(jīng)元或活化的小膠質(zhì)細(xì)胞［3］，而在外周炎癥反應(yīng)中其主要來(lái)自于活化的單核巨噬細(xì)胞［15］。DAI后，腦組織中也會(huì)有大量外周炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞是否會(huì)大量釋放HMGB-1，從而誘發(fā)腦組織的炎癥反應(yīng)，目前還不清楚。但是，近來(lái)研究人員發(fā)現(xiàn)，在蛛網(wǎng)膜下腔出血中，HMGB-1主要來(lái)自于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，而并非浸潤(rùn)到腦組織中的巨噬細(xì)胞［4］。

在本實(shí)驗(yàn)中，DAI后6h神經(jīng)元凋亡已明顯增加，并呈持續(xù)增加趨勢(shì)，DAI后3d達(dá)到高峰，一直持續(xù)至DAI后7d仍處于較高水平，分析其原因，這是因?yàn)镠MGB-1主要來(lái)自于壞死或活化的細(xì)胞，凋亡細(xì)胞并不釋放HMGB-1至細(xì)胞外間隙［16］。因此，凋亡細(xì)胞數(shù)量的增加并不能導(dǎo)致HMGB-1水平的升高，并且HMGB-1發(fā)揮促炎作用不僅與其表達(dá)水平相關(guān)，還與其向細(xì)胞外的釋放相關(guān)。還有，本研究中將腦組織中HMGB-1水平與神經(jīng)細(xì)胞凋亡做相關(guān)性研究并不能完全解釋HMGB-1與細(xì)胞凋亡之間的本質(zhì)關(guān)系。既往在肝臟疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，HMGB-1明顯參與了肝細(xì)胞的凋亡過(guò)程［17］。但是也有部分研究證實(shí)外源性給予HMGB-1不僅能抑制細(xì)胞凋亡，還能促進(jìn)細(xì)胞的增殖［18］。因此，DAI后HMGB-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是否可導(dǎo)致DAI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其潛在機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

總之，HMGB-1在腦外傷后作用及其機(jī)制的研究仍處于起始階段，DAI后腦組織內(nèi)HMGB-1表達(dá)呈逐漸升高的動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)干預(yù)HMGB-1是否可以改善DAI患者的預(yù)后仍需要更多的研究來(lái)證實(shí)。

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