霉菌毒素OTA和α-ZOL對Hep G2細(xì)胞增殖及氧化損傷的影響

王海微，鄭楠，李松勵，李發(fā)弟，王加啟

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京

畜牧獸醫(yī)研究所，北京　100193)

霉菌毒素OTA和α-ZOL對Hep G2細(xì)胞增殖及氧化損傷的影響

王海微1,2，鄭楠2，李松勵2，李發(fā)弟1，王加啟1,2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京

畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

摘要：為了研究不同劑量赭曲霉毒素A(OTA)和α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)聯(lián)合作用對Hep G2細(xì)胞毒性的交互作用及其可能機(jī)制，試驗采用3×3析因試驗設(shè)計，設(shè)OTA濃度和α-ZOL濃度2個因素，OTA濃度水平分別為0、6和12 μmol/L，α-ZOL濃度水平分別為0、15和30 μmol/L，全組合后共組成9個水平組合.毒素作用時間為48 h.用邊際均數(shù)輪廓圖判斷細(xì)胞毒性和氧化損傷的交互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OTA和α-ZOL聯(lián)合作用時，細(xì)胞毒性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性和谷胱甘肽(GSH)含量的交互作用一致，均表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)；且細(xì)胞活力的變化與SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性和GSH含量的變化表現(xiàn)為顯著性相關(guān)(P<0.05).結(jié)果表明細(xì)胞毒性的交互作用為拮抗效應(yīng)，且氧化損傷是毒素誘發(fā)細(xì)胞毒性的主要途徑之一.

關(guān)鍵詞：赭曲霉毒素A；α-玉米赤霉烯醇；氧化損傷；析因法；邊際均數(shù)

第一作者：王海微(1987-)，男，碩士研究生，研究方向為生鮮乳質(zhì)量安全.E-mail:wanghaiweihappy@163.com

李發(fā)弟，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究.E-mail:lifd@gsau.edu.cn

霉菌毒素是霉菌的次級代謝產(chǎn)物，主要存在于被污染的食物和飼料中.在霉菌毒素中，赭曲霉毒素A(OTA)和玉米赤霉烯醇(ZEA)在食品和飼料中的檢出率高，對人類健康造成了重大威脅，已引起了社會廣泛的關(guān)注.OTA被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為2B類致癌物[1-2]，具有腎毒性、肝毒性和免疫毒性[3].ZEA也被IARC列為3類致癌物[1-2]，具有肝毒性和雌激素樣毒性[4].ZEA能夠通過肝臟代謝為α-ZOL，且α-ZOL的雌激素活性是ZEA的3~4倍[5].

國內(nèi)外已有許多關(guān)于谷物中霉菌毒素共存的報道.如Rodrigues等[6]檢測了3 300份玉米、大豆、小麥、大麥和大米樣品，結(jié)果表明有42%以上的樣品檢出2種或3種霉菌毒素.陳心儀等[7]檢測了中國18個省份的41份玉米樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品中都同時存在OTA與ZEA.Huang等[8]檢測了50個牛奶樣品中的霉菌毒素，結(jié)果表明45%的樣品中同時檢出了OTA、ZEA與α-ZOL.國內(nèi)外試驗結(jié)果表明，OTA和α-ZOL分別作用于細(xì)胞時，可以誘發(fā)細(xì)胞毒性，且細(xì)胞毒性呈現(xiàn)出劑量依賴[9-10]，但有關(guān)OTA和α-ZOL間交互效應(yīng)及其作用機(jī)制的研究報道較少.本試驗旨在通過研究OTA和α-ZOL單一作用及其聯(lián)合作用對Hep G2的細(xì)胞毒性和氧化損傷，判斷OTA與α-ZOL的細(xì)胞毒性交互作用及其機(jī)制，為食品的質(zhì)量安全風(fēng)險評估提供參考.

1材料與方法

1.1　材料與試劑

Hep G2細(xì)胞株：美國ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetalbovine serum,FBS)：美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]，二甲基亞砜(DMSO)：美國Sigma公司；BCA蛋白濃度、SOD、MDA、GSH-PX和GSH測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；PBS磷酸鹽緩沖溶液，胰蛋白酶液、青霉素鏈霉素混合液、IP細(xì)胞裂解液：碧云天生物技術(shù)研究所；OTA標(biāo)準(zhǔn)品：美國Fermentek公司；α-ZOL標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；其余試劑：國產(chǎn)分析純.毒素母液配制：分別將5 mg OTA和α-ZOL，溶解于1 mL甲醇中，配成濃度為5 000 μg/mL的母液，-20 ℃冷凍儲存.

1.2　試驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將Hep G2細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞生長至80%~90%融合時，用胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞.

1.2.2細(xì)胞活力的測定取96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，Hep G2細(xì)胞濃度為5×104個/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，處理組加入含有不同濃度毒素的處理液，對照組加入100 μL不含毒素但含有相應(yīng)甲醇濃度的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后除去培養(yǎng)液，加入0.5 mg/mL MTT-DMEM孵育4 h，吸除培養(yǎng)基后，加入100 μL DMSO搖晃5 min，以完全溶解出MTT紫色結(jié)晶產(chǎn)物.用酶標(biāo)儀在570 nm處(以630 nm為參考波長)測定吸光度值.試驗重復(fù)3次.計算公式如下[11-12].

1.2.3細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-PX、MDA及SOD含量的測定染毒培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，1 500 r/min離心3 min后用PBS洗滌細(xì)胞3次.每個樣品中加入150 μL含1% Triton X-100，20 mmol/L Tris(pH 7.5)的裂解液，進(jìn)行裂解.取裂解液分別測定超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性，丙二醛(MDA)及谷胱甘肽(GSH)含量，按照試劑盒說明書中詳細(xì)操作步驟進(jìn)行測定.

1.3　試驗設(shè)計

本試驗采用3×3析因試驗設(shè)計，設(shè)A和B 2個因素.A為OTA濃度水平，A1、A2和A3分別為0，6、12 μmol/L；B為α-ZOL濃度水平，B1、B2和B3分別為0、15、30 μmol/L；A因素的3個濃度水平與B因子的3個濃度水平進(jìn)行全組合，共組成9個水平組合，具體組合方式見表1.毒素作用時間為48 h.

參照顧兵等[13]和張蕾等[14]的方法，根據(jù)邊際均數(shù)輪廓圖判斷毒素交互作用類型：如果2條量效曲線互相平行(斜率差異不顯著)，則說明二因素之間具有加和作用；如果2條量效曲線不平行(斜率差異顯著)，隨劑量增大，量效曲線下降(或上升)的趨勢顯著加強(qiáng)，二因素之間具有協(xié)同作用.反之隨劑量增大，量效曲線下降(或上升)的趨勢顯著減緩，二因素之間具有拮抗作用.

1.4　數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，顯著水平α=0.05.用Excel做邊際均數(shù)輪廓圖，并比較量效曲

線的斜率.

2結(jié)果與分析

2.1　OTA和α-ZOL單一及聯(lián)合作用對Hep G2細(xì)胞增殖及氧化損傷的影響

OTA單一作用時(試驗組1、4和7：OTA的濃度分別為0、6、12 μmol/L)，隨著作用濃度的升高，細(xì)胞活力逐漸降低，MDA含量逐漸升高，GSH-PX活性逐漸降低，GSH含量逐漸降低，且試驗組1、4和7的細(xì)胞活力，MDA含量，GSH-PX活性和GSH含量，組間差異均顯著(P<0.05).說明OTA的細(xì)胞毒性呈劑量依賴，MDA含量，GSH-PX活性和GSH含量的變化呈劑量依賴(表1).

表1　OTA和ZEA對Hep G2細(xì)胞活力和氧化損傷的聯(lián)合作用

a,b,c同列具有不同字母肩注者差異顯著(P<0.05)。

α-ZOL單一作用時(試驗組1、2和3：α-ZOL的濃度分別為0、15、30 μmol/L)，隨著作用濃度的升高，細(xì)胞活力逐漸降低，MDA含量逐漸升高，GSH-PX活性逐漸降低，GSH含量逐漸降低，且試驗組1、2和3的細(xì)胞活力，MDA含量，GSH-PX活性和GSH含量，組間差異均顯著(P<0.05).說明α-ZOL的細(xì)胞毒性呈劑量依賴，MDA含量，GSH-PX活性和GSH含量的變化也呈劑量依賴(表1).

從表1析因結(jié)果可見，兩種毒素聯(lián)合作用時，細(xì)胞毒性和氧化損傷(SOD，MDA，GSH-PX和GSH)表現(xiàn)出明顯的交互作用.

從表1可見，與OTA單一作用(試驗組4：OTA為6 μmol/L)相比，OTA和α-ZOL共同作用時(試驗組5:OTA為12 μmol/L，α-ZOL為15 μmol/L和試驗組6：OTA為12 μmol/L，α-ZOL為30 μmol/L)，隨著毒素濃度升高，SOD活力(試驗組5)沒有顯著性降低.與OTA單一作用(試驗組7：OTA為12 μmol/L)相比，OTA和α-ZOL共同作用時(試驗組8:OTA為12 μmol/L，α-ZOL為15 μmol/L和試驗組9：OTA為12 μmol/L，α-ZOL為30 μmol/L)，細(xì)胞活力(試驗組8和試驗組9)沒有顯著性降低，SOD活力(試驗組8和9)沒有顯著性降低，MDA含量(試驗組8)沒有顯著性升高，GSH-PX活力和GSH含量(試驗組8)沒有顯著性降低.與α-ZOL單一作用(試驗組2:α-ZOL為15 μmol/L)相比，OTA和α-ZOL共同作用時(試驗組5：OTA為6 μmol/L，α-ZOL為15 μmol/L和試驗組8:OTA為12 μmol/L，α-ZOL為15 μmol/L)，SOD活力(試驗組5和試驗組8)沒有顯著性降低，MDA含量(試驗組5)沒有顯著性升高.與α-ZOL單一作用(試驗組3:α-ZOL為30 μmol/L)相比，OTA和α-ZOL共同作用時(試驗組6：OTA為6 μmol/L，α-ZOL為30 μmol/L和試驗組9:OTA為12 μmol/L，α-ZOL為30 μmol/L)，SOD活力(試驗組6和試驗組9)沒有顯著性降低，MDA含量(試驗組6)沒有顯著性升高.

上述結(jié)果說明，兩種毒素聯(lián)合作用時，細(xì)胞毒性和氧化損傷(SOD，MDA，GSH-PX和GSH)可能表現(xiàn)為拮抗效應(yīng).

2.2　OTA和α-ZOL聯(lián)合作用的交互效應(yīng)

從圖1可見，OTA和α-ZOL聯(lián)合作用時，在OTA的濃度在6 μmol/L時，隨著α-ZOL濃度的升高(點B，E和H)，與對照組(曲線AB)相比，細(xì)胞活力(曲線DE和GH)下降的趨勢變慢.在OTA的濃度固定在12 μmol/L時，隨著α-ZOL濃度的升高(點C，F(xiàn)和I)，與對照組(曲線BC)相比，細(xì)胞活力(曲線EF和HI)下降的趨勢變慢.由表2可見，與對照組(曲線AB的斜率)相比，曲線DE和GH的斜率顯著性升高(曲線下降的趨勢顯著減緩)(P<0.05)，從而說明在OTA的濃度為6 μmol/L時，隨著α-ZOL濃度的升高，細(xì)胞毒性交互作用為拮抗效應(yīng)；與對照組(曲線BC的斜率)相比，曲線EF和HI的斜率顯著性升高(曲線下降的趨勢顯著減緩)(P<0.05)，從而說明在OTA的濃度為12 μmol/L時，隨著α-ZOL濃度的升高，細(xì)胞毒性交互作用為拮抗效應(yīng)。

同理，在OTA的濃度為6 μmol/L和12 μmol/L時，隨著α-ZOL濃度的升高，毒素對SOD活性影響的交互作用為拮抗效應(yīng)(圖2和表2)；在OTA的濃度為6 μmol/L和12 μmol/L時，隨著α-ZOL濃度的升高，毒素對GSH-PX活性影響的交互作用為拮抗效應(yīng)(圖4和表2)；在OTA的濃度為6 μmol/L 和12 μmol/L時，隨著α-ZOL濃度的升高，毒素對GHS含量影響的交互作用為拮抗效應(yīng)(圖5和表2).

圖1　OTA和ZEA聯(lián)合作用時細(xì)胞毒性的邊際均數(shù)輪廓Fig.1　The estimated marginal means of the combined cytotoxicity

圖2　OTA和ZEA聯(lián)合作用時SOD活性的邊際均數(shù)輪廓Fig.2　The estimated marginal means of the activities of intracellular SOD

圖3　OTA和ZEA聯(lián)合作用時MDA含量的邊際均數(shù)輪廓Fig.3　The estimated marginal means of the content of intracellular MDA

由圖3和表2可見，與對照組(曲線AB的斜率)相比，曲線DE和GH的斜率顯著性降低(曲線上升的趨勢顯著減緩)(P<0.05)，從而說明在OTA的濃度為6 μmol/L時，隨著α-ZOL濃度的升高，毒素對MDA含量影響的交互作用為拮抗效應(yīng)；與對照組(曲線BC的斜率)相比，曲線EF和HI的斜率顯著性降低(曲線上升的趨勢顯著減緩)(P<0.05)，從而說明在OTA的濃度為12 μmol/L時，隨著α-ZOL濃度的升高，毒素對MDA含量影響的交互作用為拮抗效應(yīng).

圖4　OTA和ZEA聯(lián)合作用時GSH-PX活性的邊際均數(shù)輪廓Fig.4　The estimated marginal means of the activities of intracellular GSH-PX

圖5　OTA和ZEA聯(lián)合作用時GSH含量的邊際均數(shù)輪廓Fig.5　The estimated marginal means of the content of intracellular GSH

a,b,c同列具有不同字母肩注者差異顯著(P<0.05).

2.3　細(xì)胞毒性和氧化損傷的相關(guān)性分析

由表3可見，細(xì)胞毒性與細(xì)胞內(nèi)SOD活性成顯著性正相關(guān)，與細(xì)胞內(nèi)MDA含量呈顯著性負(fù)相關(guān)，與細(xì)胞內(nèi)GSH-PX活力呈顯著性正相關(guān)，與細(xì)胞內(nèi)GSH含量呈顯著性正相關(guān).

3討論

3.1　OTA和α-ZOL單一及聯(lián)合作用對Hep G2細(xì)胞增殖及氧化損傷的影響

動物機(jī)體受到外源毒素的攻擊時，體內(nèi)的自由基增多，致使細(xì)胞受損或死亡.本試驗中OTA和α-ZOL單一作用及聯(lián)合作用都顯著降低了Hep G2細(xì)胞活力，且呈劑量依賴.本文的研究結(jié)果與Fusi等[15]和Tatay等[10]對OTA和α-ZOL的研究結(jié)果一致.

表3　細(xì)胞毒性與SOD活性，MDA含量，GSH-PX活性和

細(xì)胞內(nèi)有一套完整的抗氧化系統(tǒng)，使得機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除保持著一種動態(tài)平衡，其中SOD和GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)的主要抗氧化酶，其活力高低反映了機(jī)體清除自由基的能力.而MDA是自由基對不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用后的終產(chǎn)物.GSH是巰基酶的底物，是巰基化合物中最重要的非酶性抗氧化物.GSH和MDA含量可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞的受損程度[16].本試驗OTA和α-ZOL單一作用及聯(lián)合作用都顯著降低了細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性以及GSH含量，且升高了細(xì)胞內(nèi)中MDA含量.從而說明單一毒素及毒素組合都能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化且能降低細(xì)胞清除自由基的能力.王亞超等[17]和朱麗等[18]對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEA)的研究結(jié)果表明，DON與ZEA單一作用及共同作用，均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性和GSH含量.韓巍等[8]和Abid-Essefi等[19]對OTA與ZEA的研究結(jié)果表明，單一毒素及毒素組合，均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)SOD活性和提高M(jìn)DA含量.

3.2　OTA和α-ZOL聯(lián)合作用的交互效應(yīng)

大量研究結(jié)果表明，如果2種化合物具有相似的結(jié)構(gòu)，那么它們競爭細(xì)胞膜上同一靶位點，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性的交互作用表現(xiàn)為拮抗效應(yīng).Kouadio等[20]研究結(jié)果表明鐮刀菌屬霉菌毒素ZEA(玉米赤霉烯酮)和FB1(伏馬菌素)聯(lián)合作用時細(xì)胞毒性表現(xiàn)為拮抗效應(yīng).Ruiz等[21]的研究表明鐮刀菌屬霉菌毒素BEA(白僵菌素)，DON(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇)和T-2毒素間細(xì)胞毒性也表現(xiàn)為拮抗效應(yīng).OTA和α-ZOL也屬于鐮刀菌屬霉菌毒素，本試驗中OTA和α-ZOL聯(lián)合作用對細(xì)胞毒性的交互作用為拮抗效應(yīng)，對SOD和GSH-PX活性，MDA和GSH含量的交互作用也表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)，與Kouadio等[20]和Ruiz等[21]的研究結(jié)果保持一致，共同證明了毒素結(jié)構(gòu)可以影響毒素間細(xì)胞毒性的交互作用.

3.3　細(xì)胞毒性和氧化損傷的相關(guān)性分析

當(dāng)細(xì)胞受到毒素刺激時，生物膜上的不飽和脂肪酸極易受到攻擊而引起生物膜的脂質(zhì)過氧化損傷.從而引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞內(nèi)容物外溢，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20].大量研究結(jié)果表明，氧化損傷是毒素誘發(fā)細(xì)胞損傷或死亡的主要途徑之一.本試驗中細(xì)胞毒性與細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-PX活性，以及GSH含量呈顯著性正相關(guān)，與細(xì)胞內(nèi)MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān).這說明了細(xì)胞毒性與氧化損傷間存在著顯著性相關(guān).Behm等[22]和Abid-Essefi等[19]的研究表明，OTA和α-ZOL能夠引起脂質(zhì)過氧化從而改變細(xì)胞膜的形狀，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡.本試驗的結(jié)果和他們的結(jié)果共同驗證了氧化損傷與細(xì)胞毒性存在顯著性相關(guān)，證明了氧化損傷是毒素誘發(fā)細(xì)胞毒性的主要途徑之一.

4結(jié)論

本試驗結(jié)果說明OTA和α-ZOL聯(lián)合作用時，細(xì)胞毒性、SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性和GSH含量的交互作用一致，均表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)；且細(xì)胞毒性的變化與SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性和GSH含量的變化表現(xiàn)為顯著性相關(guān)，說明氧化損傷是毒素誘發(fā)細(xì)胞毒性的主要途徑之一.

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(責(zé)任編輯胡文忠)

Effects of ochratoxin A and α-zearalenol on proliferation and oxidative damage of Hep G2

WANG Hai-wei1,2,ZHENG Nan2，LI Song-li2,LI Fa-di1,WANG Jia-qi1,2

(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China；

2.Institute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)

Abstract：The objectives of this study were to investigate the combined effects of ochratoxin A (OTA) and α-zearalenol (α-ZOL) on Hep G2 cells,and to explore the cytotoxicity mechanism.3×3 factorial analysis design was applied in this trial.Nine groups were adopted to investigate the combined cytotoxicity of three levels of OTA (0μmol/L,6μmol/L and 12μmol/L) and three levels of α-ZOL (0μmol/L,15μmol/L and 30μmol/L) after 48 h of exposure.The cytotoxicity of two combined mycotoxins was evaluated by using the estimated marginal means.The results demonstrated the cytotoxicity of two combined mycotoxins indicated an antagonism.And the activities of intracellular SOD and GSH-PX,the content of intracellular MDA and GSH indicated an antagonism.There was a significant correlation between the cytotoxicity and the activities of intracellular SOD and GSH-PX (P<0.05),and there was a significant correlation between the cytotoxicity and the content of intracellular MDA and GSH (P<0.05).The results suggest that the combined cytotoxicity show an antagonism,and oxidative damage is one of the pathway of the cytotoxicity.

Key words：ochratoxin A;α-zearalenol;oxidative damage;factorial analysis;marginal means

收稿日期：2014-04-27；修回日期：2014-05-27

基金項目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項項目“生鮮乳質(zhì)量安全評價技術(shù)與生產(chǎn)規(guī)程”(201403071)，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金(nycytx-04-01)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS12).

通信作者：王加啟，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事乳品質(zhì)量安全風(fēng)險評估.E-mail:wang-jia-qi@263.net

中圖分類號：TS 207

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)04-0005-07