低濕度表面的海洋附著細菌對厚殼貽貝附著的影響

周軒，郭行磐，陳芋如，李家樂，楊金龍

(上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海高校知識服務(wù)平臺上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳育種中心，上海201306)

厚殼貽貝Mytilus coruscus為中國重要的貝類養(yǎng)殖品種和主要的筏式養(yǎng)殖貝類品種，其分布于黃海、渤海和東海沿岸［1］，其中以浙江沿海資源量最大。近年來，因過度采捕導(dǎo)致厚殼貽貝自然資源逐漸減少，自然海區(qū)附苗數(shù)量和質(zhì)量明顯下降，厚殼貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)也受到嚴重影響。目前，厚殼貽貝規(guī)?；斯し敝臣夹g(shù)一直未得到很好的解決，育苗數(shù)量不穩(wěn)定，導(dǎo)致苗種供不應(yīng)求［2］。厚殼貽貝幼蟲在完成浮游生活階段后，附著變態(tài)成為稚貝，最終發(fā)育為成貝［3］。與許多其他海洋無脊椎動物不同，當環(huán)境變化時，貽貝稚貝能夠自行切斷足絲，開始爬行并重新選擇附著基進行再次附著。

在海洋環(huán)境中，微生物被膜存在于幾乎所有固體附著基質(zhì)的表面［4］。海洋細菌黏附到基質(zhì)表面并分泌胞外產(chǎn)物，從而形成細菌黏膜，是微生物被膜形成的關(guān)鍵階段，在海洋無脊椎動物幼蟲的附著變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。附著基質(zhì)的表面濕度影響海洋細菌的附著、微生物被膜的形成和海洋無脊椎動物幼蟲的附著［5-6］。然而，形成于低濕度表面的海洋細菌對稚貝附著影響的研究鮮有報道。本研究中，從硅烷化處理后的載玻片上形成的自然微生物被膜中分離和純化海洋附著細菌，研究了單一菌株形成的微生物被膜對厚殼貽貝稚貝附著的影響，同時構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其遺傳距離與貽貝附著的相互關(guān)系，查明厚殼貽貝稚貝附著行為與海洋細菌的關(guān)系，旨在為進一步研究厚殼貽貝稚貝的附著機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用厚殼貽貝稚貝取自浙江嵊泗縣東海貽貝科技創(chuàng)新服務(wù)有限公司，殼長為 (1．80±0．05)mm，殼高為 (1．17±0．03)mm，在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)1周后用于試驗。暫養(yǎng)期間，溫度控制在18℃，充氣培養(yǎng)，每天換水1次并投喂金藻。

試驗用海洋細菌來源于浙江舟山嵊泗海域自然微生物被膜，利用ZoBell 2216E平板培養(yǎng)法分離純化得到單株，進行試驗。掛板所用載玻片經(jīng)過二氯二甲基硅烷(Dichlorodimethylsilane，DMS)(Sigma公司)處理。

1.2 方法

1．2．1 海洋細菌的分離 參考 Yang等［7］的方法，使用無菌載玻片將微生物被膜從載玻片表面刮至滅菌過濾海水 (AFSW)中，形成懸浮液。經(jīng)倍比稀釋后，滴適量涂布于ZoBell 2216E瓊脂平板上，在25℃、黑暗條件下培養(yǎng)48 h后，挑取菌落，在平板上反復(fù)劃線分離純化，得到純種菌株，并在15%的甘油溶液 (用體積分數(shù)為0．9%的生理鹽水配制)中保存 (-80℃)備用。

1．2．2 細菌16S rRNA基因序列的鑒定

(1)DNA提取。將海洋細菌加入到100 μL無菌蒸餾水中，用細菌基因組DNA抽提試劑盒 (上海博彩生物科技有限公司)提取。

(2)PCR擴增。采用細菌16S rDNA序列通用引物進行擴增，引物為27F(5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3')和1492R(5'GGTTACCTTGTTACGACTT 3')。擴增總體系 (共25 μL):模板DNA 2 μL，4×dNTPs(10 μmol/L)0．5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0．2 μL，引物(20 pmol/μL)各 0．5 μL，10×擴增緩沖液 (含 Mg2+)2．5 μL，用ddH2O補足至25 μL。PCR反應(yīng)在銀制梯度PCR儀 (Eppendorf公司)上進行。PCR擴增條件:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s，55℃下退火30 s，每一循環(huán)遞減0．5℃，72℃下延伸2 min，共進行35個循環(huán);最后在72℃下延伸8 min，于-20℃下保存?zhèn)溆?。PCR擴增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)上海邁浦生物技術(shù)有限公司測序，獲得的序列通過Blast 程 序 與 GENEBAN(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/)中核酸數(shù)據(jù)進行比對，確定其菌名。

1．2．3 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 將得到的序列與有親緣關(guān)系的序列在Mega 5．05軟件的CLUSTALW程序上進行分析。使用Mega 5．05軟件的鄰接法 (NJ)、最大簡約法 (MP)和最小進化分析法 (1000次重復(fù))構(gòu)建進化樹。用Jukes-Cantor方法計算遺傳距離。從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中得到Escherichia coli(序列號 AONF01000005．1)作為外群序列，用于構(gòu)建細菌系統(tǒng)發(fā)育樹。

1．2．4 微生物被膜的制備 參考Yang等［7］的方法，挑取純種菌株到100 mL ZoBell 2216E液體培養(yǎng)基上，在25℃、黑暗條件下擴大培養(yǎng)48 h后，離心洗滌 (1600 g，15 min)濃縮到50 mL并制成懸浮液。用0．1%吖啶橙染色5 min，在1000倍熒光顯微鏡(奧林巴斯BX51)下隨機選取10個點進行計數(shù)，確定細菌總密度。先將載玻片放入滅菌培養(yǎng)皿 (Φ64 mm×19 mm)中，隨后添加細菌，通過無菌海水定容至20 mL，每株細菌的初始密度分別為 1×106、3×106、5×106、10×106cells/mL，18℃、黑暗條件下培養(yǎng)48 h后形成微生物被膜。

1．2．5 細菌密度的計數(shù) 微生物被膜被固定在體積分數(shù)為5%的福爾馬林溶液中。固定后的微生物被膜經(jīng)AFSW 清洗3次，用0．1%吖啶橙染色5 min后，在1000倍熒光顯微鏡下隨機選取10個點進行計數(shù)，確定不同初始密度的細菌最終形成微生物被膜的終密度。

1．2．6 稚貝附著試驗 在每個滅菌培養(yǎng)皿中加入20 mL AFSW，并放入1個附有微生物被膜的載玻片和10枚稚貝。在試驗的12 h和24 h時，記錄稚貝的附著率，即載玻片上附著的稚貝個數(shù)占該培養(yǎng)皿中稚貝總個數(shù)的百分比。每株細菌設(shè)置9個平行組，以空白載玻片作為對照，每次試驗設(shè)置3個空白對照組，均在18℃、黑暗條件下進行試驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

細菌誘導(dǎo)附著的活性用附著率表示，將百分比數(shù)據(jù)進行反正弦轉(zhuǎn)化。在統(tǒng)計分析之前，所有的數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗。如不滿足正態(tài)性分布，則通過Kruskal-Wallis Test進行評估檢驗。同時，進行相關(guān)性檢驗。采用JMP 10．0．0軟件進行統(tǒng)計分析，顯著性水平設(shè)為0．05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海洋細菌對厚殼貽貝稚貝附著的影響

表1為試驗過程中所使用的海洋細菌。9株細菌在試驗12 h和24 h時對厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)結(jié)果基本相似，因此，本研究中僅列出12 h的誘導(dǎo)效果，其結(jié)果如圖1所示?？瞻讓φ战M稚貝的附著率僅為17%±3%，與空白對照組相比，所有測試菌株均顯著誘導(dǎo)厚殼貽貝稚貝附著 (P＜0．05)。從圖 1可見:Bacillus sp．2的誘導(dǎo)活最高性，其附著率最高為68%±2%;Nautella sp．1的誘導(dǎo)活性最低，其附著率最高為38%±3%;其余7株細菌表現(xiàn)出中等程度的誘導(dǎo)活性。

表1 海洋細菌16S rDNA基因序列分析Tab.1 16S rDNA gene sequence analysis of the marine bacterial strains

圖1 不同海洋細菌對厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)作用Fig.1 Percentages of settlement of juvenile mussel Mytilus coruscus on the nine monospecific bacterial biofilms

2.2 細菌終密度對稚貝附著率的影響

不同微生物被膜終密度對稚貝附著的影響如圖2所示。從圖 2可見:Bacillus sp．2在 9．0×106cells/cm2低密度時呈現(xiàn)出最高誘導(dǎo)活性，而在高密度時誘導(dǎo)活性顯著下降 (P＜0．05)。同樣，Alteromonas sp．1 在 1．3×107cells/cm2高密度時，其誘導(dǎo)的稚貝附著率顯著下降 (P＜0．05)。稚貝附著與細菌終密度之間的關(guān)系如表2所示。從表2可見:除Pseudoalteromonas sp．3的終密度與稚貝附著率無顯著相關(guān)性外 (P＞0．05)，其余8株海洋細菌終密度與稚貝附著率均顯著相關(guān) (P＜0．05)。

2.3 初始細菌密度對微生物被膜形成的影響

初始細菌密度對微生物被膜形成的影響如圖3所示。從圖 3可見:初始細菌密度為 1×106cells/mL時，Bacillus sp．2形成微生物被膜的終密度最高;初始細菌密度為3×106cells/mL時，Acinetobacter sp．1形成微生物被膜的終密度最高;初始細菌密度為5×106cells/mL時，Microbacterium sp．1形成微生物被膜的終密度最高;初始細菌密度為10×106cells/mL 時，Pseudoalteromonas sp．2形成微生物被膜的終密度最高。在4種初始密度下，Pseudoalteromonas sp．1形成微生物被膜的終密度均為最低。

表2 細菌終密度與誘導(dǎo)活性的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between the final bacterial density and inducing activity in biofilms

圖2 單一菌株形成微生物被膜的終密度對厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)作用Fig.2 Percentages of settlement of juvenile mussel Mytilus coruscus on monospecific bacterial biofilms at various densities

2.4 海洋細菌的序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用不同的方法和模式進行系統(tǒng)發(fā)育分析，測試菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示。Pseudoalteromonas sp．1 與 Alteromonas sp．1 之間的遺傳距離為0．109，分屬于兩個不同的屬，都表現(xiàn)出中等程度的誘導(dǎo)活性。相反，Bacillus sp．2和Bacillus sp．1之間的遺傳距離只有0．074，同屬于芽孢桿菌屬，但前者的誘導(dǎo)活性顯著高于后者 (P＜0．05)。 同 時， Pseudoalteromonas sp．1、Pseudoalteromonas sp．2 和 Pseudoalteromonas sp．3 兩兩之間的遺傳距離最大為0．004，屬于假交替單胞菌屬，均表現(xiàn)出中等程度的誘導(dǎo)活性，但形成微生物被膜的終密度差異較大。

3 討論

圖3 不同初始細菌密度下形成微生物被膜的終密度變化 (n=30)Fig.3 Density of monospecific bacterial biofilms under different initial densities(n=30)

許多海洋無脊椎動物幼體選擇在具有一定理化性質(zhì)的附著基表面進行附著［5-6］，附著基的材質(zhì)、表面粗糙度、表面濕度、表面張力、微貌結(jié)構(gòu)等特性對海洋無脊椎動物附著均有不同程度的影響［5］。然而，以往研究主要集中在附著基質(zhì)表面性質(zhì)與海洋無脊椎動物的附著關(guān)系，而關(guān)于附著基質(zhì)表面形成微生物被膜的研究鮮有報道。海洋細菌能夠通過形成微生物被膜而改變附著基表面的理化性質(zhì)，從而在海洋無脊椎動物幼蟲附著過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［8-11］。本研究中首次證明，來源于低濕度表面的海洋細菌能夠有效誘導(dǎo)厚殼貽貝稚貝的附著。

圖4 細菌16S rDNA基因序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences from bacterial isolates using the Neighbor－Joining method and the Jukes－Cantor model

附著細菌是海洋微生物被膜的重要構(gòu)成生物之一。以往研究發(fā)現(xiàn)，細菌密度與一些海洋無脊椎動物幼蟲附著相關(guān)。在自然微生物被膜中，Wang等［12］研究表明，微生物被膜中的附著細菌密度與厚殼貽貝幼蟲的附著顯著相關(guān)。在對單一菌株的研究中，Huang等［13］分析了細菌密度對微生物被膜形成的影響，并探討了其對華美盤管蟲Hydroides elegans幼蟲附著的影響，研究結(jié)果表明，單一菌株形成微生物被膜的最終密度與細菌初始密度顯著相關(guān)，且與該幼蟲的附著變態(tài)顯著相關(guān)。然而，Tran等［14］研究表明，盡管初始細菌密度影響所形成單一菌株微生物被膜的最終密度，但僅1株高誘導(dǎo)活性菌株的密度與鹿角杯形珊瑚Pocillopora damicornis幼蟲附著顯著相關(guān)，其他菌株的密度則與幼蟲附著無相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，初始細菌密度明顯影響微生物被膜的最終密度，且5株海洋附著細菌的終密度與厚殼貽貝稚貝附著呈正相關(guān)，4株呈負相關(guān)，僅1株細菌的終密度與稚貝附著無相關(guān)性。由此可見，細菌密度與厚殼貽貝稚貝的附著有著密切的聯(lián)系。本研究結(jié)果還表明，海洋細菌形成微生物被膜的誘導(dǎo)活性并非隨細菌密度的升高而逐漸升高，而均在最適密度下活性達到最大，隨后下降，這表明特定細菌存在一個閾值效應(yīng)，且微生物被膜中細菌密度與誘導(dǎo)活性之間的線性關(guān)系取決于特定的菌株。本研究結(jié)果與Yang等［7］對細菌密度與厚殼貽貝幼蟲附著關(guān)系的研究結(jié)果極為相似。研究表明，海洋細菌中的化學(xué)信號物質(zhì)參與了貽貝幼蟲的附著過程［7，15］，而本研究中厚殼貽貝稚貝附著同樣可能與特定菌株分泌的化學(xué)誘導(dǎo)信號物質(zhì)有關(guān)，這需要進一步地研究證實。

海洋細菌種屬也與海洋無脊椎動物幼體附著有密不可分的關(guān)系。Bao等［16］在研究交替單胞菌Alteromonas sp．1對地中海紫貽貝 Mytilus galloprovincialis幼蟲附著變態(tài)時，發(fā)現(xiàn)此菌對紫貽貝幼蟲有顯著的誘導(dǎo)活性，且來源于該菌中的化學(xué)信號物質(zhì)參與了幼蟲的附著變態(tài)過程。本研究結(jié)果也表明，該菌屬對厚殼貽貝稚貝具有誘導(dǎo)活性。由此推測，該菌對不同種屬貽貝附著均有一定程度的誘導(dǎo)活性，這一菌屬均可分泌不同化學(xué)信號物質(zhì)來促進貽貝附著，然而其具體作用機理有待進一步研究。另外，本試驗中同屬于芽孢桿菌屬的Bacillus sp．2和Bacillus sp．1對厚殼貽貝稚貝的誘導(dǎo)活性顯著不同，而不同屬的 Pseudoalteromonas sp．1和 Alteromonas sp．1對厚殼貽貝稚貝的誘導(dǎo)活性相似，此結(jié)果符合Yang等［7］的研究結(jié)論，即海洋無脊椎動物幼蟲的附著變態(tài)與細菌種屬無特定關(guān)聯(lián)。但是假交替單胞菌屬的3株細菌均表現(xiàn)出中等誘導(dǎo)活性，又與此結(jié)論相悖，所以這進一步證實了海洋細菌對厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)作用與細菌種屬無必然聯(lián)系，可能與它們分泌的胞外代謝產(chǎn)物的種類以及形成微生物被膜的具體結(jié)構(gòu)相關(guān)［15，17］。

附著基表面濕度能夠影響細菌群落的構(gòu)成。Huggett等［18］研究表明，低表面濕度附著基對附著其上的表面細菌群落有一定的影響，從而抑制華美盤管蟲幼蟲的附著。本研究中，9種海洋細菌均從低濕度表面形成的微生物被膜中分離所得，研究結(jié)果表明，細菌對厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)活性都比較高且與表面濕度的關(guān)系不明顯。這與Yang等［7］從自然微生物被膜和貽貝貝殼等不同表面分離的細菌對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)影響的研究結(jié)果一致。

綜上所述，從低濕度附著基表面分離的海洋細菌形成單一菌株的微生物被膜能夠有效促進厚殼貽貝稚貝的附著，附著率與細菌密度顯著相關(guān)，但與細菌的種屬無顯著相關(guān)性。本研究成果對于今后闡明厚殼貽貝附著機制的研究具有重要的理論意義。

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