利用熒光定量PCR檢測(cè)禾谷絲核菌的相對(duì)生物量

洪彥濤， 張?jiān)銎G

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程/農(nóng)業(yè)部麥類生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

利用熒光定量PCR檢測(cè)禾谷絲核菌的相對(duì)生物量

洪彥濤， 張?jiān)銎G*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程/農(nóng)業(yè)部麥類生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

小麥紋枯病是以禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）侵染為主的小麥土傳病害。為建立檢測(cè)禾谷絲核菌在寄主小麥（Triticum aestivum）中的相對(duì)生物量的可靠方法，促進(jìn)小麥抗紋枯病機(jī)制的研究，本研究克隆了禾谷絲核菌肌動(dòng)蛋白基因RcActin的部分（3′端）cDNA，并設(shè)計(jì)了RcActin的特異引物。該引物不僅能區(qū)分禾谷絲核菌與寄主小麥，還能區(qū)分全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）、根腐病菌（Bipolarissorokiniana）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等常見小麥土傳病害的病原菌，表明該引物能用于小麥紋枯病的分子檢測(cè)，也能用于相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定。利用相對(duì)定量法，以RcActin相對(duì)于寄主管家基因的相對(duì)表達(dá)量作為禾谷絲核菌相對(duì)生物量的指標(biāo)，結(jié)果表明，此方法能準(zhǔn)確反映禾谷絲核菌在寄主中的相對(duì)生物量和對(duì)小麥紋枯病抗性程度進(jìn)行快速鑒定。

小麥紋枯??； 禾谷絲核菌； 肌動(dòng)蛋白； 相對(duì)表達(dá)量； 生物量

小麥紋枯病又稱小麥尖眼點(diǎn)病（wheat sharp eyespot），是小麥重要土傳病害。我國(guó)小麥紋枯病主要由禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）侵染所引起［1］。禾谷絲核菌屬于絲核菌屬（Rhizoctonia）雙核絲狀真菌，不產(chǎn)生無性孢子，通過侵染小麥（Triticum aestivum）的葉鞘和莖部，引起小麥組織壞死，形成褐色云紋花稈狀病斑［2］。嚴(yán)重情況下病株會(huì)因養(yǎng)分、水分供應(yīng)不足而造成枯白穗［3］。近年來，紋枯病已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)小麥生產(chǎn)的主要病害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，如2005年我國(guó)小麥紋枯病發(fā)生面積就達(dá)到54萬hm2，造成至少8萬t的產(chǎn)量損失［4］，可見紋枯病對(duì)我國(guó)糧食安全構(gòu)成潛在威脅。因此，開展小麥抗紋枯病育種和小麥－禾谷絲核菌互作機(jī)制的研究迫在眉睫。

病原物的鑒定和定量檢測(cè)對(duì)于病害管理和寄主－病原菌互作機(jī)制研究十分重要。傳統(tǒng)方法主要基于形態(tài)學(xué)特性和致病力鑒定，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且無法進(jìn)行定量分析。傳統(tǒng)的紋枯病抗性鑒定方法基于肉眼對(duì)病斑大小進(jìn)行分級(jí)［5］，各病級(jí)之間界限不明顯，不同人判斷時(shí)容易造成差異。相較于傳統(tǒng)方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）因其靈敏度高、結(jié)果快速準(zhǔn)確，在病原菌鑒定及生物量測(cè)定方面受到越來越多的關(guān)注［6-9］。寄主體內(nèi)病原物的生物量是寄主抗病或者感病程度的一個(gè)考量，也是病原物侵染程度的一個(gè)反映［10-13］。目前，檢測(cè)病原物生物量的方法有兩種：1）絕對(duì)定量，即通過病原物在寄主中的DNA含量來反映其生物量［10-11］。首先將病原菌的基因組DNA梯度稀釋后進(jìn)行qPCR，根據(jù)Ct值和DNA濃度的關(guān)系制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后對(duì)發(fā)病組織定量取樣進(jìn)行DNA提取，再進(jìn)行qPCR，將所得到的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線則可以得到病原物的DNA含量［14］。2）相對(duì)定量，即通過檢測(cè)病原物相關(guān)基因的表達(dá)水平反映其生物量［12-13，15-16］。一般以寄主的管家基因作為內(nèi)標(biāo)，通過檢測(cè)病原菌管家基因（如18S rRNA基因［12-13］和肌動(dòng)蛋白基因［15-16］）的表達(dá)量來反映病原菌的生物量。相對(duì)定量測(cè)定法的優(yōu)勢(shì)在于除了能反映病原菌的生物量外，還能檢測(cè)寄主發(fā)病部位的其他基因表達(dá)量。

肌動(dòng)蛋白（Actin）是細(xì)胞骨架的重要組成蛋白［17］。Actin基因?yàn)橹匾墓芗一?，一般為組成型表達(dá)，因此常被作為基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因［18］。一些病原菌的Actin基因表達(dá)量也被用來檢測(cè)病原物的生物量，如灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）［15］和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）［16］。目前，禾谷絲核菌的Actin基因還未得到克隆，也未有用相對(duì)定量的方法檢測(cè)禾谷絲核菌相對(duì)生物量的報(bào)道。本研究克隆了禾谷絲核菌Actin基因RcActin3′端cDNA，并通過檢測(cè)RcActin表達(dá)量分析檢測(cè)禾谷絲核菌的相對(duì)生物量。結(jié)果表明，禾谷絲核菌Actin基因相對(duì)于寄主管家基因的相對(duì)表達(dá)量能反映該病原菌在寄主組織中的相對(duì)生物量和寄主的抗病程度。同時(shí)這種方法還可以用來檢測(cè)其他基因在發(fā)病部位的表達(dá)情況。相對(duì)于絕對(duì)定量，該方法簡(jiǎn)便易行，更適合用于不同抗性材料間抗病和感病程度的比較。

1 材料和方法

1.1 材料

小麥品種或品系：‘CI12633’，‘山紅麥’，‘Navit14’，‘山農(nóng)0431’，‘揚(yáng)麥158’，‘溫麥6號(hào)’，‘周麥16號(hào)’和‘周麥18號(hào)’作為檢測(cè)引物特異性的材料，‘CI12633’和‘溫麥6號(hào)’作為接菌材料用于禾谷絲核菌Actin基因表達(dá)量檢測(cè)。小麥紋枯病病原菌—禾谷絲核菌R0301由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所陳懷谷研究員提供，小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）XNQS-2由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院王陽副教授提供，根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）ACC30209由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所李洪杰惠贈(zèng)。立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）由本實(shí)驗(yàn)室保存。病原菌在PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 接菌方法

參照蔡士賓等［19］的方法，將禾谷絲核菌R0301菌絲塊移植到新的PDA固體培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)10 d，進(jìn)行活化。將牙簽剪成兩段，再劈成兩半，用清水清洗后裝在燒杯中。往燒杯里加適量的PDA液體培養(yǎng)基，高壓高溫滅菌。將活化后的菌絲塊放到滅過菌的牙簽里，25℃培養(yǎng)30 d。待小麥拔節(jié)之后，將布滿菌絲的牙簽嵌入小麥葉鞘和莖部之間，使牙簽頂部與莖節(jié)處齊平，在外層包裹一層脫脂棉，噴水保濕5 d。

莖部病斑大?。╨esion size）測(cè)量：測(cè)量每個(gè)病斑縱向長(zhǎng)度（L cm）和病斑弧長(zhǎng)占莖周長(zhǎng)的比例（R）。lesion size＝L×R。如果莖部有多個(gè)病斑，計(jì)算每個(gè)病斑后累加。

1.3 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

分別從接種禾谷絲核菌0、12 h，1、2、4和7 d的小麥葉鞘和莖部取樣，取樣時(shí)用酒精棉球擦去小麥組織表面殘留的接菌菌絲，再剪下接病部位的莖節(jié)以下6 cm的莖部和葉鞘，用錫箔紙包裹后液氮凍存，－80℃保存。

用Trizol（Invitrogen）法進(jìn)行RNA提取，用DNaseⅠ（TaKaRa）去除基因組DNA。利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa），以O(shè)ligo d T為引物反轉(zhuǎn)錄、合成單鏈cDNA。

1.4 禾谷絲核菌Actin基因3′端cDNA的克隆和特異引物設(shè)計(jì)

用小麥Actin基因Ta Actin的引物（TaAct A：5′-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3′/TaActB：5′-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3′），以禾谷絲核菌cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)?；厥漳康臄U(kuò)增帶并克隆到pMD-18T（TaKaRa）載體后，進(jìn)行測(cè)序。得到禾谷絲核菌Actin基因的片段。根據(jù)所獲得的禾谷絲核菌Actin基因的特異片段設(shè)計(jì)用于3′RACE（rapidamplification of cDNA ends）的引物RC-ACT-3RACE：5′-TCTTCCCGTCCATTGTCG-3′。

利用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）ver.3.0（TaKaRa）進(jìn)行禾谷絲核菌Actin基因3′RACE。以提取的禾谷絲核菌總RNA為模板，以O(shè)ligo d TAdaptor：5′-GTTTTCCCAGTCACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′為起始引物，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）進(jìn)行cDNA第一鏈合成。以RC-ACT-3RACE和M13M-4：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′作為引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μL：包含10 ×LATaqPCR buffer 5μL，2.5 mol/L dNTP 4μL，10 pmol/L引物各2μL，cDNA模板2μL，LATaq聚合酶（TaKaRa）0.5μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將回收的目的帶克隆到p MD-18T載體后雙向測(cè)序。

用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，為保證引物的特異性，將上游引物設(shè)計(jì)在編碼區(qū)，下游引物設(shè)計(jì)在3′UTR。引物序列為：Rc Actin-F：5′-GCATCCACGAGACCACTTAC-3′和Rc Actin-R：5′-GCGTCCCGCTGCTCAAGAT-3′。所設(shè)計(jì)的引物再經(jīng)NCBI Primer BLAST（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/primer-blast/）進(jìn)行特異性檢測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)定量RT-PCR（qPCR）檢測(cè)

用天根生化科技有限公司的SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR。反應(yīng)體系25μL。包含12.5μL的2×SuperReal Premix，引物（10 pmol/L）各0.75μL，5μL cDNA模板和0.5μL 50×ROX Reference Dye。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 min；94℃變性15 s，61℃退火31 s，41個(gè)循環(huán)。用2－ΔΔCt方法［20］計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。以小麥Actin基因TaActin作為內(nèi)參基因。以抗病相關(guān)基因TaPR1a的表達(dá)量來檢測(cè)寄主對(duì)病原菌的反應(yīng)，TaPR1aqPCR引物序列參照文獻(xiàn)［12］。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)，每個(gè)樣品qPCR檢測(cè)時(shí)進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 禾谷絲核菌Actin基因的cDNA 3′端的克隆

基于Actin基因在不同物種中的功能及序列保守性，利用小麥特異Actin基因引物，以禾谷絲核菌cDNA為模板，48℃退火溫度擴(kuò)增出約200 bp的片段。通過測(cè)序后得到禾谷絲核菌Actin基因的特異片段。以該特異片段為起始序列，以禾谷絲核菌RNA為模板進(jìn)行3′RACE擴(kuò)增，得到約1.2 kb的片段。經(jīng)測(cè)序和比對(duì)分析表明，所獲得序列為禾谷絲核菌特異的Actin基因序列。編碼區(qū)預(yù)測(cè)表明，該序列包含1 070 bp的部分編碼區(qū)和210 bp的3′非編碼區(qū)（untranslated regions，UTR），將該序列命名為RcActin，GenBank登錄號(hào)為KJ631110。RcActin與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-3的Actin基因Gen-Bank登錄號(hào)EVC56270有83%的一致性，編碼的蛋白序列有99%的相似性。

2.2RcActin特異引物設(shè)計(jì)

根據(jù)RcActin序列，設(shè)計(jì)了特異引物用于檢測(cè)RcActin的表達(dá)量。該對(duì)引物以禾谷絲核菌cDNA為模板可擴(kuò)增出329 bp的片段（圖1a）；以禾谷絲核菌基因組DNA為模板可擴(kuò)增得到436 bp的片段（圖1b）?；厥諟y(cè)序后發(fā)現(xiàn)，該436 bp的片段為RcActin的基因組部分序列，包含了2個(gè)內(nèi)含子，表明該引物也可以用于禾谷絲核菌基因組DNA的檢測(cè)。

為檢測(cè)所設(shè)計(jì)引物的特異性，以不同品種或者品系的小麥、幾種常見的小麥土傳病害病原菌（G.graminis，B.sorokiniana，R.solani）和禾谷絲核菌的cDNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。從圖1a可以看出，只有禾谷絲核菌cDNA可以擴(kuò)增出目的條帶（329 bp），而健康小麥和其他3種病原菌cDNA中未擴(kuò)增出片段（圖中只顯示小麥‘CI12633’的結(jié)果）。另外，以上述病原菌的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，以真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）通用引物作為對(duì)照，結(jié)果如圖1b所示，該引物只能從禾谷絲核菌基因組DNA中擴(kuò)增出目的條帶（436 bp），而采用ITS通用引物均能擴(kuò)增出條帶。以上結(jié)果表明該引物是禾谷絲核菌特異的，可以區(qū)別寄主小麥和其他幾種常見小麥土傳病害病原菌。

2.3 相對(duì)定量能反映禾谷絲核菌的生物量變化

為了檢測(cè)上述引物Rc Actin-F/Rc Atin-R是否能從受禾谷絲核菌侵染的小麥組織中擴(kuò)增到目的片段，分別以未接種和接種禾谷絲核菌的小麥葉鞘組織的cDNA為模板進(jìn)行RcActin的擴(kuò)增。結(jié)果顯示，該引物在感染禾谷絲核菌的小麥組織中可以擴(kuò)增出單一的Rc Actin目的條帶，而在未接種的小麥組織中沒有擴(kuò)增到該目的條帶（圖2），說明該引物可以用于qPCR檢測(cè)。

圖2RcActin基因在發(fā)病部位的表達(dá)Fig.2RcActinexpressed in the infected tissue of host

為分析禾谷絲核菌在侵染小麥后的擴(kuò)展程度，以小麥的Actin基因Ta Actin為內(nèi)標(biāo)，利用qPCR分析了RcActin在接菌后不同時(shí)間點(diǎn)在寄主體內(nèi)的表達(dá)量（以下所有RcActin表達(dá)量的表述都是以小麥Actin基因Ta Actin為內(nèi)標(biāo)的表達(dá)量）。qPCR結(jié)果顯示，RcActin在侵染點(diǎn)的表達(dá)量隨侵染時(shí)間的推移而逐漸增加。在葉鞘組織中，RcActin在接種12 h后就能檢測(cè)到，而且它的表達(dá)模式在接種后0～7 d內(nèi)呈S形曲線增加（圖3a）。而在莖部組織中，RcActin在接種1 d后才可檢測(cè)到，說明葉鞘相對(duì)于莖部更容易受禾谷絲核菌的侵染，而且RcActin在莖部的表達(dá)模式呈J形增長(zhǎng)（圖3b）。禾谷絲核菌侵入寄主細(xì)胞后會(huì)在受侵細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)狀擴(kuò)展，并逐漸向相鄰細(xì)胞縱橫擴(kuò)展增殖［21］，其生物量在寄主體內(nèi)逐漸增加。RcActin表達(dá)量相對(duì)于0 h逐漸增加與禾谷絲核菌在寄主組織的擴(kuò)展是相一致的。說明RcActin表達(dá)量變化可以反映侵入植物組織中禾谷絲核菌生物量的變化。另外qPCR的結(jié)果顯示，雖然在接種早期（12 h～4 d）寄主小麥還未出現(xiàn)病斑，但已能檢測(cè)到RcActin的表達(dá)，表明此方法也可以用于小麥紋枯病的早期診斷。

另外，分析了抗病相關(guān)的基因TaPR1a［12］在禾谷絲核菌侵染葉鞘中的表達(dá)量變化。從圖3c可以看出，隨著禾谷絲核菌生物量的增加，TaPR1a表達(dá)量逐漸上升，表明TaPR1a受禾谷絲核菌誘導(dǎo)表達(dá)。

2.4 利用熒光定量PCR對(duì)小麥紋枯病抗性進(jìn)行鑒定

寄主被病原菌侵染后產(chǎn)生病斑的大?。╨esion size）是寄主抗病性的一個(gè)指標(biāo)，病斑越小表明寄主體內(nèi)的病原菌生物量越少，抗性越好。通過選取紋枯病病斑大小不同的發(fā)病植株，并對(duì)莖部發(fā)病部位取樣，檢驗(yàn)RcActin的相對(duì)表達(dá)量與紋枯病抗性程度的關(guān)系。從圖4a中可以看出，病斑大小與RcActin表達(dá)量呈正相關(guān)，即病斑大的部位，RcActin表達(dá)量也高。另外，以接種禾谷絲核菌的抗紋枯病小麥‘CI12633’和感病小麥‘溫麥6號(hào)’為材料，分析了接種該病菌不同時(shí)段RcActin的表達(dá)量。結(jié)果如圖4b所示，接種禾谷絲核菌2 d和4 d后，RcActin的表達(dá)量在兩種小麥中沒有差異，但在接種后7、14和21 d，RcActin在‘溫麥6號(hào)’中的表達(dá)量顯著高于在‘CI12633’中的表達(dá)量，這與兩個(gè)小麥材料的紋枯病抗性是相對(duì)應(yīng)的，表明用熒光定量PCR對(duì)禾谷絲核菌相對(duì)生物量進(jìn)行檢測(cè)是可靠的。以上結(jié)果還表明，能通過相對(duì)定量的方法對(duì)寄主的紋枯病抗性程度進(jìn)行快速鑒定。

圖3 接種禾谷絲核菌后不同時(shí)間RcActin和TaPR1a的qPCR分析Fig.3 Quantitative real-time PCR analysis ofRcActinandTaPR1aafter inoculation ofR.cerealis

圖4RcActin的表達(dá)量和寄主對(duì)紋枯病抗性的關(guān)系Fig.4 Relationship between expression ofRcActinand resistant degree againstR.cerealisin wheat

3 討論

之前對(duì)禾谷絲核菌生物量的測(cè)定都是通過絕對(duì)定量測(cè)定病原物DNA的含量［22-23］。比如，Nicholson等［22］利用禾谷絲核菌特異的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）引物通過競(jìng)爭(zhēng)PCR對(duì)禾谷絲核菌進(jìn)行定量測(cè)定。Gao等［23］利用禾谷絲核菌微管蛋白（tubulin）基因通過qPCR對(duì)土壤中的禾谷絲核菌進(jìn)行檢測(cè)和定量。但絕對(duì)定量對(duì)DNA質(zhì)量要求很高（低質(zhì)量DNA會(huì)影響DNA濃度的測(cè)定），另外每次檢測(cè)時(shí)都需要重新制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。而相對(duì)定量在病原菌生物量的平行比較方面能更簡(jiǎn)便快速。目前已有許多例子成功運(yùn)用相對(duì)定量檢測(cè)病原菌的相對(duì)生物量。比如，Liu等［12］通過分析全蝕病菌的18S基因在寄主根部的表達(dá)量來檢測(cè)全蝕菌的相對(duì)生物量，從而分析轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)全蝕病的抗性。Mengiste等［24］通過RT-PCR檢測(cè)灰葡萄孢菌Tubulin基因在寄主中的相對(duì)表達(dá)量來鑒定寄主對(duì)病原菌的抗性。然而，有關(guān)禾谷絲核菌相對(duì)生物量定量分析還未見報(bào)道，本研究首次通過基因表達(dá)水平來反映禾谷絲核菌相對(duì)生物量。

Actin基因?yàn)橹匾墓芗一?，常被選為內(nèi)參基因［18］，同時(shí)也被用來反映病原菌生物量。比如，Chacón等［16］利用立枯絲核菌的Actin基因來對(duì)該病原菌的相對(duì)生物量進(jìn)行測(cè)定。Abuqamar等［15］通過RT-PCR檢測(cè)灰葡萄孢菌Actin基因的表達(dá)量來反映該病原菌在寄主體內(nèi)的增殖和寄主對(duì)該病原菌的抗性。本研究利用3′RACE首次克隆到禾谷絲核菌Actin基因RcActin的部分編碼區(qū)和3′UTR，雖然未得到其全長(zhǎng)cDNA，但足以用來設(shè)計(jì)RcActinqPCR特異引物。

引物的特異性是qPCR成功與否的關(guān)鍵因素。本研究所設(shè)計(jì)的RcActinqPCR引物特異性強(qiáng)，能將禾谷絲核菌與寄主小麥區(qū)分開來，還能區(qū)分全蝕病菌、根腐病菌和立枯絲核菌等常見小麥土傳病害的病原菌。另外該引物也能從禾谷絲核菌基因組DNA中擴(kuò)增出特異片段，說明該引物也能夠用于小麥紋枯病的分子檢測(cè)。

研究禾谷絲核菌在小麥體內(nèi)的擴(kuò)展對(duì)小麥－禾谷絲核菌互作機(jī)制研究具有重要的意義。通過相對(duì)定量能直觀地體現(xiàn)禾谷絲核菌在寄主體內(nèi)擴(kuò)展和生物量的變化。本研究結(jié)果顯示，RcActin的表達(dá)量變化可以用來反映禾谷絲核菌在寄主體內(nèi)的生物量變化。研究表明在受侵染的葉鞘組織中，接種12 h后禾谷絲核菌可能就能侵入到葉鞘細(xì)胞中，而且RcActin表達(dá)量的變化在接種0～7 d內(nèi)呈S形增長(zhǎng)，故該病原菌在寄主體內(nèi)生物量的增長(zhǎng)也可能為S形曲線增長(zhǎng)。而在莖部組織中，相對(duì)于葉鞘禾谷絲核菌入侵到寄主細(xì)胞則較晚，在接種0～7 d內(nèi)RcActin表達(dá)量的變化呈J形增長(zhǎng)，說明葉鞘組織相對(duì)莖部更容易受禾谷絲核菌侵染。相對(duì)定量還可以同時(shí)分析其他基因的表達(dá)量。本研究結(jié)果顯示，TaPR1a隨著禾谷絲核菌生物量的增加表達(dá)量逐漸上調(diào)。這結(jié)果與之前的報(bào)道類似：灰葡萄孢菌侵染番茄葉片后，隨著病原菌的擴(kuò)展，寄主的PR-1的表達(dá)量也逐漸上升［25］。

通過檢測(cè)禾谷絲核菌在小麥體內(nèi)的相對(duì)生物量能對(duì)小麥的紋枯病抗性進(jìn)行快速鑒定。本研究結(jié)果顯示，RcActin的相對(duì)表達(dá)量與受侵染寄主的紋枯病病斑成正相關(guān)。另外，在接種禾谷絲核菌7 d后，RcActin的表達(dá)量在感紋枯病小麥‘溫麥6號(hào)’和抗病小麥‘CI12633’體內(nèi)的生物量就產(chǎn)生了差異——禾谷絲核菌生物量在‘溫麥6號(hào)’中顯著高于‘CI12633’。在發(fā)病后期（14 d和21 d）兩者的差異則更大。表明用相對(duì)定量進(jìn)行禾谷絲核菌生物量檢測(cè)是可靠的，而且能用于抗病性的早期鑒定和后期驗(yàn)證。

本研究利用qPCR檢測(cè)禾谷絲核菌的相對(duì)生物量來反映病原菌在寄主的擴(kuò)展和寄主對(duì)其的抗病程度，能為小麥抗紋枯病育種和小麥－禾谷絲核菌互作機(jī)制的研究提供思路和方法，幫助人們更好地認(rèn)識(shí)禾谷絲核菌和小麥紋枯病。

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Relative quantification of biomass ofRhizoctonia cerealisusing real-time PCR

Hong Yantao， Zhang Zengyan
（National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key Laboratory of
Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops，Ministry of Agriculture/Institute of
Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081，China）

Wheat sharp eyespot，caused byRhizoctonia cerealis，is a devastating soil-borne disease.In order to quantify the relative biomass ofR.cerealisand propel the study about mechanism of resistance of wheat againstR.cerealis，we had cloned the partial cDNA of actin gene fromR.cerealis（named asRcActin）.Then the specific primers ofRcActinwere designed for diagnosis of sharp eyespot and expression analysis ofRcActin.The primers could specifically distinguishR.cerealisfrom wheat，Gaeumannomyces graminis，Bipolaris sorokinianaandRhizoctonia solani.We had proofed that theRcActinexpression level can be used as an indicator of the fungal relative biomass and evaluation of resistant degree againstR.cerealisin wheat.

wheat sharp eyespot；Rhizoctonia cerealis； actin； relative expression； biomass

S 432.1

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.022

2014 02 17

2014 05 28

國(guó)家自然科學(xué)基金（31271799）

*通信作者 Tel：010 82108781；E-mail：zhangzengyan@caas.cn