云南紅豆杉新采收種子的形態(tài)與離體胚的萌發(fā)特性

卞方圓，蘇建榮，劉萬德，李帥鋒，郎學東

中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所，昆明 650224

云南紅豆杉新采收種子的形態(tài)與離體胚的萌發(fā)特性

卞方圓，蘇建榮*，劉萬德，李帥鋒，郎學東

中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所，昆明 650224

通過云南紅豆杉新采收種子形態(tài)觀察、透水性測定、種子大小以及所帶胚乳多少對離體胚萌發(fā)率的影響等試驗，探討云南紅豆杉種子的休眠與萌發(fā)機理。結(jié)果表明，云南紅豆杉種子呈倒卵形和三棱形；胚酒瓶形，白色；胚乳淡黃色，油質(zhì)。種子千粒重為72.934g；種皮、種仁和種胚分別占種子鮮重的50.56%、40.45%和8.99%；胚與種子的體積比(E∶S)為0.074。胚的體積為0.156—1.012mm3，種子為51.658—109.649mm3，兩者呈顯著正相關(guān)(P<0.05，r=0.810)。完整種子的吸水率明顯低于破裂種皮、酸蝕40min和酸蝕20min的種子，但差異隨著浸泡時間延長而縮?。环N子含水量飽和時，完整種子、破皮種子與酸蝕種子的吸水率無顯著差異(前者為23.7%，后兩者約28.0%)。不同大小種子離體胚的萌發(fā)率差異顯著(P<0.05)，特大、大、中、小和特小種子的離體胚的萌發(fā)率為80%、77.8%、67.5%、62.0%和44.0%。胚乳抑制離體胚的萌發(fā)，不帶胚乳離體胚的萌發(fā)率為41.3%，顯著高于帶胚乳的萌發(fā)率(P<0.05)，帶部分胚乳的胚為9.7%—13.3%，帶全胚乳的胚為0。同時離體胚培養(yǎng)過程中所用種胚的新鮮程度也嚴重影響胚的萌發(fā)率。云南紅豆杉種子休眠屬于中度生理休眠類型，種子中的抑制物質(zhì)含量隨時間的動態(tài)變化和胚乳中抑制物質(zhì)含量的多少對胚萌發(fā)率的影響是以后云南紅豆杉休眠研究的重點。

云南紅豆杉；形態(tài)學；離體胚培養(yǎng)；種子萌發(fā)；休眠類型

云南紅豆杉(Taxusyunnanensis)又名紫金杉、紫杉，被國際松杉類專家組(CSG)確定為3級漸危種，也是國家一級保護植物[1]。云南紅豆杉還是一種重要的藥用植物，富含天然抗癌藥物紫杉醇(Taxol)[2]，被廣泛用于滇、川、渝、藏等地的藥用原料林基地建設(shè)[3-4]。紅豆杉植物種子在自然條件下需兩冬一夏才能萌發(fā)，萌發(fā)率很低[5-7]。為縮短種子萌發(fā)時間，提高萌發(fā)率，規(guī)?；嘤狭趾捅Ｓ鑳?yōu)質(zhì)實生苗，國內(nèi)外學者圍繞紅豆杉種子生物學、生理生態(tài)學、種苗培育方面開展了大量的研究，但在種皮透水性的強弱，是否為萌發(fā)的主要障礙[7-11]；胚乳對種胚萌發(fā)有抑制作用，還是促進作用[12-13]；新采收種子離體胚培養(yǎng)的萌發(fā)率是高(82%)，還是低(8.5%)[13-15]這3個關(guān)鍵問題上仍未形成一致觀點和結(jié)論。

種子休眠(Seed Dormancy)是指在一定的時間內(nèi)，具有活力的種子在任何正常的物理環(huán)境因子組合下不能萌發(fā)的現(xiàn)象[16-17]。Baskin和Baskin[16,18]依據(jù)物種的成熟新鮮種子是否在持續(xù)四周的最佳萌發(fā)條件下萌發(fā)與否作為劃分種子休眠與否的時間界限，并結(jié)合種子的其它特性劃分出生理休眠(Physiological Dormancy，PD)、形態(tài)休眠(Morphological Dormancy，MD)、形態(tài)生理休眠(Morphophysiological Dormancy，MPD)、物理休眠(Physical Dormancy, PY)和復(fù)合休眠(Combinational dormancy, PY+PD)5種類型。PD廣泛存在于裸子植物和大多數(shù)被子植物的種子中，主要以離體胚能否正常生長，萌發(fā)是否需要釋放休眠的預(yù)處理確定并劃分亞類；MD型種子的胚已分化，但小、發(fā)育不完全，胚生長至足夠體積后就能萌發(fā)；MPD 的種子具有未發(fā)育完全和生理休眠的胚；PY則是由種皮或者果皮的不透水所引起；PY+PD的種皮(果皮)不透水, 而且胚具有生理休眠[19]。紅豆杉種子的休眠機理迄今仍不清楚，快速解除休眠的技術(shù)也尚未發(fā)現(xiàn)[7,20]，而澄清種胚的萌發(fā)特性、種皮透水性等爭議較大的問題是深入研究種子休眠類型與機理及開發(fā)休眠解除技術(shù)提高發(fā)芽率的重要基礎(chǔ)。

本研究以新采收的云南紅豆杉種子為對象，通過對種子的形態(tài)特征、種胚大小與萌發(fā)的關(guān)系、種皮透水性及離體胚萌發(fā)特性等方面的研究，探討種皮的透水特性、胚乳對離體胚萌發(fā)的影響及離體胚培養(yǎng)萌發(fā)率變異巨大的成因，為揭示云南紅豆杉的休眠機理及休眠解除機理累積基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時為推動種群恢復(fù)和實生苗的規(guī)模化培育提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用云南紅豆杉種子采自中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所景東試驗站栽培的同一種源。采樣地海拔1200m，位于E 100°18′，N 23°52′。該區(qū)屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫(18.3±0.5)℃，極端最高溫(37±1.5)℃，極端最低溫(-2±1)℃；年平均降雨量1100±50mm，多集中于7—8月；年平均日照天數(shù)(205±5)d；年均太陽輻射總量(131.7±2.5)×4.184kJ/cm2。2013年12月5日采摘假種皮變紅的種子用于試驗。采種后帶回實驗室立即用水浸泡并搓洗除去假種皮，將洗凈的種子陰干后備用。經(jīng)國家標準《林木種子檢驗規(guī)程》(GB 2772—1999)[21]TTC法測定，種子生活力為78%。

1.2 方法

1.2.1 試驗種子抽樣方法

各試驗均采用《林木種子檢驗規(guī)程》(GB 2772—1999)[21]四分法按所需用量從2000粒左右種子中隨機抽取各項試驗種子。

1.2.2 種子和種胚的形態(tài)與大小

觀察種子與胚的形態(tài)，測量種子大小、千粒重、胚大小，稱量種皮、種仁、胚重量。種子大小以長軸、橫徑和縱徑表示，隨機抽取30粒種子，3次重復(fù)，用精確到0.01mm的游標卡尺測量。云南紅豆杉種子外觀近似于橢球體，因此根據(jù)橢球體的計算公式計算種子體積。胚形態(tài)用VHX-1000超景深三維顯微鏡觀察與測量，隨機抽取30粒種子，3次重復(fù)。由于種胚形狀呈酒瓶形，上半部近似圓錐體，下半部近似圓柱體，采用圓錐和圓柱體積公式計來計算種胚的體積。種子千粒重按《林木種子檢驗規(guī)程》(GB 2772—1999)[21]測定。種皮、種仁、胚的重量為鮮重，隨機取30粒種子，3次重復(fù)，用解剖刀將種子分離成種皮和種仁(包括胚乳、胚)兩部分，再分別用電子天平稱量；用解剖刀沿種仁中線切除部分胚乳后用解剖針挑出完整的種胚，取10粒種胚用電子天平稱量，重復(fù)20次。

1.2.3 種子的含水量

由于紅豆杉種子較堅硬，所以先將種皮夾破，再置于103±2℃的恒溫干燥箱中烘17h，然后取出在干燥器中冷卻至室溫。每次取約3g種子，3次重復(fù)。用烘干前后的重量差值除以干重計算種子含水量[22]。

1.2.4 種子透水性的測定

實驗設(shè)完整種子、夾破種子、酸蝕40min種子、酸蝕20min種子4個處理，其中夾破處理為切去約十分之一的種皮，酸蝕所用試劑為98%的濃硫酸。取完整種子、夾破種子各30粒分別稱質(zhì)量，然后放入燒杯中，加蒸餾水浸泡，在室溫條件下吸脹。另取酸蝕20min種子和酸蝕40min種子各30粒分別稱質(zhì)量，先流水沖洗24h，再繼續(xù)浸泡水中。流水沖洗每2h稱量1次，24h之后每6h稱量1次，36h后每12h稱量1次，直至恒重[23]。4個處理，每個處理3次重復(fù)，以浸種前后的質(zhì)量差除以浸種前質(zhì)量計算種子吸水率。

1.2.5 不同大小種子的離體胚培養(yǎng)

隨機抽取150粒種子，用0.01mm的游標卡尺測量種子的長軸、橫徑和縱徑，計算體積。做頻率分布圖，對種子大小進行分組。然后進行萌發(fā)試驗，每組隨機取40顆，重復(fù)3次，去外種皮，經(jīng)70%酒精和0.1%升汞常規(guī)表面消毒后，在無菌條件下切除種皮和部分胚乳后接種于MS基本培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基的pH值為5.8，添加3%蔗糖、0.8%瓊脂。培養(yǎng)溫度控制在(25±1)℃，每天光照16h，光照度為2000lx[13]。接種時間為2013年12月19日。離體胚萌發(fā)指具有子葉和胚軸的胚，每天觀察記錄種子的萌發(fā)情況，做動態(tài)曲線圖。發(fā)芽率(Gp)為發(fā)芽總數(shù)除以培養(yǎng)總數(shù)，發(fā)芽指數(shù)(Gi)為在時間t日的發(fā)芽數(shù)除以相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)的總和。

1.2.6 帶全胚乳和帶部分胚乳胚的培養(yǎng)

用帶全胚乳及帶1/3、1/2、2/3胚乳和不帶胚乳的胚進行離體培養(yǎng)，每組處理40顆，重復(fù)3次。去外種皮，經(jīng)70%酒精和0.1%升汞常規(guī)表面消毒后，在無菌條件下切除種皮和1/3、1/2、2/3或全部胚乳。將5個處理的種子分別接種于MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)方法同上，接種時間是2013年12月24日。按前述離體胚萌發(fā)標準，記錄種子萌發(fā)日進程，繪制動態(tài)曲線。計算發(fā)芽率(Gp)和發(fā)芽指數(shù)(Gi)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 18.0進行處理數(shù)據(jù)，計算種子與種胚各性狀之間的相關(guān)系數(shù)；用單因素方差分析，檢驗不同的種皮處理對種子吸水的差異性和不同種胚大小的萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)間的差異性，并進行LSD多重比較。采用SigmaPlot 12.5制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種胚的形態(tài)與大小

2.1.1 種胚的主要性狀特征

云南紅豆杉種子倒卵形，少數(shù)三棱形(圖1)，種子有鮮紅色杯狀肉質(zhì)假種皮包于種子下半部，頂端有小突尖，基部圓形。種子由種皮、胚及胚乳3部分組成(圖2)。種皮堅硬，褐色，平滑，在高倍顯微鏡下可見密布排列整齊的小橢圓形突起，包括外、中、內(nèi)種皮。胚呈酒瓶形，白色，光滑(圖3)。胚乳淡黃色，油質(zhì)。

圖1 云南紅豆杉種子形態(tài)Fig.1 Seed morphology of Taxus yunnanensis

圖2 南紅豆杉種子縱切面Fig.2 Seeds longitudinal section of Taxus yunnanensis

圖3 云南紅豆杉種胚形態(tài)Fig.3 Embryo morphology of Taxus yunnanensis

云南紅豆杉種子特征數(shù)據(jù)見表1。種子平均千粒重為72.934g、平均含水率為32%；種子的長軸長、橫徑長和縱徑長分別是6.905、4.876mm和4.403mm；平均每粒種子的種皮重、種仁重和種胚重為0.045、0.036g和0.0036g，分別占單粒種子重量的50.56%、40.45%和8.99%。

表1 云南紅豆杉種胚性狀Table 1 Embryo characters of Taxus yunnanensis

種皮、種仁為單個質(zhì)量，種胚為每10個質(zhì)量。

2.1.2 種胚性狀的相關(guān)性分析

云南紅豆杉種胚性狀之間的相關(guān)分析(表2)表明，種子的千粒重與種皮重、種胚長，種皮重與種仁重，種仁重與種子縱徑長之間存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)；種子的長軸長分別與種子的橫徑長、種子縱徑長和種胚長存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)；種子的橫徑長與種子縱徑長和種胚長也呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；種子縱徑長與種胚長的相關(guān)性也達到極顯著(P<0.01)。

表2 云南紅豆杉種胚性狀相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of embryo characters of Taxus yunnanensis

*P<0.05;**P<0.01

2.1.3 種胚的大小分布

云南紅豆杉種子和種胚體積大小呈明顯的正態(tài)分布(圖4)。

圖4 種子與種胚大小的頻數(shù)分布圖Fig.4 Distribution of Seed and embryo size frequency

種子的體積大小在51.658—109.649mm3之間，全距57.991，以11.598為組距可將種子分成特小、小、中等、大、特大5個組，對應(yīng)的體積范圍分別為51.658—63.256mm3、63.257—74.854mm3、74.855—86.452mm3、86.453—98.050mm3和98.051—109.649mm3。云南紅豆杉種胚的體積分布范圍為0.156—1.012mm3，按體積大小可分為特小、小、中等、大、特大5個組，體積范圍分別為0.156—0.327mm3、0.328—0.498mm3、0.499—0.669mm3、0.670—0.840mm3和0.841—1.012mm3。

散點圖(圖5)顯示種子與種胚的體積之間存在明顯的線性相關(guān)關(guān)系。進一步分析表明，云南紅豆杉種胚的體積與種子的體積之間的回歸方程為y=0.0972+0.063x(r2=0.657，P<0.001)。種胚體積大小變異的65.7%可用種子體積的大小來解釋，因此生產(chǎn)上可用種子的大小來判斷種胚的大小。云南紅豆杉種胚與種子體積大小的比值(E∶S)為0.074。

2.2 種皮透水性

在整個實驗過程中，完整種子的吸水率明顯低于破裂種皮、酸蝕40min、酸蝕20min的處理種子的吸水率，但隨著浸泡時間的增加吸水率的差異逐漸縮小(圖6)。

圖5 種子-種胚體積散點圖Fig.5 Scatter diagram of seed and embryo volume

圖6 不同處理云南紅豆杉種子的吸水動態(tài) Fig.6 Water absorption dynamics of different processing Taxus yunnanensis seeds

從吸水速度看，完整種子的吸水速度最慢；而破裂種子與酸蝕種子吸水速度在18h內(nèi)基本一致，快速吸水，18h后酸蝕20min種子的吸水速度稍慢于破裂種子和酸蝕40min種子。酸蝕40min 種子率先達到20%的吸水率，只需10h，其次破裂種子需12h，酸蝕20min種子需14h，而完整種子最慢，達到20%吸水率需要87h。到第30小時時，破裂種子的吸水率為28.7%，酸蝕20min為26.3%，酸蝕40min為28.0%，之后破皮種子與酸蝕種子的吸水量逐漸趨于飽和，而完整種子仍保持較快的吸水趨勢。破皮種子與酸蝕種子在48h后達到飽和含水量，吸水率在28%左右；完整種子含水量達到飽和需要144h，吸水率為23.7%。

方差分析表明，不同的時間處理(P<0.001)與種皮處理(P<0.001)對云南紅豆杉種子的吸水率都有極顯著影響。對不同種皮處理間的LSD多重比較表明，完整種子的含水率與破皮種皮、酸蝕40min、酸蝕20min處理種子的含水率差異達極顯著水平(P<0.001)；而后三者種子含水率的差異則不顯著。所以，在培育實生苗過程中可采用98%的濃硫酸處理種子20min，以增加種皮的透水性和種子含水量，提高種子萌發(fā)率。

2.3 種子大小對種胚萌發(fā)的影響

試驗將不同大小的種子接種在MS培養(yǎng)上，培養(yǎng)12d左右可以明顯觀察到部分種胚生長出2片綠色子葉，同時胚軸伸長(圖7)。

圖7 云南紅豆杉種子的離體培養(yǎng)Fig.7 In vitro culture of Taxus yunnanensis seeds

圖8 不同大小種子萌發(fā)動態(tài)Fig.8 Seed germination dynamic of different sizes

云南紅豆杉離體胚培養(yǎng)的萌發(fā)進程(圖8)表明，不同大小種子的萌發(fā)趨勢較為一致，初期萌發(fā)率有隨時間快速增長的特點。特大、大和中等大小種子的離體胚最先開始萌發(fā)，小種子和特小種子開始萌發(fā)的時間稍晚。離體培養(yǎng)到12—18d左右，大量種胚同時萌發(fā)，萌發(fā)率較高，萌發(fā)率增長速度較快。隨時間的推移，每天種胚的新增萌發(fā)量減少，萌發(fā)速度開始減慢。在接種之后的23d左右就觀測不到種子萌發(fā)現(xiàn)象，種胚萌發(fā)基本停止，萌發(fā)率也不再增加。

云南紅豆杉離體胚的平均萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)隨種子大小的增大而增加(圖8)。離體胚的萌發(fā)率在44%—80%之間，特大種子的萌發(fā)率為80%，大、中、小和特小種子的萌發(fā)率分別為77.8%、67.5%、62.0%和44.0%。方差分析表明，不同大小種子離體胚的萌發(fā)率(Gp)和發(fā)芽指數(shù)(Gi)的差異均達到顯著水平(FGp=4.194>F0.05=3.480；FGi=4.260>F0.05=3.480)。LSD檢驗表明：特大種子的萌發(fā)率顯著高于特小種子(P<0.001)，顯著高于小種子和中種子(P<0.05)；大種子的萌發(fā)率顯著高于特小種子(P<0.05)；其余種子之間差異不顯著。可見，在離體胚培養(yǎng)過程中，選擇個大、飽滿的種子，尤其是選用體積在98mm3以上的特大種子可顯著提高胚的萌發(fā)率。該結(jié)果也說明，在實生苗培育的制種環(huán)節(jié)中應(yīng)考慮對種子進行分級，以提高種子的萌發(fā)率，降低育苗成本。

圖9 不同大小種子萌發(fā)率與發(fā)芽指數(shù)Fig.9 Seed germination rate and germination index of different sizes

2.4 胚乳對種胚萌發(fā)的影響

在云南紅豆杉離體胚培養(yǎng)中，種胚所帶胚乳的多少對胚萌發(fā)率的影響十分明顯(圖10，圖11)，帶全胚乳及帶1/3、1/2、2/3胚乳和不帶胚乳胚的萌發(fā)進程均不理想，每個處理的初始萌發(fā)時間差別很大，較早(不帶胚乳)于18d開始萌發(fā)，較晚(全胚乳)甚至沒有萌發(fā)的跡象，由于本研究僅觀察到35d，故不排除35d后仍有種子再萌發(fā)的情況。

圖10 種胚帶不同大小胚乳萌發(fā)動態(tài)Fig.10 The germination dynamic of embryo with endosperm of different sizes

圖11 種胚帶不同大小胚乳萌發(fā)率與發(fā)芽指數(shù)Fig.11 The germination rate and germination index of embryo with endosperm of different sizes

在研究期限內(nèi)，不帶胚乳的胚的萌發(fā)率(41.3%)最高，帶部分胚乳的萌發(fā)率在9.7%—13.3%之間，全胚乳胚萌發(fā)率最低為0。方差分析表明，離體胚培養(yǎng)過程中，胚帶胚乳的多少對萌發(fā)率(Gp)和發(fā)芽指數(shù)(Gi)的影響達極顯著水平(FGp=16.629>F0.01=5.99，P<0.01；FGi=32.397>F0.01=5.99，P<0.01)。LSD多重比較(圖11)進一步表明，不帶胚乳胚的萌發(fā)率高于1/3胚乳胚、1/2胚乳胚、2/3胚乳胚和全胚乳胚，且萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)的差異達極顯著水平；1/3胚乳胚顯著高于全胚乳胚；其余種子之間差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

3.1 云南紅豆杉離體胚萌發(fā)率的影響因素

云南紅豆杉的離體胚培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基時，種胚萌發(fā)率的差異很大，趙沛基等[13]測定的萌發(fā)率高達82%，王兵益等[14]測定的萌發(fā)率為70%，而楊玲等[15]測定的萌發(fā)率僅有8.5%。這些研究均以新鮮、成熟(以假種皮變紅為標志)的種子為試驗材料，培養(yǎng)方法基本一致。本研究表明，種子和胚的體積大小很可能是其離體胚培養(yǎng)萌發(fā)率差異較大的成因之一。云南紅豆杉新采收種子和種胚的體積分別在51.658—109.649mm3和0.156—1.012mm3之間，變異幅度較大。種子大小對離體胚的萌發(fā)率影響顯著，特大種子(體積98.051—109.649mm3)的萌發(fā)率高達80%，而特小種子(體積51.658—63.256mm3)的萌發(fā)率僅有44%。云南紅豆杉種子的體積與種胚的體積之間存在顯著的正相關(guān)(圖5)，可以認為胚的大小也是影響離體胚萌發(fā)率的因素。以往的研究，忽視了種子、胚的大小對離體胚萌發(fā)率的影響，這可能是導致云南紅豆杉離體胚培養(yǎng)種胚萌發(fā)率差異巨大的重要因素。在今后的研究中，應(yīng)加強種子的大小對萌發(fā)率影響及其與種子成熟度關(guān)系的探索，并在實生苗木培育過程中對種子進行分級處理。

本研究所用云南紅豆杉種子采于2013年12月5日，同月19日接種第一批離體胚，24日接種第二批離體胚。第一批接種的帶部分胚乳離體胚的萌發(fā)率為44%—80%(圖9)，而第二批帶部分胚乳離體胚的萌發(fā)率僅為9.7%—13.3%(圖11)。結(jié)果顯示，用新采收云南紅豆杉種子進行離體胚培養(yǎng)時，接種時間的早晚對種胚萌發(fā)率也有較大的影響，有研究報道鮮種在采后一周發(fā)芽率可達90%[10]。然而，先前的研究尚未認識到離體胚或種子的新鮮程度(種子采集后到接種或播種的時間長短)對種胚萌發(fā)率的影響。可見，種胚的新鮮程度也是導致云南紅豆杉離體胚萌發(fā)率波動的重要因素。關(guān)于云南紅豆杉的離體胚培養(yǎng)、種子萌發(fā)及休眠機理的研究，既要注意培育條件的相同，又要重視試驗材料的一致性，深入探討試驗材料的差異性在揭示紅豆杉休眠機理和突破紅豆杉快速解除休眠技術(shù)方面具有重要的價值，應(yīng)給予充分重視。

3.2 云南紅豆杉的休眠類型及其成因

如前所述，Baskin和Baskin[16,18]將種子休眠分為生理休眠(PD) 、形態(tài)休眠(MD)、形態(tài)生理休眠(MPD)、物理休眠(PY)和復(fù)合休眠(PY+PD)5種類型。本研究中，帶全胚乳的種胚在35d試驗期的萌發(fā)率為0， 按照Baskin和Baskin[16,18]的標準(四周不萌發(fā))，該物種具有休眠特性。解剖發(fā)現(xiàn)，試驗用種都已分化完全，可明顯觀察到種皮、胚乳以及胚的胚根、胚軸、子葉等組織，且云南紅豆杉新采收種子的離體胚在12—18d左右能夠正常生長(圖7)，其它研究也未發(fā)現(xiàn)種子貯藏過程中胚結(jié)構(gòu)的明顯變化[14]，因此云南紅豆杉種子的休眠不屬于形態(tài)休眠類型。本研究顯示，完整種子的吸水率雖然比破皮種子、酸蝕40min、酸蝕20min處理種子的吸水率低，但浸泡144h后，前者的吸水率僅比后3類處理低5%左右。這與趙盛軍[11]認為云南紅豆杉種皮透水性較好的結(jié)論一致，所以云南紅豆杉種子的休眠也不屬于物理休眠。對比有胚乳和沒有胚乳的離體胚的萌發(fā)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胚乳是影響離體胚萌發(fā)的重要因素，由此可推斷，云南紅豆杉種子的休眠屬于Baskin和Baskin[18]休眠分類體系中的中度生理休眠類型。

導致生理休眠的原因很多，但是離體胚培養(yǎng)中種胚帶胚乳的多少和種子的新鮮程度對云南紅豆杉離體胚萌發(fā)的影響值得深入研究。本研究中，不帶胚乳離體胚的萌發(fā)率顯著高于帶胚乳離體胚的萌發(fā)率，與趙沛基等[13]的研究結(jié)論相反。產(chǎn)生這一矛盾的原因可能是試驗用種新鮮程度的影響。以往研究都假定種子采集到接種的時間不影響種子的萌發(fā)率，均未注明種子的采集時間和胚的接種時間。但本研究結(jié)果表明，離體胚培養(yǎng)過程中所用種子的新鮮程度嚴重影響胚的萌發(fā)率。目前，普遍認為種子中的抑制物是導致紅豆杉休眠的主要原因[8,20,24-28]。通過研究云南紅豆杉種子中抑制物含量與種子新鮮程度的關(guān)系，胚乳中抑制物含量對萌發(fā)率的影響，可以解釋產(chǎn)生上述矛盾的成因，這是云南紅豆杉休眠研究的重點。

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Morphology of fresh seeds and germination of in vitro embryos forTaxusyunnanensis

BIAN Fangyuan, SU Jianrong*, LIU Wande, LI Shuaifeng, LANG Xuedong

ResearchInstituteofResourceInsects,ChineseAcademyofForestry,Kunming650224,China

Taxusyunnanensis(Taxuswallichianavar.wallichiana) is an endangered species on China′s national protection list.This plant is located mainly in Yunnan, Sichuan, Chongqing, and Tibet.In nature, the seeds ofT.yunnanensisneed about 2years to eliminate dormant factors for germination.To shorten the time of seed germination and improve the germination rate, many studies of seeds on biology, physiological ecology, and cultivation have been conducted.However, there are no consistent views and conclusions about how to improve germination rates.Thus, clarification of the embryonal germination characteristics and the water permeability of seed coats form the basis for understanding causes of seed dormancy.In order to explore the mechanisms ofT.yunnanensisseed dormancy and germination, fresh seeds were used for morphological observation, water permeability tests, and tests on the effects of different seed sizes and endosperm quantities on the germination rate for in vitro embryos.Our results showed thatT.yunnanensisseeds were obovate three-sided prisms, embryos were white and bottle shaped, and the endosperm was pale yellow and oily.One thousand seeds weighed 72.934g.The relative weights of seed coat, kernel, and embryo accounted for 50.56%, 40.45%, and 8.99% of total seed weight, respectively.The volume ratio of an embryo versus a seed (E∶S) was 7.4%.The volume range for embryos and seeds was 0.156—1.012and 51.658—109.649mm3, respectively.Mantel tests showed that there was a significant positive correlation between the volume of embryos and that of seeds (P<0.05,r=0.810).The water absorption rate of intact seeds was lower than that of cut seeds.However, the differences of water absorption rates for seeds corroded by acids for 40and 20min were reduced with the extension of soaking time.When the moisture content of a seed was saturated, there was no significant difference of water absorption rate among intact (23.7%), cut (28.7%), and acid-corroded (28.0%) seeds.The germination rate of in vitro embryos was markedly different for different seed sizes (P<0.05).Specifically, the germination rate of in vitro embryos for superlarge seeds (98.051—109.649mm3), large seeds (86.453—98.050mm3), medium seeds (74.855—86.452mm3), small seeds (63.257—74.854mm3), and supersmall seeds (51.658—63.256mm3) was 80%, 77.8%, 67.5%, 62.0%, and 44.0%, respectively.Moreover, the endosperm inhibits the germination of embryos, and the germination rate of embryos without endosperm (41.3%) was significantly higher than that for embryos with endosperm (P<0.05).The respective germination rates for seeds with a portion of the endosperm and full endosperm was 9.7%—13.3%, and 0%.Finally, the freshness of in vitro embryos also affected their germination rates.In conclusion, the present study showed that sampling materials and their cultivation conditions should be consistent between studies.In addition, the seed dormancy ofT.yunnanensiswas moderate and caused by physiological dormancy.Many factors can contribute to physiological dormancy;this study confirmed that inhibitors within seeds are the most important causes ofT.yunnanensisseed dormancy.Additional studies should focus on the changes in quantity of inhibitors over time and their effects on the germination rates for in vitro embryos.

Taxusyunnanensis;morphology;in vitro embryo culture;seed germination;dormant type

林業(yè)局948項目(2011-4-03)；云南省科技計劃項目(2011CI072)

2014-06-08; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期:

日期:2015-05-21

10.5846/stxb201406081180

*通訊作者Corresponding author.E-mail: jianrongsu@vip.sina.com

卞方圓，蘇建榮，劉萬德，李帥鋒，郎學東.云南紅豆杉新采收種子的形態(tài)與離體胚的萌發(fā)特性.生態(tài)學報,2015,35(24):8211-8220.

Bian F Y, Su J R, Liu W D, Li S F, Lang X D.Morphology of fresh seeds and germination of in vitro embryos forTaxusyunnanensis.Acta Ecologica Sinica,2015,35(24):8211-8220.