中國“合成生物學(xué)”973項(xiàng)目研究進(jìn)展

陳國強(qiáng)，王穎

“合成生物學(xué)”這門工程和科學(xué)結(jié)合的新學(xué)科在近年來得到各國的關(guān)注和大量的投資。帶著未來對(duì)重塑生命和改造生命的憧憬，各個(gè)學(xué)科包括生命、工程、計(jì)算機(jī)甚至機(jī)械制造等，都投入了設(shè)計(jì)生命和合成生命的研究行列中。

合成生物學(xué)是指按照一定的規(guī)律和已有的知識(shí)，一方面設(shè)計(jì)和建造新的生物零件、裝置和系統(tǒng)；另一方面重新設(shè)計(jì)已有的天然生物系統(tǒng)為人類的特殊目的服務(wù)。簡單地說, 合成生物學(xué)就是通過人工設(shè)計(jì)和構(gòu)建自然界中不存在的生物系統(tǒng)來解決能源、材料、健康和環(huán)保等問題。合成生物學(xué)強(qiáng)調(diào)“設(shè)計(jì)”和“重設(shè)計(jì)”。設(shè)計(jì)、模擬、實(shí)驗(yàn)是合成生物學(xué)的基礎(chǔ)。合成生物學(xué)不僅僅是實(shí)驗(yàn)，利用已有的生物學(xué)知識(shí)，根據(jù)實(shí)際的需要進(jìn)行設(shè)計(jì)和重設(shè)計(jì)，建立數(shù)學(xué)模型對(duì)人工的設(shè)計(jì)進(jìn)行模擬從而指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行也是合成生物學(xué)的方法。合成生物學(xué)的核心問題之一是“新生命的合成”。通過新生命的合成擴(kuò)大生命的能力，更好地為人類服務(wù)。

我國是制造業(yè)大國，所以，自2011年科技部開始對(duì)“合成生物學(xué)”進(jìn)行支持，包括973項(xiàng)目10項(xiàng)和863項(xiàng)目一項(xiàng)。我國主要支持了與制造業(yè)“工業(yè)生物技術(shù)”相關(guān)的“合成生物學(xué)”研究 7項(xiàng)，主要以容易改造的微生物為研究對(duì)象。同時(shí)，也開始支持了一項(xiàng)以哺乳細(xì)胞為對(duì)象的合成生物學(xué)，以及一項(xiàng)植物的“合成生物學(xué)”。下面對(duì)上述科技部支持的項(xiàng)目的研究進(jìn)展進(jìn)行回顧。

1 “人工合成細(xì)胞工廠”研究的主要進(jìn)展

圖1 人工合成細(xì)胞工廠973項(xiàng)目框架Fig. 1 Framework of 973 project on artificial cell factories. The project consists of constructions of E. coli chassis with simplified chromosome, phototrophic chassis cells with reduced chromosomes, and novel bulk chemicals biosynthesis pathways. The project should allow productions of bulk materials and chemicals from sugars or CO2.

以中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所馬延和為首席的“人工合成細(xì)胞工廠”973項(xiàng)目，以人工合成生物體的工業(yè)應(yīng)用為目標(biāo)，集中研究解決底盤細(xì)胞與化學(xué)品合成途徑設(shè)計(jì)與構(gòu)建等方面的關(guān)鍵科學(xué)問題，圍繞大腸桿菌和光合藍(lán)細(xì)菌兩類代表性的底盤細(xì)胞構(gòu)建，以及從 CO2與葡萄糖到化學(xué)品兩類合成途徑的創(chuàng)建，構(gòu)建人工合成細(xì)胞工廠 (圖1)。項(xiàng)目立項(xiàng)近4年來，在底盤細(xì)胞構(gòu)建、化學(xué)品合成的元件設(shè)計(jì)合成、合成途徑創(chuàng)建及合成細(xì)胞工廠構(gòu)建，以及合成生物學(xué)基本技術(shù)開發(fā)方面取得了一系列重要進(jìn)展。進(jìn)一步發(fā)展和完善了基于芯片的基因合成技術(shù)，采用錯(cuò)配特異性內(nèi)切酶和結(jié)合蛋白Muts降低寡核苷酸及組裝的 DNA的錯(cuò)誤率，將芯片合成的寡核苷酸錯(cuò)誤率從1/500 bp降低到1/8 700 bp。同時(shí)實(shí)現(xiàn)了基因的原位擴(kuò)增和組裝，突破了目前需要先合成短片段DNA再拼接的傳統(tǒng)DNA合成模式，大大降低了成本水平[1]。針對(duì)認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)、突破細(xì)胞進(jìn)化限制、實(shí)現(xiàn)人工生命體構(gòu)建的需要，通過大腸桿菌基因組必需基因的分析，重構(gòu)了模塊化、成簇化“必需基因功能群”；在建立途徑模擬計(jì)算設(shè)計(jì)技術(shù)的基礎(chǔ)上[2]，設(shè)計(jì)合成人工糖酵解途徑，增加細(xì)胞生長10%，加快葡萄糖消耗速度達(dá)20%，為“糖酵解高速公路”構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。建立了新的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法，可成功實(shí)現(xiàn)給定目標(biāo)結(jié)構(gòu)的蛋白全序列從頭設(shè)計(jì)[3]，基于化學(xué)反應(yīng)特征和胞內(nèi)調(diào)控位點(diǎn)，計(jì)算設(shè)計(jì)與合成表征了滿足30種重要化學(xué)品生物合成的功能元件，形成了約1 200個(gè)功能特性清晰的元件庫，為化學(xué)品合成途徑和高效人工合成細(xì)胞工廠創(chuàng)建奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)功能元件[4]。利用DNA組裝和精確表達(dá)調(diào)控技術(shù)[5]，創(chuàng)建和優(yōu)化了從葡萄糖到丁二酸、戊二胺、己二酸和 5-氨基乙酰丙酸等途徑，達(dá)到預(yù)期原子經(jīng)濟(jì)性，其中5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量達(dá)到50 g/L，比國際水平高5倍，丁二酸產(chǎn)量達(dá)到125 g/L，產(chǎn)物對(duì)底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為105% (可部分固定 CO2)[6]，技術(shù)指標(biāo)處于國際領(lǐng)先水平。在對(duì)光合藍(lán)細(xì)菌底盤細(xì)胞的生理調(diào)控機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究和形成較為完整的理解和認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一系列獲得抗逆性能提高的光合藍(lán)細(xì)菌底盤細(xì)胞[7]，通過光合模塊、CO2固定和生物合成模塊的重構(gòu)和優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了從 CO2生物合成酮、醇和酸等典型化學(xué)品，為發(fā)展和利用新的碳資源提供了可能，其中丙酮、D-乳酸和 3-羥基丁酸均為國際上首次報(bào)道[8-9]。

2 “新功能人造生物器件的構(gòu)建及集成”研究的主要進(jìn)展

以中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院趙國屏為首席的 973項(xiàng)目圍繞新功能人造生物器件的設(shè)計(jì)原理、合成組裝、模塊構(gòu)建、標(biāo)準(zhǔn)化建庫及在底盤細(xì)胞中集成與適配機(jī)制等關(guān)鍵科學(xué)問題和相關(guān)技術(shù)難點(diǎn)，以萜類化合物的人工異源合成為主要研究對(duì)象，取得了若干重要進(jìn)展。尤其是在稀有人參皂苷CK[10](圖2)、甜菊糖苷和丹參酮前體鐵銹醇[11]等重要藥用食用萜類化合物的器件挖掘、集成及異源合成方面取得重要突破。此外，在元件模塊的挖掘[12-13]與合成技術(shù)創(chuàng)新 (MASTER ligation方法)[14]等方面，亦取得顯著進(jìn)展。

人參皂苷CK具有抗癌、保肝、抗炎癥和治療糖尿病等生理活性，但在人參中從未被檢測到，歷來依靠微生物來源的糖基水解酶體外制備。中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周志華課題組發(fā)現(xiàn)并鑒定了 1個(gè)來源于人參的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，構(gòu)建了可以生產(chǎn)“非天然人參皂苷”的酵母細(xì)胞工廠，實(shí)現(xiàn)了從單糖到稀有人參皂苷 CK的從頭全合成，發(fā)現(xiàn)人參體內(nèi)可能合成CK的兩條并行代謝途徑 (圖2)。

圖2 重組酵母細(xì)胞工廠中人參皂苷CK (A) 和次丹參酮二烯及鐵銹醇 (B) 的合成Fig. 2 Synthese of ginsenoside compound CK (A), miltiradiene and ferruginol (B) by recombinant yeast cell factories.

丹參酮為傳統(tǒng)藥用植物丹參的萜類活性產(chǎn)物。中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所趙宗保課題組以釀酒酵母為宿主，采用模塊途徑工程策略，組裝二萜前體合成、次丹參酮二烯合成和細(xì)胞色素P450氧化的模塊 (CYP76AH1)，優(yōu)化模塊內(nèi)部各元件間的適配性，構(gòu)建了次丹參酮二烯和鐵銹醇人工合成細(xì)胞工廠，產(chǎn)量分別達(dá)到360 mg/L和40 mg/L，對(duì)丹參酮及其他植物源萜類化合物的微生物制造具有重要參考價(jià)值。

3 “微生物藥物創(chuàng)新與優(yōu)產(chǎn)的人工合成體系”研究的主要進(jìn)展

上海交通大學(xué)的馮雁作為 973項(xiàng)目的首席科學(xué)家，通過工程化的系統(tǒng)設(shè)計(jì)、用標(biāo)準(zhǔn)化和模塊化的元素來構(gòu)建人工合成生物體系，高效地建立和完善微生物藥物創(chuàng)新和優(yōu)產(chǎn)的新模式、推動(dòng)微生物藥物產(chǎn)業(yè)的跨越式提升和發(fā)展。

武漢大學(xué)胡黔楠研究組構(gòu)建了逆向設(shè)計(jì)微生物藥物合成的平臺(tái)。他們重組了具有化學(xué)轉(zhuǎn)化意義和基于代謝途徑的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)，從40 000多篇生物合成文獻(xiàn)中有效整合了超過30 000多條的生物合成反應(yīng)數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)了生物合成反應(yīng)關(guān)鍵反應(yīng)模式提取的技術(shù)rxnpatter；開發(fā)了基于生物合成反應(yīng)結(jié)構(gòu)的催化該反應(yīng)類型的生物合成酶的在線預(yù)測服務(wù)器ECAssigner；構(gòu)建了“生物合成反應(yīng)數(shù)據(jù)庫——生物合成轉(zhuǎn)換規(guī)律——生物合成途徑設(shè)計(jì)——生物合成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證”的技術(shù)體系Rxnip[15-17](圖3)。該數(shù)據(jù)庫受到國際上的廣泛關(guān)注，被Elsevier公司的SciVerse收錄。該工具不僅可用于微生物藥物的合成，并且在平臺(tái)化學(xué)品、生物材料等化合物的人工合成體系構(gòu)建中也具有重要的應(yīng)用潛力。

催化元件的系統(tǒng)匹配與優(yōu)化是實(shí)現(xiàn)人工代謝途徑高效運(yùn)行的基礎(chǔ)。由于傳統(tǒng)代謝工程策略缺少相應(yīng)途徑的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以及對(duì)所研究代謝途徑的認(rèn)識(shí)不夠充分，很難去建立一個(gè)通用、高效的系統(tǒng)，這也影響了構(gòu)建人工合成生物體系的效率。應(yīng)用“定向代謝工程”技術(shù)，即基于催化體系體外重建的合成途徑快速優(yōu)化的體系，通過系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析，快速獲取了所研究代謝途徑中各個(gè)組分的貢獻(xiàn)，進(jìn)而指導(dǎo)體內(nèi)定向改造工作 (圖 4)。應(yīng)用這套體系對(duì)多種微生物藥物的關(guān)鍵合成途徑中的限速步驟進(jìn)行了確定，在短時(shí)間內(nèi)即極大提高了萜類化合物法尼烯[18]、番茄紅素、胡蘿卜素和蝦青素等產(chǎn)量，體現(xiàn)了該方法的廣闊應(yīng)用潛力，其中番茄紅素已經(jīng)通過150 L中試發(fā)酵放大，發(fā)酵時(shí)間相比傳統(tǒng)的霉菌發(fā)酵縮短為原來的1/5，目前正在進(jìn)行進(jìn)一步工業(yè)放大測試；而且這種方法可以拓展到聚酮類藥物的優(yōu)化和高產(chǎn)中，為聚酮合酶元件的適配機(jī)制的確定和元件的比例優(yōu)化和篩選提供平臺(tái)[19]。

圖3 微生物藥物生物合成的逆向途徑設(shè)計(jì)平臺(tái)Fig. 3 Reverse biosynthesis pathway design platform for microbial pharmaceutics. It involves extraction of bioinformatics from antibiotics producing Streptomycetes,developments of models for biosynthesis and transformation, reverse design of biosynthesis pathways from secondary metabolic products et al.

4 “用合成生物學(xué)方法構(gòu)建生物基材料的合成新途徑”研究的主要進(jìn)展

清華大學(xué)陳國強(qiáng)為首席的 973項(xiàng)目采用化學(xué)與生物結(jié)合的方法設(shè)計(jì)、合成和組裝各種生物基材料聚羥基脂肪酸酯PHA的合成路徑，通過合成生物學(xué)雙穩(wěn)態(tài)調(diào)控的方法改變了微生物的生長模式，并獲得了有復(fù)合功能的微生物合成體系，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌基因組減少10%的目標(biāo)，使微生物達(dá)到生長快速、體積大、生物基材料結(jié)構(gòu)豐富的新特點(diǎn)[20]。他們通過網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化、最小基因組等設(shè)計(jì)了至少 3條新的多基因合成路徑，并驗(yàn)證了其正確性。獲得至少兩個(gè)新的生物基材料[21]。在更大規(guī)模 (發(fā)酵罐上) 實(shí)現(xiàn)了微生物生長狀態(tài)的變化，使下游處理簡單化[22]。此外，他們建立了嗜鹽單胞菌的遺傳操作平臺(tái)，并開發(fā)了其在人工模擬海水中、利用成分近似餐廚垃圾的混合底物實(shí)現(xiàn)連續(xù)無滅菌發(fā)酵的發(fā)酵工藝，降低了生產(chǎn)成本[23]。目前該項(xiàng)目已經(jīng)建立

了嗜鹽微生物的合成生物學(xué)研究體系。該體系通過合成生物學(xué)手段，構(gòu)建了制造各種化學(xué)品的平臺(tái)[24]，包括 5-氨基乙酰丙酸、維生素 B12和 3-羥基丙酸等。該嗜鹽細(xì)菌生物制造平臺(tái)具有如下特點(diǎn)，克服了一般生物制造的缺點(diǎn)，使生物制造成本能大幅降低，包括：1) 節(jié)能：發(fā)酵過程無需高溫高壓滅菌；2) 節(jié)水：可以用海水替代淡水，而且過程產(chǎn)生的水可以多次循環(huán)利用；3) 連續(xù)發(fā)酵制造：由于染菌幾率減少了，生產(chǎn)過程可以連續(xù)起來；4) 過程操作簡單：由于無需滅菌和可連續(xù)的發(fā)酵，簡化了操作過程；5) 設(shè)備投資大幅度減少：由于無需發(fā)酵過程無需高溫高壓滅菌，就不需要使用昂貴的不銹鋼發(fā)酵罐和不銹鋼管道系統(tǒng)，轉(zhuǎn)而使用便宜的塑料、陶瓷甚至水泥罐體或管道等；6) 不與人爭糧：篩選的嗜鹽細(xì)菌可以利用淀粉、蛋白、脂肪、甚至纖維素和脂肪酸等生長，這些都是食物的組成。用餐廚廢料也能使嗜鹽細(xì)菌生長，制造我們所需的產(chǎn)品；7) 產(chǎn)物最終濃度大幅度提高：通過分子操作，使嗜鹽細(xì)菌在高密度情況下仍然能繼續(xù)生長，使產(chǎn)品最終濃度大幅提高；8) 產(chǎn)物純化簡單：通過表達(dá)細(xì)菌分離遏制基因，使細(xì)菌形態(tài)發(fā)生變化，能產(chǎn)生自凝絮作用，使菌體與發(fā)酵液自然分離；9) 一個(gè)菌種，多個(gè)產(chǎn)品：已經(jīng)開發(fā)成功的分子操作技術(shù)，可以通過代謝工程使嗜鹽細(xì)菌生產(chǎn)多種材料、化學(xué)品和燃料；10) 多個(gè)產(chǎn)品，相同的發(fā)酵條件：由于嗜鹽細(xì)菌菌種一樣，發(fā)酵工藝也能保持一致，使工藝開發(fā)簡單化。

圖5 嗜鹽微生物的合成生物學(xué)研究體系 (克服了一般生物制造的缺點(diǎn)，使生物制造成本大幅降低)Fig. 5 Synthetic biology of Halomonas LS21 grown in seawater under unsterile and continuous processes(overcoming the disadvantages of bio-manufacturing including consumptions of fresh water, food based substrates as well as heavy demand on energy for sterilization et al). The whole genome of strain LS21 has been sequenced allowing for many DNA manipulations. The strain produces only a single PHA granule in each cell, making the PHA recovery convenient.

5 “抗逆元器件的構(gòu)建和機(jī)理研究” 研究的主要進(jìn)展

由清華大學(xué)林章凜主持的 973項(xiàng)目研究適配微生物和植物的合成生物學(xué)抗逆元器件 (即元件與模塊)，及其在工業(yè)和農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，以期提升我國龐大生物制造業(yè)的節(jié)能減排，如2 000億元年產(chǎn)值的發(fā)酵產(chǎn)業(yè)菌種的抗酸和抗高溫需求；并儲(chǔ)備高效抗逆農(nóng)業(yè)的戰(zhàn)略技術(shù)，尤其是670多hm22%以及以下鹽堿地的利用。由于產(chǎn)業(yè)和資源特點(diǎn)的不同，歐美國家尚未特別關(guān)注抗逆元器件研究，因此這也是我國參與國際合成生物學(xué)研究競爭的獨(dú)特機(jī)遇。前兩年項(xiàng)目圍繞如下兩個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問題開展工作 (表 1)：1)抗逆元器件構(gòu)建的分子設(shè)計(jì)原理；2) 抗逆元器件在底盤生物的作用機(jī)理。建立了有特色的抗逆元件庫、形成了抗逆器件設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)室評(píng)估能力；提出了利用極端微生物調(diào)控基因的重要科學(xué)思想[25]；發(fā)展了一個(gè)系統(tǒng)的商用微生物抗酸器件逐級(jí)評(píng)估技術(shù) (從實(shí)驗(yàn)室到發(fā)酵工廠)，并在有重要產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值的微生物抗酸器件和植物抗鹽堿器件上取得重要突破，分別通過工業(yè)菌株工廠發(fā)酵的驗(yàn)證和田間試驗(yàn)的驗(yàn)證，大幅度地提前完成了相關(guān)實(shí)施效果的目標(biāo)。

6 “合成微生物體系的適配性研究”研究的主要進(jìn)展

以中國科學(xué)院微生物研究所張立新為首席的973項(xiàng)目，選擇了微生物藥物阿維菌素和polynikA為研究對(duì)象，開展基于生物底盤調(diào)控特性的生物元件表征和設(shè)計(jì)，解決底盤代謝網(wǎng)絡(luò)與其加載的外源生物元件的兼容性問題，突出人工合成的調(diào)控元件對(duì)結(jié)構(gòu)基因定時(shí)、定量表達(dá)的決定性作用[26]。以聚酮類藥物和核苷肽類藥物的合成途徑作為代表性案例，在已建立的技術(shù)平臺(tái)上高通量地分析和解決不同元件之間的適配性問題，構(gòu)建大腸桿菌和鏈霉菌中的適配性研究體系。同時(shí)，對(duì)異源模塊與生物底盤之間交互式作用的計(jì)算與預(yù)測、適配性研究與系統(tǒng)優(yōu)化，深化對(duì)生物功能器件反應(yīng)特性及加載生物元件的底盤代謝網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，借鑒工程學(xué)原理在非生命系統(tǒng)中應(yīng)用的成功經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)考慮生命系統(tǒng)的特殊性，實(shí)現(xiàn)對(duì)合成生物系統(tǒng)的各調(diào)控單元模塊化、標(biāo)準(zhǔn)化，并最終在合成微生物體系中進(jìn)行系統(tǒng)集成，揭示具有非天然新功能的生物元件、器件、模塊，以及更高層次的合成生物系統(tǒng)構(gòu)建過程的新原理和新途徑[27](圖 6)。

表1 抗逆元器件的構(gòu)建和機(jī)理研究創(chuàng)新點(diǎn)Table 1 Construction of stress resistance biobricks and the novelties of the mechanism study

圖6 “合成微生物體系的適配性研究”各課題相互之間的關(guān)系及課題與所需解決科學(xué)問題Fig. 6 Relationship among tasks and scientific problems to be solved by project of “Comaptibility study of synthetic microorganism systems”, including project 1 regulatory and structural parts based on chassis property;project 2 modules of chassis metabolic network and prediction on functions of parts; project 3 optimized compatibility of hetereogeous modules to chassis and optimization of modular compatibility; project 4 assembly of synthetic microorganism system.

本項(xiàng)目全面解析了模式鏈霉菌基因轉(zhuǎn)錄時(shí)序[28-30]，得到了組成型和時(shí)序型啟動(dòng)子庫，并改造獲得了目前鏈霉菌中最強(qiáng)的啟動(dòng)子；建立基于流式細(xì)胞儀的鏈霉菌單細(xì)胞啟動(dòng)子表征平臺(tái)；在鏈霉菌中建立 3套新型誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)；利用合成生物學(xué)遺傳電路原理，建立新的抑制蛋白篩選方法；解析了抗生素介導(dǎo)的新調(diào)控機(jī)制，為適配性設(shè)計(jì)提供了思路和解決方案。同時(shí)，針對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物，首次考察了生物合成途徑中基于自由能變化的原子經(jīng)濟(jì)性，構(gòu)建了加載外源生物模塊的大腸桿菌和鏈霉菌底盤代謝網(wǎng)絡(luò)，并通過將FBA和MOMA結(jié)合來預(yù)測底盤細(xì)胞加載外源生物模塊后的適配性，指導(dǎo)對(duì)鏈霉菌底盤中的前體供應(yīng)、還原力、產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)體系進(jìn)行了改造，對(duì)大腸桿菌底盤細(xì)胞中建立糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)途徑代謝途徑進(jìn)行改造；對(duì)大腸桿菌底盤細(xì)胞中與polynikA及阿維菌素前體合成的代謝途徑進(jìn)行改造；設(shè)計(jì)強(qiáng)化NADPH等輔助因子的循環(huán)回補(bǔ)調(diào)控通路，保證大腸桿菌底盤細(xì)胞中的能量、輔助因子、還原力的平衡，保證合成途徑的有效進(jìn)行；對(duì)底盤細(xì)胞中與聚酮類藥物合成競爭的脂肪酸合成途徑進(jìn)行改造；為大腸桿菌簡約全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。此外，在大腸桿菌底盤中建立初級(jí)代謝途徑的檢測手段，建立聚酮類藥物、核苷肽類藥物前體的高通量篩選方法。最后，還在鏈霉菌中開發(fā)了一種可精確設(shè)計(jì)和預(yù)測的模塊化微調(diào)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程適配性的新方法，系統(tǒng)集成和自由拆分阿維菌素模塊；綜合組學(xué)分析解析阿維菌素高產(chǎn)機(jī)制，并進(jìn)一步設(shè)計(jì)、合成、獲得超高產(chǎn)菌株，并在工業(yè)生產(chǎn)上得到驗(yàn)證。

7 “微生物多細(xì)胞體系的設(shè)計(jì)與合成”研究的主要進(jìn)展

以天津大學(xué)元英進(jìn)為首席的973項(xiàng)目，圍繞“合成微生物多細(xì)胞體系的設(shè)計(jì)與構(gòu)建原理”和“合成微生物多細(xì)胞體系的適配與調(diào)控機(jī)制”兩個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問題展開研究[31-32]，在合成微生物多細(xì)胞體系實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化、復(fù)雜原料利用及低碳底物高碳轉(zhuǎn)化等方面取得了初步進(jìn)展：1) 在原有維生素C兩步發(fā)酵混菌體系系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)和構(gòu)建了由改造后的原一步菌Gluconobacter oxydans和改造后的原二步小菌Ketogulonigenium vulgare組成的一步發(fā)酵混菌體系，維生素 C前體 2-KGA的產(chǎn)量提高了12.8%，流程的簡化使發(fā)酵綜合成本可下降 30%以上 (圖7)；2) 根據(jù)代謝物互補(bǔ)原則，設(shè)計(jì)和構(gòu)建了由酵母Yeast和希瓦氏菌屬Shewanella組成的微生物產(chǎn)電人工多細(xì)胞體系，前者可利用木質(zhì)纖維素、甘油甚至二氧化碳等產(chǎn)生乳酸，后者則利用乳酸產(chǎn)生電子 (圖8)[33-35]。

8 “合成生物器件干預(yù)膀胱癌的基礎(chǔ)研究”研究的主要進(jìn)展

合成生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于腫瘤研究在國內(nèi)外是剛起步的探索性工作，以深圳大學(xué)蔡志明教授為首席的973項(xiàng)目“合成生物器件干預(yù)膀胱癌的基礎(chǔ)研究”在系統(tǒng)生物學(xué)的基礎(chǔ)上，將合成生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于腫瘤治療研究 (圖9)。

圖7 維生素C一步發(fā)酵混菌體系設(shè)計(jì)與構(gòu)建Fig. 7 Design and construction of one step mixed culture fermentation for vitamine C production.

圖8 微生物產(chǎn)電人工多細(xì)胞體系設(shè)計(jì)與構(gòu)建Fig. 8 Design and construction of multiple microbial artificial cells for electricity generation.

圖9 合成生物器件干預(yù)腫瘤的基本策略Fig. 9 Basic strategy of interferences on cancer cells using synthetic biology parts.

項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)了部分膀胱癌關(guān)鍵基因及通路，并在分析相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)信息基礎(chǔ)上，利用定量可控工程體系，表征膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中復(fù)雜事件的共性，挖掘出許多具有潛在利用價(jià)值的膀胱癌識(shí)別和治療的復(fù)合靶標(biāo)[36]。建立了一個(gè)完整的合成生物學(xué)靶點(diǎn)篩查與驗(yàn)證平臺(tái)，用于確定這些潛在靶點(diǎn)是否為有效的靶點(diǎn)[37-38]。創(chuàng)建了正交、可逆的轉(zhuǎn)錄抑制子蛋白庫，用于構(gòu)建模塊化的合成基因線路及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行可編程的操作[39]。項(xiàng)目利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建出了邏輯“與”門基因遺傳線路[40]。該線路能利用膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的識(shí)別靶點(diǎn)特異區(qū)分膀胱癌細(xì)胞和其他類型細(xì)胞，并通過調(diào)控治療靶點(diǎn)，有效減緩腫瘤細(xì)胞的生長速度，誘導(dǎo)其進(jìn)入凋亡程序，或遏制其遷移運(yùn)動(dòng)能力。

項(xiàng)目利用實(shí)體腫瘤中低氧濃度的特點(diǎn)，改造出一株工程化的沙門氏菌，該菌以低氧為生存條件，可特異靶向到腫瘤內(nèi)部，跨界表達(dá)多個(gè)轉(zhuǎn)基因模塊并破壞腫瘤的生長[41]。項(xiàng)目還篩選腫瘤特異性抗原，并通過構(gòu)建遺傳回路對(duì) T細(xì)胞進(jìn)行重編程，使其具備在人工控制條件下特異性識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。未來，項(xiàng)目將進(jìn)一步將其優(yōu)化得到的基因線路裝載到細(xì)菌和 T細(xì)胞載體，合成具有個(gè)性化攻擊力的治療性產(chǎn)品，用于體內(nèi)罹患膀胱腫瘤的小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)一步測試和優(yōu)化該器件對(duì)膀胱癌細(xì)胞的特異殺傷能力。

9 “新型微生物抗逆元件和功能模塊研究”研究的主要進(jìn)展

2014年啟動(dòng)的，以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所林敏為首席的 973項(xiàng)目，針對(duì)工農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用過程易受酸堿、高低溫、高滲透壓以及干旱等不利影響，根據(jù)微生物抗逆與轉(zhuǎn)化分子機(jī)制，擬利用合成生物技術(shù)，設(shè)計(jì)優(yōu)化具有抗高溫、耐酸、耐鹽以及抗干旱等抗逆標(biāo)準(zhǔn)基因元件與模塊，以減少逆境環(huán)境的影響、提高工農(nóng)業(yè)微生物的耐受性和相容性、改善生產(chǎn)工藝、提高生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本。項(xiàng)目擬解析和構(gòu)建 3–5個(gè)耐高溫模塊，可使宿主菌耐受溫度提高5–10 ℃；解析和構(gòu)建1–2個(gè)耐酸功能模塊；解析和構(gòu)建3?5個(gè)耐滲透壓功能模塊，可使宿主菌耐鹽濃度提高到5%–10%。

上述項(xiàng)目的成功實(shí)施，將使我國的生物制造，特別是微生物制造得到大幅度提升，使我國在國際合成生物學(xué)領(lǐng)域上占有一席之地。

致謝：上述材料由執(zhí)行 973項(xiàng)目的各位首席科學(xué)家提供，在此感謝中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所馬延和研究員、中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院趙國屏院士、上海交通大學(xué)馮雁教授、清華大學(xué)林章凜教授、中國科學(xué)院微生物研究所張立新研究員、天津大學(xué)元英進(jìn)教授、深圳大學(xué)蔡志明教授和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所林敏研究員。

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