PPARγ及其輔激活子MED1重組腺病毒的制備與生物學功能分析

白 亮，李倩薇，趙四海，賈玉枝，REDDY Janardan K，劉恩岐

（1．西安交通大學醫(yī)學部心血管中心動脈粥樣硬化與脂代謝研究室，陜西西安 710061；2．Department of Pathology，F(xiàn)einberg School of Medicine，Northwestern University，Chicago，IL 60611，USA；3．西安交通大學醫(yī)學部醫(yī)學實驗動物中心，陜西西安 710061；4．陜西中醫(yī)學院，陜西咸陽 712046）

轉(zhuǎn)錄因子PPARγ是脂肪代謝的重要調(diào)控子，一直是科學研究者們關注的焦點［1-2］。在脂肪組織中，PPARγ表達最為豐富，調(diào)控脂肪細胞分化和能量儲存［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，MED1（mediator 1）是 PPARγ的關鍵輔激活子［5］。MED1能與許多核受體如PPARs、RARα、RXR和GR等，以及多種轉(zhuǎn)錄因子如p53、GATA 家族、PGC-1和C／EBPβ等結合，提示MED1在機體組織以及細胞代謝中具有重要調(diào)控作用［5-7］。

重組腺病毒是一類復制缺陷的腺病毒載體，具有轉(zhuǎn)染效率高、感染細胞范圍廣、病毒滴度高、可感染細胞周期中靜止期和分裂期細胞，同時可高效介導基因的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移等優(yōu)點［8-9］。近年來，構建攜帶外源基因的重組腺病毒載體越來越多地用于基因功能的研究，還用于遺傳病和腫瘤的疾病基因治療［10］。本研究應用HEK293a細胞包裝擴繁Ad／PPARγ、Ad／MED1和對照Ad／LacZ，經(jīng)CsCl梯度離心純化，大批量生產(chǎn)了細胞感染及活體注射所需的重組腺病毒，檢測了Ad／PPARγ和Ad／MED1的生物學特性，為今后深入研究PPARγ及其輔激活子MED1的基因功能以及二者之間的網(wǎng)絡調(diào)控關系提供了有利工具。

1 材料與方法

1．1 細胞及腺病毒載體 HEK293a和3T3-L1細胞系均購自美國ATCC細胞庫。PPARγ重組腺病毒（Ad／PPARγ）和 MED1重組腺病毒（Ad／MED1）載體由實驗室構建。

1．2 重組腺病毒的擴增 用重組腺病毒原液先感染少量HEK293a細胞，36～48h后，約80%的細胞漂浮時，收集細胞，離心棄上清，加入少量DMEM培養(yǎng)液懸浮，在甲醇干冰浴和37℃水浴鍋中反復凍融3次，離心取病毒上清。大量培養(yǎng)HEK293a細胞，用所獲得的病毒上清感染細胞，裂解獲得病毒液，―80℃保存。

1．3 重組腺病毒的純化、滴度測定 梯度離心：將8mL 1．4mg／mL CsCl加入 Ultra-ClearTM離心管，再緩慢加入6mL 1．2mg／mL CsCl，隨后輕輕加入6mL病毒液，23 000r／min 4℃離心90min，去除上層雜質(zhì)，吸出白色病毒液，稀釋之后進行連續(xù)梯度離心。即依次加入12mL 1．4mg／mL的 CsCl、14mL 1．2mg／dL的CsCl，最后小心加入8mL上步離心獲得的病毒懸液，23 000r／min 4℃離心20h，從管中吸出病毒液。

用Slide-A-Lyzer透析盒透析病毒液3次，前2次每次2h，第3次4℃過夜，次日收集病毒。

對重組腺病毒的純化，運用非連續(xù)CsCl梯度離心去掉細胞雜質(zhì)和無活性的病毒液（圖1A）；運用連續(xù)CsCl梯度離心法分離獲得有活性的病毒液（圖1B）；并對獲得的病毒液進行洗脫透析，以提高病毒純度和感染效率。

圖1 密集CsCl梯度離心示意圖Fig．1 Model of CsCl gradient centrifuge

采用病毒顆粒（viral particles，VP）來描述病毒懸液的滴度，即測定260nm波長下病毒顆粒的吸光度（A）。1A相當于1．1×1012virus，具體計算公式如下：A260×viral dilution×1．1×1012VP／mL。將純化的病毒液按1∶50、1∶25和1∶10比例稀釋，55℃水浴15min，用分光光度計測定A260，計算病毒滴度。

1．4 重組腺病毒的體內(nèi)注射 C57BL／6J小鼠飼養(yǎng)在12h光照和12h黑暗交替的清潔級動物房，自由飲水、采食。5周齡時，給每只小鼠尾靜脈注射1×1011VP腺病毒，注射后第5天或第6天處死小鼠，收集肝臟組織。所有動物操作程序均按照美國NIH實驗動物保護協(xié)會的要求執(zhí)行。

1．5 組織學檢測 X-gal染色法：用100mL／L的冰甲醛固定肝臟組織切片10min，PBS、蒸餾水沖洗，加入X-gal染色液，37℃孵育數(shù)小時，PBS、蒸餾水沖洗、封片。

HE染色法：肝臟組織經(jīng)甲醛固定、脫水、石蠟包埋和切片后，蘇木素染色10min，伊紅染色2min。

油紅O染色法：40g／L多聚甲醛固定肝臟組織切片10min，雙蒸水洗3次，600mL／L異丙醇浸泡5min，使組織異丙醇化，以便使油紅O著色，然后用5mL／L的油紅O染液染色30min；600mL／L異丙醇洗、蒸餾水洗、甘油封片。

1．6 免疫組織化學法檢測PPARγ和MED1蛋白將肝臟切片在二甲苯中放置30min，然后放入1 000 mL／L乙醇3min，33mL／L過氧化氫1h；之后放入1 000、900、800mL／L乙醇分別3min，PBS沖洗，用20mL／L馬血清封閉2～4h；PPARγ抗體（Santa Cruz，1∶200稀釋）或 MED1抗體（Santa Cruz，1∶400稀釋）4℃孵育過夜；PBS沖洗，二抗室溫孵育1h，PBS沖洗，ABC孵育，DAB顯色，脫水透明、封片、照相。

1．7 實時定量PCR檢測PPARγ和MED1基因運用Trizol試劑（Invitrogen）提取總RNA，用2μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。TaKaRa（Thermal Cycler Dice Real-Time System）設備運行Q-PCR，每個樣品設置3個重復，18S作為內(nèi)參。20μL實時定量PCR反應體系：2×SYBR Green Master Mix 10μL，ddH2O 6．4μL，10μmol／L上游、下游引物各0．8μL（表1），cDNA 2．0μL。運用2-ΔΔCt來分析基因相對表達水平。

表1 Real-time PCR引物Tab．1 Primers for Real time PCR

1．8 統(tǒng)計學分析 以均數(shù)±標準差表示實驗數(shù)據(jù)，用 One-way ANOVA （SPSS 13．0）中的最小顯著差數(shù)法（LSD）來進行差異檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 PPARγ和MED1重組腺病毒的擴繁與純化及滴度的測定 為了獲得大量用于活體注射以及細胞感染的Ad／PPARγ、Ad／MED1及其對照腺病毒Ad／LacZ，依次對3種病毒原液進行了3輪擴繁，以期獲得高感染力的病毒。當HEK293a細胞感染病毒后，細胞表現(xiàn)為生長停滯，細胞之間空隙變大。感染24h后，細胞開始變圓，少量細胞漂浮。感染36～48h，可見約80%的細胞漂浮，表明腺病毒感染成功。

病毒滴度的測定結果顯示，隨著稀釋濃度的遞增，病毒顆粒的吸光度值也在遞減（表2）。用VLB將病毒液分別稀釋為1∶50、1∶25和1∶10，測定A260值，代入公式計算獲得Ad／LacZ濃度為2．51×1012VP／mL、Ad／PPARγ 濃 度 為 1．57×1012VP／mL，Ad／MED1濃度為2．59×1012VP／mL。

表2 重組腺病毒滴度的測定結果Tab．2 Determination of recombinant adenovirus gradient

2．2 Ad／LacZ的鑒定 在生物科學研究中，Ad／LacZ常作為病毒對照。本研究給C57BL／6J小鼠尾靜脈注射Ad／LacZ 6d后，取肝臟組織進行X-gal染色。結果證實，70%以上的肝細胞表達β-半乳糖苷酶（圖2）。Ad／LacZ的成功制備可以為Ad／PPARγ以及Ad／MED1的鑒定提供有效對照。

圖2 C57BL／6J小鼠肝臟X-gal染色Fig．2 β-galactosidase staining of C57BL／6Jmouse liver

2．3 PPARγ重組腺病毒的鑒定 C57BL／6J小鼠尾靜脈注射Ad／PPARγ6d，與空白對照組以及注射Ad／LacZ組相比，注射Ad／PPARγ的小鼠肝臟顏色發(fā)白，呈脂肪肝狀，肝臟重量指數(shù)顯著增加（P＜0．01，圖3）。HE與油紅 O 染色證實，注射 Ad／PPARγ的小鼠肝細胞中聚集大量脂滴（圖4），肝臟PPARγ和其靶基因aP2mRNA表達顯著升高（圖5A）。免疫組化染色顯示，注射Ad／PPARγ之后，PPARγ在肝細胞核中大量表達（圖5B）。上述研究結果均表明成功制備Ad／PPARγ，可用于今后基因功能以及基因網(wǎng)絡調(diào)控研究。

2．4 MED1重組腺病毒的鑒定 MED1是PPARγ的關鍵輔激活子。Ad／MED1感染3T3-L1細胞系后，Real-time PCR檢測結果表明，MED1mRNA表達明顯上調(diào)（圖6A）。同時，給5周齡C57BL／6J小鼠尾靜脈注射Ad／MED1，5d后收集肝臟組織提取總RNA，與Ad／LacZ對照組相比，干預組 MED1mRNA表達水平顯著升高（圖6B）。而且，免疫組化結果顯示，注射組小鼠MED1蛋白在肝細胞核中大量表達（圖6C）。上述結果表明，Ad／MED1擴繁和純化成功，病毒感染力強，可用于細胞感染和活體研究，以便深入研究基因功能。

圖3 注射Ad／PPARγ的C57BL／6J小鼠出現(xiàn)脂肪肝（A）及肝-體重量比變化（B）Fig．3 Changes in fatty liver（A）and liver-body mass ratio（B）of C57BL／6Jmice without or with Ad／LacZ or Ad／PPARγinjection

圖4 注射Ad／LacZ或Ad／PPARγ小鼠的肝臟組織學改變Fig．4 Histological changes of liver from wild type mice without or with Ad／LacZ or Ad／PPARγinjection（×200）

圖5 野生型小鼠注射Ad／PPARγ后肝臟高表達PPARγFig．5 Overexpression of PPARγin livers from wild type mice with Ad／PPARγinjection

3 討 論

PPARγ是機體能量代謝的關鍵調(diào)控基因，它通過調(diào)節(jié)下游靶基因的表達，在脂肪形成、糖脂代謝、炎癥以及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，并與多種疾病如肥胖、脂肪肝、糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓、癌癥等的發(fā)生發(fā)展密切相關［1，4，11-12］。以 PPARγ為誘餌，從小鼠肝臟中克隆獲得轉(zhuǎn)錄輔激活子MED1［5］。體外研究發(fā)現(xiàn)，即使給予PPARγ刺激，MED1-／-小鼠胚胎成纖維細胞也不能向成脂分化［13］。體內(nèi)研究表明，肝臟MED1特異性敲除小鼠能夠抵抗PPARγ誘導的脂肪肝形成。因而，PPARγ與MED1密切聯(lián)系，二者相輔相成。

腺病毒是一種大分子雙鏈無包膜DNA病毒，它通過受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，進而腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中［9，14］。本研究通過HEK293a細胞包裝、病毒感染擴繁和CsCl梯度純化，獲得了大量Ad／LacZ、Ad／PPARγ和Ad／MED1，經(jīng)鑒定這些重組腺病毒具有高感染力，可以作為今后基因功能研究的有效工具。

圖6 3T3-L1細胞系或野生型小鼠感染Ad／MED1后高表達MED1Fig．6 Overexpression of MED1in 3T3-L1cell line or wild type mice infected with Ad／MED1

腺病毒載體轉(zhuǎn)基因效率高，體外實驗通常接近100%的轉(zhuǎn)導效率；可轉(zhuǎn)導不同類型的人組織細胞，不受靶細胞是否為分裂細胞所限；容易制得高滴度病毒載體；進入細胞內(nèi)并不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達，安全性高［9，14-15］。因而，重組腺病毒是基因治療、疫苗治療和基礎生物學的有效工具［16-17］。本研究為了驗證重組腺病毒的感染效率，同時做了細胞感染實驗和小鼠活體尾靜脈注射實驗。結果顯示，Ad／PPARγ和Ad／MED1對3T3L1細胞系和C57BL／6J小鼠均具有強感染力。重組腺病毒感染后，MED1和PPARγmRNA和蛋白表達均顯著上升。其中，Ad／PPARγ活體注射后表現(xiàn)出明顯的生物學效應，即小鼠肝臟發(fā)生脂肪變性。這些結果均表明，Ad／PPARγ和Ad／MED1的批量擴繁、純化、鑒定成功，為我們今后研究PPARs代謝途徑奠定了堅實的基礎。

CsCl密度梯度離心是一種快速、經(jīng)濟、回收率高的經(jīng)典方法，適合于大規(guī)模分離和純化重組腺病毒。在以往的研究中，我們實驗室僅使用一步CsCl連續(xù)梯度離心法，然后用Slide-A-lyzer（10 000MWCO）透析來獲得純化病毒，獲得的病毒量少，一次只能滿足數(shù)十只小鼠的注射需求。此外，我們給小鼠注射后，發(fā)現(xiàn)有少數(shù)小鼠注射病毒后出現(xiàn)死亡情況，分析其原因可能是透析不徹底，存在的氯化銫對小鼠具有潛在的毒性。因此，我們改進了純化方法，使用兩步法，即非連續(xù)和連續(xù)梯度離心法。透析時使用了Slide-A-lyzer（20 000MWCO）。經(jīng)改進后，獲得的病毒量大，一次可以滿足數(shù)百只小鼠的注射需求，且對小鼠無任何毒性。

本研究大批量制備了細胞感染、活體注射所需的Ad／PPARγ和Ad／MED1以及對照 Ad／LacZ。經(jīng)滴度測定和生物學活性分析，所獲得的病毒具有高活力，能夠有效侵染宿主細胞，為今后核受體PPARγ、轉(zhuǎn)錄輔激活子MED1的基因功能研究奠定了堅實的實驗基礎。

［1］WANG YX．PPARs：diverse regulators in energy metabolism and metabolic diseases［J］．Cell Res，2010，20（2）：124-137．

［2］REDDY JK．Peroxisome proliferators and peroxisome proliferator-activated receptor alpha：biotic and xenobiotic sensing［J］．Am J Pathol，2004，164（6）：2305-2321．

［3］TONTONOZ P，HU E，SPIEGELMAN BM．Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma2，a lipid-activated transcription factor［J］．Cell，1994，79（7）：1147-1156．

［4］ROSEN ED，WALKEY CJ，PUIGSERVER P，et al．Transcriptional regulation of adipogenesis［J］．Genes Develop，2000，14（11）：1293-1307．

［5］ZHU Y，QI C，JAIN S，et al．Isolation and characterization of PBP，aprotein that interacts with peroxisome proliferator-activated receptor［J］．J Biol Chem，1997，272（41）：25500-25506．

［6］CRAWFORD SE，QI C，MISRA P，et al．Defects of the heart，eye，and megakaryocytes in peroxisome proliferator activator receptor-binding protein （PBP）null embryos implicate GATA family of transcription factors［J］．J Biol Chem，2002，277（5）：3585-3592．

［7］LI H，GADE P，NALLAR SC，et al．The Med1 subunit of transcriptional mediator plays a central role in regulating CCAAT／enhancer-binding protein-beta-driven transcription in response to interferon-gamma［J］．J Biol Chem，2008，283（19）：13077-13086．

［8］GRAHAM FL，PREVEC L．Adenovirus-based expression vectors and recombinant vaccines［J］．Biotechnology，1992，20：363-390．

［9］LUO J，DENG ZL，LUO X，et al．A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system［J］．Nat Protoc，2007，2（5）：1236-1247．

［10］MAJHEN D，CALDERON H，CHANDRA N，et al．Adenovirusbased vaccines for fighting infectious diseases and cancer：progress in the field［J］．Hum Gene Ther，2014，25（4）：301-317．

［11］WANG N，YIN R，LIU Y，et al．Role of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in atherosclerosis：an update［J］．Circ J，2011，75（3）：528-535．

［12］BLASCHKE F，TAKATA Y，CAGLAYAN E，et al．Obesity，peroxisome proliferator-activated receptor，and atherosclerosis in type 2 diabetes［J］．Arterioscler Throm Vasc Biol，2006，26（1）：28-40．

［13］GE K，GUERMAH M，YUAN CX，et al．Transcription coactivator TRAP220is required for PPAR gamma 2-stimulated adipogenesis［J］．Nature，2002，417（6888）：563-567．

［14］HE TC，ZHOU S，DA COSTA LT，et al．A simplified system for generating recombinant adenoviruses［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（5）：2509-2514．

［15］SILVA AC，F(xiàn)ERNANDES P，SOUSA MF，et al．Scalable production of adenovirus vectors［J］．Methods Mol Biol，2014，1089：175-196．

［16］MITTEREDER N，MARCH KL，TRAPNELL BC．Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy［J］．J Virol，1996，70（11）：7498-7509．

［17］DEAL C，PEKOSZ A，KETNER G．Prospects for oral replicating denovirus-vectored vaccines［J］．Vaccine，2013，31（32）：3236-3243．