干細胞與再生醫(yī)學(xué)研究進展

王立賓，祝賀，郝捷，周琪

干細胞是一類具有自我更新和多向分化能力的細胞，包括從體內(nèi)胚胎分離獲得的胚胎干細胞和體外誘導(dǎo)獲得的多能性干細胞，以及成體干細胞。干細胞是進行細胞多能性維持機理研究、體細胞重編程機制研究和疾病發(fā)病機制研究等基礎(chǔ)研究的重要研究對象。同時，干細胞也作為遺傳性疾病治療藥物篩選、體外器官構(gòu)建的“種子”細胞，在疾病治療和再生醫(yī)學(xué)治療中具有重要價值。近些年，我國科學(xué)家在干細胞領(lǐng)域的很多方面都取得了很大的進展，特別是在誘導(dǎo)多能性干細胞與重編程、轉(zhuǎn)分化、單倍體干細胞、成體干細胞與生物材料的結(jié)合、基因修飾動物模型及基因治療等方面尤其突出。我國科學(xué)家做出的這些有世界影響力的工作極大地推進了國際干細胞的研究，也為我國在干細胞研究中贏得了話語權(quán)，使我國向干細胞研究強國邁進。

1 誘導(dǎo)多能性干細胞

2006年，山中伸彌研究組首先發(fā)現(xiàn)用4個轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc即可將體細胞重編程為多能性干細胞，即誘導(dǎo)多能性干細胞 (Induced pluripotent stem cells, iPSCs)[1]。誘導(dǎo)多能性干細胞有效地解決了胚胎干細胞(Embyonic stem cells, ESCs) 所面臨的倫理爭議和免疫排斥的問題，為干細胞研究打開了一扇新的門。但是 iPSCs出現(xiàn)以后一直無法像胚胎干細胞那樣通過四倍體補償?shù)玫桨l(fā)育的個體，因此 iPSCs能否通過多能性的金標準，發(fā)育為體內(nèi)所有類型的細胞成為領(lǐng)域內(nèi)極具有挑戰(zhàn)性的問題。為了回答這一問題，我國科學(xué)家通過建立新的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，成功通過四倍體補償技術(shù)獲得了 iPSC小鼠及其后代[2-3]。這項工作充分證明了iPSCs的發(fā)育全能性，為iPSCs的臨床和基礎(chǔ)研究鋪平了道路。但是，并不是所有的 iPSCs都具有完全的發(fā)育潛能，只有一小部分可以通過四倍體補償獲得iPSC小鼠，那么不同發(fā)育潛能的 iPSCs是不是存在—些差異呢？我國科學(xué)家通過在分子水平上比較不同發(fā)育潛能的iPSCs，在世界上首次發(fā)現(xiàn)發(fā)育能力較低的iPSCs的Dlk1-Dio3印記基因表達異常，而具有四倍體發(fā)育能力的細胞 Dlk1-Dio3印記區(qū)的狀態(tài)是正常的[4]。這項工作第一次發(fā)現(xiàn)了區(qū)分不同發(fā)育潛能的 iPSCs的標志，對于我們研究人的多能性干細胞的發(fā)育潛能具有極其重要的參考價值，成為了國際干細胞領(lǐng)域普遍認可的一個標準。iPSCs的誘導(dǎo)效率低下一直是限制iPSCs應(yīng)用的一個重要因素，我國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)維生素C可以顯著提高iPS誘導(dǎo)效率，并通過一系列工作揭示了它是如何通過修飾表觀遺傳狀態(tài)來影響重編程[5-7]。在我國科學(xué)家工作的基礎(chǔ)上，有研究組發(fā)現(xiàn)維生素 C的作用不只限于提高重編程的效率，對于重編程獲得的 iPSCs質(zhì)量也有很大的影響，添加維生素C可以有效地提高iPSCs的發(fā)育能力，維持iPSCs印記的穩(wěn)定[8]，因此，維生素 C對于重編程中的效率和質(zhì)量都是極其重要的。除了維生素C之外還有很多提高重編程效率的小分子相繼被發(fā)現(xiàn)，很多小分子可以在一定程度上替代某些重編程的轉(zhuǎn)錄因子，用小分子來減少或者完全替代轉(zhuǎn)錄因子的使用不但可以提高 iPSCs的安全性，而且對于未來iPSCs的標準化應(yīng)用都是具有極大價值的。雖然很多小分子可以有效提高重編程效率并可以替代某些轉(zhuǎn)錄因子，但是直到2013年，我國科學(xué)家才通過 7個小分子的組合完全替代了轉(zhuǎn)錄因子將小鼠的體細胞誘導(dǎo)成了多能性干細胞，并且形成的多能性干細胞具有較高的發(fā)育能力[9]。同時，該研究組在重編程機制研究中發(fā)現(xiàn)分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子可以替代多能性轉(zhuǎn)錄因子來誘導(dǎo)體細胞重編程，并提出了成體細胞向多能性干細胞轉(zhuǎn)化的分子調(diào)控模型[10]。我國科學(xué)家以誘導(dǎo)多能性干細胞為工具發(fā)現(xiàn)了很多重編程的機制，同時也在以往工作的基礎(chǔ)上進一步發(fā)展了這項技術(shù)，推進了這項技術(shù)盡快走向臨床。

2 轉(zhuǎn)分化

在多能性轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)下體細胞可以重編程為多能性干細胞，而在某些組織特異性的轉(zhuǎn)錄因子的作用下，一種類型的體細胞可以被直接重編程成為另一種類型的體細胞或者成體干細胞，這種技術(shù)被稱為轉(zhuǎn)分化。轉(zhuǎn)分化可以不經(jīng)過多能性干細胞階段而將一種相對豐富易得的細胞轉(zhuǎn)變成為一種相對缺少卻具有重要功能的細胞，這樣就減少了腫瘤發(fā)生的可能性，同時轉(zhuǎn)分化的時間較短，對于急需細胞移植的病人來說可能是一種新的選擇。轉(zhuǎn)分化最早的研究源于2002年，科學(xué)家利用MyoD將成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為成肌細胞[11]。雖然轉(zhuǎn)分化研究出現(xiàn)較早，但是在誘導(dǎo)多能性干細胞出現(xiàn)之前這項技術(shù)發(fā)展緩慢，在 iPSCs出現(xiàn)之后，轉(zhuǎn)分化研究才重新成為了大家關(guān)注的重點，各種類型的轉(zhuǎn)分化研究如雨后春筍一般出現(xiàn)，其中就有很多我國科學(xué)家的貢獻。我國科學(xué)家首先建立了神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)分化的技術(shù)體系，成功將中胚層的睪丸支持細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細胞，并且這種神經(jīng)干細胞在體內(nèi)和體外可以分化為多種類型的神經(jīng)細胞[12]，神經(jīng)干細胞相對于神經(jīng)元來說具有增殖能力和多向分化潛能，因此在臨床應(yīng)用中可能具有更重要的價值。我國科學(xué)家在世界上率先將小鼠的成纖維細胞誘導(dǎo)成為了肝細胞，更加重要的是這種肝細胞移植到肝病小鼠體內(nèi)之后可以挽救肝病小鼠的生命[13]，這說明轉(zhuǎn)分化獲得的肝細胞在移植之后可以發(fā)揮正常肝細胞的部分或者全部功能，這為未來轉(zhuǎn)分化的臨床應(yīng)用提供了重要的參考。同樣是肝細胞轉(zhuǎn)分化，我國科學(xué)家在后續(xù)的研究中成功通過轉(zhuǎn)分化獲得了肝前體細胞，以及人的肝樣細胞[14-16]。但是，轉(zhuǎn)分化與誘導(dǎo)多能性干細胞一樣，需要借助于外源的轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)細胞的命運轉(zhuǎn)換，而外源基因的導(dǎo)入也給轉(zhuǎn)分化獲得細胞的安全性帶來了潛在威脅，為了解決這一問題，我國科學(xué)家通過 3個小分子化合物的組合結(jié)合低氧條件成功將小鼠以及人的體細胞轉(zhuǎn)分化成為神經(jīng)前體細胞[17]，這就有效地提高了轉(zhuǎn)分化獲得細胞的安全性，為提高轉(zhuǎn)分化研究的安全性提供了重要參考。我國科學(xué)家在轉(zhuǎn)分化方面的貢獻對于整個轉(zhuǎn)分化領(lǐng)域的前進起到了不可替代的推進作用，為轉(zhuǎn)分化的臨床前研究提供了重要參考。

3 成體干細胞與生物材料

成體干細胞是指在已經(jīng)分化的組織中存在的具有自我更新和多能性的一類細胞，與胚胎干細胞相比具有來源廣泛、免疫排斥反應(yīng)弱、致瘤風(fēng)險低、倫理學(xué)爭議較少等優(yōu)勢，給再生醫(yī)學(xué)帶來了巨大的希望。在細胞治療領(lǐng)域，成體干細胞有著良好的應(yīng)用前景，目前應(yīng)用較成熟的成體干細胞包括造血干細胞和間充質(zhì)干細胞 (Mesenchymal Stem Cells, MSCs) 等，由于造血干細胞體外擴增的局限性，近年來 MSCs在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中得到更多的關(guān)注。MSCs存在于多種組織中，并且在組織的損傷修復(fù)中起重要作用[18]。雖然 MSCs沒有胚胎干細胞分化潛能高，但 MSCs具有其獨特的優(yōu)勢。第一，MSCs沒有倫理因素的限制，可進行自體或異體的移植；第二，MSCs來源廣泛，幾乎所有組織內(nèi)都有間充質(zhì)干細胞，并且取材時對機體損傷小，研究人員已經(jīng)從多個物種的多種組織中分離得到MSCs[19]；第三，MSCs具有強大的自分泌和旁分泌功能，可以分泌大量生物活性物質(zhì)，在組織修復(fù)中起到營養(yǎng)支持和免疫調(diào)節(jié)作用[20]。MSCs具有的這些優(yōu)勢為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。因此，對 MSCs開展全面深入的基礎(chǔ)研究和臨床前的疾病動物模型研究十分必要。干細胞臨床治療是否會引起免疫排斥反應(yīng)是最為重要的問題，我國科學(xué)家對間充質(zhì)干細胞與免疫系統(tǒng)的相互作用進行了系統(tǒng)的研究工作，闡明了間充質(zhì)干細胞對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制，為間充質(zhì)干細胞的臨床應(yīng)用鋪平了道路[21-22]。在此之后，MSCs在臨床應(yīng)用上已經(jīng)取得了一些成績，我國科學(xué)家已經(jīng)開展利用間充質(zhì)干細胞治療移植物抗宿主病 (GVHD)、再生障礙性貧血 (AA)、關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病的研究[23-24]。除自身免疫疾病之外，也有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可以跨胚層分化，具有向內(nèi)胚層和外胚層分化的能力。我國科學(xué)家利用間充質(zhì)干細胞治療上皮損傷、肺纖維化、腦癱、老年癡呆、糖尿病、心血管疾病、肝臟疾病、燒傷和神經(jīng)損傷等疾病[25](http://clinicaltrials.gov/)。其中已經(jīng)有一些 MSC的臨床實驗在進行中，如用 MSCs治療Ⅰ型糖尿病已進入Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗 (www.ClinicalTrials.gov (NCT00690066、NCT01068951))。

單獨的細胞移植存在組織內(nèi)細胞活性降低、流失、擴散等問題，較難達到預(yù)期的治療效果。隨著生物材料的發(fā)展，起初我國科學(xué)家用小分子 (如bFGF、VEGF) 與生物材料結(jié)合在動物疾病模型中，取得了很好的治療效果[26-27]，之后人們開始將干細胞與生物材料相結(jié)合，我國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)將間充質(zhì)干細胞或小鼠胚胎干細胞與生物材料結(jié)合進行 3D培養(yǎng)時干細胞的多能性優(yōu)于2D環(huán)境中的細胞[28-29]，之后我國科學(xué)家又嘗試了許多干細胞與生物材料相結(jié)合的實驗。例如，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所將MSCs與膠原材料結(jié)合移植入腦損傷模型的大鼠中，發(fā)現(xiàn)結(jié)合材料后細胞能更長久地在組織中發(fā)揮更好的修復(fù)作用[30]。但是，當(dāng)細胞與材料結(jié)合時，細胞將面臨一種新的環(huán)境，而材料本身的性質(zhì)對細胞有著各種的影響，如pH、導(dǎo)電性、壓力和一些其他的刺激作用[31]。因此，找尋一種與生理環(huán)境最接近、最安全的生物材料，是目前生物材料界所共同努力的方向?？傊?，我國科學(xué)家在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域占據(jù)了舉足輕重的地位，推動了間充質(zhì)干細胞在臨床上的應(yīng)用，相信在不久的將來，我們的科學(xué)家定能更加成熟地運用成體干細胞治療各種疾病。

4 單倍體干細胞

單倍體細胞只有一套染色體，沒有等位基因的存在，因此它們在遺傳篩選、基因功能研究中具有重要的價值。單倍體在低等生物細菌和真菌中普遍存在，但是在哺乳動物中單倍體只存在于雌雄配子中，而雌雄配子不能在體外長期培養(yǎng)因而限制了它們在遺傳篩選方面的應(yīng)用。在小鼠胚胎干細胞成功建系之后，科學(xué)家一直在嘗試建立小鼠或者其他物種的單倍體干細胞，但是一直沒有取得成功。直到2011年，英國科學(xué)家通過持續(xù)流式分選的方式才獲得了可以穩(wěn)定傳代的小鼠單倍體干細胞，并且這些單倍體細胞具有多能性，體內(nèi)體外可以分化為各個胚層的組織[32]。但是這些工作中建立的單倍體干細胞都是孤雌單倍體干細胞，那么小鼠孤雄單倍體是否可以用類似的方式建立起來呢？我國科學(xué)家通過顯微操作的方式移除了卵細胞的細胞核而將精子注射到卵細胞之后成功建系獲得了孤雄來源的小鼠單倍體干細胞，并且非常有意思的是這些單倍體干細胞可以替代精子而使卵細胞受精并發(fā)育成為到期存活的小鼠[33-34]，因此這些孤雄單倍體干細胞不光在遺傳篩選上有明顯的優(yōu)勢，而且可以替代精子迅速得到轉(zhuǎn)基因動物。我國科學(xué)家在掌握了單倍體建系和培養(yǎng)的技術(shù)之后，迅速將這項技術(shù)應(yīng)用到了其他物種上，相繼建立了食蟹猴孤雌單倍體干細胞、大鼠孤雌和孤雄單倍體干細胞，并且證明這些單倍體在進行遺傳篩選方面確實有巨大的優(yōu)勢[35-36]，這些工作大大拓展了單倍體干細胞的應(yīng)用范圍，推動了這個領(lǐng)域的快速前進。單倍體干細胞作為一個新興的領(lǐng)域還存在大量未被解決的問題，我國科學(xué)家肯定會在這一領(lǐng)域中作出更多更大的貢獻。

5 基因修飾動物模型與基因治療

新的基因工具的開發(fā)對于基因功能的研究以及疾病的再生醫(yī)學(xué)治療來說都具有重要的意義。近些年，新發(fā)展起來的基因編輯技術(shù)包括鋅指酶、TALENs和 CRISPR/Cas，其中CRISPR/Cas技術(shù)因其高效、設(shè)計簡單、易于操作等優(yōu)點已經(jīng)開始替代其他的基因編輯工具，成為現(xiàn)在基因操作的新寵兒[37]。CRISPR/Cas本身是一種防御系統(tǒng)，能夠保護細菌和古生菌免受病毒的侵害。將CRISPR/Cas應(yīng)用于非細菌細胞中需要滿足兩個條件，一個是 Cas酶負責(zé)切割基因組的特定位置，另一個是導(dǎo)向 RNA(gRNA) 負責(zé)識別基因組中的特定位置。2013年，科學(xué)家將這一系統(tǒng)應(yīng)用于哺乳動物的基因組中，成功實現(xiàn)了CRISPR/Cas在哺乳動物中的應(yīng)用[38-39]。我國科學(xué)家在世界上率先通過原核注射的mRNA到大鼠受精卵中，成功實現(xiàn)了大鼠中的多基因敲除[40]。我國科學(xué)家還將這項技術(shù)成功應(yīng)用到了白內(nèi)障小鼠的治療，在受精卵的時候注射 CRISPR/Cas9修復(fù)了小鼠白內(nèi)障相關(guān)基因Crygc的突變，讓小鼠成功獲得了正常的視力[41]。2014年，我國科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因猴子和豬模型的工作又發(fā)表在 Cell等刊物[42-43]，這是世界上首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得的靈長類動物和大型經(jīng)濟動物基因修飾的模型，在國際同行中引起較大轟動。CRISPR/Cas9可以在細胞上實現(xiàn)高效的基因打靶，因此，未來結(jié)合 CRISPR/Cas9來修復(fù)病人 iPSCs再進行細胞的分化和移植必將推動iPSCs的再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

除了在以上這些方面如DNA去甲基化的機制研究，將成體干細胞與生物材料結(jié)合應(yīng)用治療不孕癥等等?？傊?，我國干細胞研究已經(jīng)成為國際干細胞研究中一股無可替代的力量，并且必將發(fā)揮越來越重要的作用。

6 未來展望

干細胞技術(shù)經(jīng)過幾十年的發(fā)展，其在技術(shù)體系上不斷出現(xiàn)突破和創(chuàng)新，特別是近些年誘導(dǎo)多能性干細胞技術(shù)的出現(xiàn)更為干細胞的基礎(chǔ)研究應(yīng)用和臨床疾病治療插上了翅膀。來自于多種遺傳性疾病 (如早衰，鐮刀形細胞貧血癥和精神分裂癥等) 的病人的 iPSCs在體外分化后可以很好地模擬這些疾病的發(fā)生過程[44-46]，使科學(xué)家可以在體外觀察到這些疾病發(fā)生的完整過程，這就為深入了解這些疾病的發(fā)病機制，開發(fā)相應(yīng)的治療性藥物提供了很好的參考。這方面的工作現(xiàn)在受到大家越來越多的關(guān)注，還有很多未知原因的復(fù)雜疾病可以通過疾病特異的 iPSCs去探究其病因和治療方案，因此，利用疾病特異的 iPSCs去研究疾病的機制會持續(xù)受到大家的關(guān)注。iPSCs技術(shù)之所以受到如此關(guān)注的一個重要原因是大家希望有一天可以利用這項技術(shù)去治療人類的疾病，iPSCs可以作為一種種子細胞被應(yīng)用到再生醫(yī)學(xué)治療。

如今干細胞研究已經(jīng)進入由基礎(chǔ)實驗研究向臨床治療轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵階段。2011年，美國食品藥品監(jiān)督局 (Food and Drug Administration,FDA) 批準了 Geron公司利用少突膠質(zhì)細胞治療急性脊髓損傷的 GRNOPC1Ⅰ期臨床試驗；2012年，加拿大衛(wèi)生部 (Health Canada) 批準了Osiris生產(chǎn)的干細胞藥物的上市銷售；目前臨床研究已經(jīng)表明 hESCs分化來的 RPE細胞能安全有效地治療AMD患者，并且18個移植患者中有13個得到了視力改善[47-48]，2013年，日本厚生勞動省的審查委員會批準了利用 iPSCs開展視網(wǎng)膜再生的臨床研究。但是，目前美國國立衛(wèi)生研究院 (National Institutes of Health,NIH) 登記的細胞系絕大部分由于未嚴格滿足臨床要求而不能應(yīng)用于臨床[49]。所以干細胞的使用需要經(jīng)過嚴格的檢驗流程，首先，任何干細胞研究的開展都需要獲得倫理委員會的批準，干細胞需來源明確，應(yīng)用于臨床前的整個培養(yǎng)過程中應(yīng)在臨床級別的條件下進行，并定期進行內(nèi)毒素、支原體和人源和動物源性的病毒等各項安全性檢測，確保干細胞的高純度、無污染、無致瘤性，并通過國家相關(guān)部門的復(fù)核后才能運用于臨床試驗。同時，由于需要修復(fù)某些遺傳性疾病的相關(guān)的基因變異，發(fā)展更加安全高效的基因編輯方式也是急需的，大力發(fā)展有關(guān) iPSCs安全性和有效性的研究必將對再生醫(yī)學(xué)治療產(chǎn)生積極的影響。

多能性干細胞治療并不是再生醫(yī)學(xué)治療的唯一選擇，很多重要的功能細胞已經(jīng)通過轉(zhuǎn)分化的方式獲得，并且這些細胞在體內(nèi)外都能夠發(fā)揮正常的功能，因此，利用轉(zhuǎn)分化得到更多的功能性細胞也是再生醫(yī)學(xué)治療的一項重要選擇。同時體內(nèi)轉(zhuǎn)分化研究獲得的細胞證明比體外獲得的細胞具有更好的功能，同時這種細胞也更容易和體內(nèi)其他細胞建立聯(lián)系[50-52]，但是體內(nèi)轉(zhuǎn)分化面臨效率低下，實驗體系不完善，并且體內(nèi)定向?qū)牖虮容^困難等問題。因此，如果可以解決這些問題，那么轉(zhuǎn)分化研究一定會為很多急于進行細胞移植治療的病人帶來福音。

但是與國際先進水平相比，我國在干細胞的基礎(chǔ)研究方面依然很薄弱，而這一方面也恰恰是現(xiàn)在國際干細胞領(lǐng)域中競爭最激烈的。像重編程機制的深入探索，干細胞多能性維持網(wǎng)絡(luò)的完善以及干細胞多向分化能力的挖掘這些方向?qū)⒃谙喈?dāng)長的時間內(nèi)持續(xù)成為干細胞領(lǐng)域的研究熱點，如果我國能夠?qū)Ω杉毎I(lǐng)域持續(xù)加大投入，我國必然會在未來干細胞基礎(chǔ)研究方向上取得更大的突破。

綜上所述，干細胞研究是當(dāng)前國際生命科學(xué)競爭的熱點，對我國廣大人民的再生醫(yī)學(xué)治療和提升我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的競爭力都具有重要意義。目前國際干細胞研究處于發(fā)展的早期階段，我國面臨著空前的機遇，并且也已經(jīng)取得了很多重要的成果。但是面對國際干細胞領(lǐng)域的激烈競爭，我國也面臨著空前的挑戰(zhàn)，需要加快發(fā)展的步伐，使我國在這一領(lǐng)域獲得更多的話語權(quán)，同時推動干細胞盡快進入臨床。為了使我國干細胞臨床應(yīng)用更具規(guī)范性和合理性，我國政府部門也相繼制定了干細胞管理制度 (《干細胞臨床試驗研究管理辦法》(試行)、《干細胞臨床試驗研究基地管理辦法》(試行)、《干細胞制劑質(zhì)量控制和臨床前研究指導(dǎo)原則》(試行))征求意見稿。我們相信在不久的將來，隨著具體政策的出臺，我國干細胞的臨床應(yīng)用會走上一個全新的時代，為廣大人民的健康事業(yè)作出貢獻。

[1] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006,126(4): 663–676.

[2] Zhao XY, Li W, Lü Z, et al. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature,2009, 461(7260): 86–90.

[3] Kang L, Wang JL, Zhang Y, et al. iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos. Cell Stem Cell,2009, 5(2): 135–138.

[4] Liu L, Luo GZ, Yang W, et al. Activation of the imprinted Dlk1-Dio3 region correlates with pluripotency levels of mouse stem cells. J Biol Chem,2010, 285(25): 19483–19490.

[5] Esteban MA, Wang T, Qin BM, et al. Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2010,6(1): 71–79.

[6] Wang T, Chen KS, Zeng XM, et al. The histone demethylases Jhdm1a/1b enhance somatic cell reprogramming in a vitamin-C-dependent manner.Cell Stem Cell, 2011, 9(6): 575–587.

[7] Chen JK, Guo L, Zhang L, et al. Vitamin C modulates TET1 function during somatic cell reprogramming. Nat Genet, 2013, 45(12):1504–1509.

[8] Stadtfeld M, Apostolou E, Ferrari F, et al. Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. Nat Genet, 2012,44(4): 398–405, S1–S2.

[9] Hou PP, Li YQ, Zhang X, et al. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science, 2013,341(6146): 651–654.

[10] Shu J, Wu C, Wu YT, et al. Induction of pluripotency in mouse somatic cells with lineage specifiers. Cell, 2013, 153(5): 963–975.

[11] Etzion S, Barbash IM, Feinberg MS, et al. Cellular cardiomyoplasty of cardiac fibroblasts by adenoviral delivery of MyoD ex vivo: an unlimited source of cells for myocardial repair. Circulation, 2002,106(12 Suppl 1): I125–I130.

[12] Sheng C, Zheng QY, Wu JY, et al. Direct reprogramming of Sertoli cells into multipotent neural stem cells by defined factors. Cell Res, 2012,22(1): 208–218.

[13] Huang PY, He ZY, Ji SY, et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature, 2011,475(7356): 386–389.

[14] Yu B, He ZY, You P, et al. Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors. Cell Stem Cell, 2013, 13(3): 328–340.

[15] Huang PY, Zhang LD, Gao YM, et al. Direct reprogramming of human fibroblasts to functional and expandable hepatocytes. Cell Stem Cell, 2014,14(3): 370–384.

[16] Du YY, Wang JL, Jia J, et al. Human hepatocytes with drug metabolic function induced from fibroblasts by lineage reprogramming. Cell Stem Cell, 2014, 14(3): 394–403.

[17] Cheng L, Hu WX, Qiu BL, et al. Generation of neural progenitor cells by chemical cocktails and hypoxia. Cell Res, 2014, 24(6): 665–679.

[18] Wu L, Cai XX, Zhang S, et al. Regeneration of articular cartilage by adipose tissue derived mesenchymal stem cells: perspectives from stem cell biology and molecular medicine. J Cell Physiol,2013, 228(5): 938–944.

[19] Keating A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell, 2012, 10(6): 709–716.

[20] Miller RH, Bai L, Lennon DP, et al. The potential of mesenchymal stem cells for neural repair. Discov Med, 2010, 9(46): 236–242.

[21] Xu GW, Zhang YY, Zhang LY, et al. The role of IL-6 in inhibition of lymphocyte apoptosis by mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 361(3): 745–750.

[22] Xu GW, Zhang LY, Ren GW, et al.Immunosuppressive properties of cloned bone marrow mesenchymal stem cells. Cell Res, 2007,17(3): 240–248.

[23] Park D, Yang G, Bae DK, et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve cognitive function and physical activity in ageing mice. J Neurosci Res, 2013, 91(5): 660–670.

[24] Sun LY, Akiyama K, Zhang HY, et al. Mesenchymal stem cell transplantation reverses multiorgan dysfunction in systemic lupus erythematosus mice and humans. Stem Cells, 2009, 27(6): 1421–1432.

[25] Shen Q, Chen B, Xiao Z, et al. Paracrine factors from mesenchymal stem cells attenuate epithelial injury and lung fibrosis. Mol Med Rep, 2015, 11(4):2831–2837.

[26] Shi Q, Gao W, Han XL, et al. Collagen scaffolds modified with collagen-binding bFGF promotes the neural regeneration in a rat hemisected spinal cord injury model. Sci China Life Sci, 2014, 57(2):232–240.

[27] Lin NC, Li XA, Song TR, et al. The effect of collagen-binding vascular endothelial growth factor on the remodeling of scarred rat uterus following full-thickness injury. Biomaterials, 2012, 33(6):1801–1807.

[28] Han SF, Zhao YN, Xiao ZF, et al. The three-dimensional collagen scaffold improves the stemness of rat bone marrow mesenchymal stem cells. J Genet Genomics, 2012, 39(12): 633–641.

[29] Wei JS, Han J, Zhao YN, et al. The importance of three-dimensional scaffold structure on stemness maintenance of mouse embryonic stem cells.Biomaterials, 2014, 35(27): 7724–7733.

[30] Guan J, Zhu ZH, Zhao RC, et al. Transplantation of human mesenchymal stem cells loaded on collagen scaffolds for the treatment of traumatic brain injury in rats. Biomaterials, 2013, 34(24): 5937–5946.

[31] Higuchi A, Ling QD, Chang Y, et al. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate.Chem Rev, 2013, 113(5): 3297–3328.

[32] Leeb M, Wutz A. Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos. Nature, 2011,479(7371): 131–134.

[33] Yang H, Shi LY, Wang BA, et al. Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell,2012, 149(3): 605–617.

[34] Li W, Shuai L, Wan HF, et al. Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.Nature, 2012, 490(7420): 407–411.

[35] Yang H, Liu Z, Ma Y, et al. Generation of haploid embryonic stem cells from Macaca fascicularis monkey parthenotes. Cell Res, 2013, 23(10):1187–1200.

[36] Li W, Li X, Li TD, et al. Genetic modification and screening in rat using haploid embryonic stem cells.Cell Stem Cell, 2014, 14(3): 404–414.

[37] Doudna JA, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science,2014, 346(6213): 1258096.

[38] Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science,2013, 339(6121): 819–823.

[39] Mali P, Yang LH, Esvelt KM, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013,339(6121): 823–826.

[40] Li W, Teng F, Li TD, et al. Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 684–686.

[41] Wu YX, Liang D, Wang YH, et al. Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9.Cell Stem Cell, 2013, 13(6): 659–662.

[42] Niu YY, Shen B, Cui YQ, et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell, 2014, 156(4): 836–843.

[43] Hai T, Teng F, Guo RF, et al. One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system. Cell Res, 2014, 24(3): 372–375.

[44] Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, et al. Recapitulation of premature ageing with iPSCs from Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Nature,2011, 472(7342): 221–225.

[45] Hanna J, Wernig M, Markoulaki S, et al. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science, 2007,318(5858): 1920–1923.

[46] Brennand KJ, Simone A, Jou J, et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature, 2011, 473(7346): 221–225.

[47] Schwartz SD, Hubschman JP, Heiwell G, et al.Embryonic stem cell trials for macular degeneration:a preliminary report. Lancet, 2012, 379(9817):713–720.

[48] Schwartz SD, Regillo CD, Lam BL, et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy:follow-up of two open-label phase 1/2 studies.Lancet, 2015, 385(9967): 509–516.

[49] Jonlin EC. Differing standards for the NIH Stem Cell Registry and FDA approval render most federally funded hESC lines unsuitable for clinical use. Cell Stem Cell, 2014, 14(2): 139–140.

[50] Rouaux C, Arlotta P. Direct lineage reprogramming of post-mitotic callosal neurons into corticofugal neurons in vivo. Nat Cell Biol, 2013, 15(2):214–221.

[51] Qian L, Huang Y, Spencer CI, et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature, 2012, 485(7400):593–598.

[52] Zhou Q, Brown J, Kanarek A, et al. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature, 2008, 455(7213): 627–632.