烏頭堿對bcl-2基因表達影響作用的定量研究

饒朝龍，彭成

烏頭堿對bcl-2基因表達影響作用的定量研究

饒朝龍，彭成

目的：研究烏頭類中藥對bcl-2基因表達的影響，探討烏頭類中藥毒性作用機制。方法：建立熒光定量PCR反應體系；體外培養(yǎng)HepG2細胞，分別以500，100，50和10 μg．mL-1濃度的烏頭堿作用于細胞，37℃染毒1.5 h，熒光定量PCR儀檢測。結果：烏頭堿作用下，bcl-2基因表達量增加，且不同劑量組呈現(xiàn)劑量-反應關系。結論：烏頭類中藥具有促進bcl-2基因表達的作用，可能是其毒效作用的重要因素。

烏頭堿；bcl-2基因；毒性；定量

烏頭類(Aconite)中藥具有回陽救逆、補火助陽、溫經(jīng)止痛等功效?，F(xiàn)代藥理研究也證實其具有強心、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，在臨床上應用廣泛。而其又乃有毒之品，臨床應用和基礎研究均表明其具有神經(jīng)和心臟等毒性。以烏頭堿（Aconitine，AC）為代表的雙酯型二萜生物堿是烏頭類中藥的主要活性成分，具有顯著的生理活性；但其同時也是引起毒性作用的主要成分。本課題組前期應用彗星試驗研究表明，烏頭堿對細胞DNA具有損傷作用，提示其具有遺傳毒性作用[1]。大量文獻報道提示烏頭堿與細胞凋亡有關，而bcl-2基因被認為是細胞凋亡發(fā)生過程中最重要的調控基因之一。基于凋亡發(fā)生過程及其機制的復雜性，本研究擬采用實時熒光定量PCR技術定量分析在烏頭堿作用下bcl-2蛋白表達的變化情況，以進一步明確其作用模式和結局通路[2]，探討烏頭類中藥的毒性作用機制和特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肝腫瘤細胞系HepG2 細胞，由四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院分子生物學實驗室保存并提供。

1.1.2 受試藥品和試劑 烏頭堿，質量分數(shù)為98.00%，購于中國藥品生物制品檢定所；TRIZOL試劑，invitrogen公司；iScriptTM cDNA Synthesis Kit，BIO-RAD公司。

1.1.3 主要儀器 Bio-Rad IQ5熒光定量PCR儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 HepG2細胞的培養(yǎng) 以改良的Dubico培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)HepG2細胞。收獲進入對數(shù)生長期的細胞，將細胞密度調整為2×105～5×105個/mL，接種于24孔板，1 mL/孔。

1.2.2 RNA提取及質量分析 提取細胞總RNA。其完整性分析用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察；GE NanoVue超微量分光光度計進行純度分析。

1.2.3 cDNA第一鏈合成 按照TaKaRa反轉錄酶M-MLV操作說明進行RT-PCR，以所得總RNA為模板，Oligo(dT)18為引物，反應體系如表1。先將Oligo(dT)18和RNA混勻，用DEPC水將體積補充至6 μL，在PCR儀上70℃，變性10 min取出冰浴2 min后短暫離心，在冰上加入提前配制好的其余混合物。混合均勻后再次放入PCR儀42℃反應1 h，70℃反應10 min，存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 RT-PCR反應體系

1.2.4 實時熒光定量PCR

根據(jù)NCBI公布的基因全長分別設計bcl-2F/ bcl-2R作為熒光定量PCR引物，bcl-2 F：ATCGCCCTGTGGATGACTGA；bcl-2 R：CCAGGAGAAATCAAACAG

AGGC；選取actin作為內參基因，引物為ActF和ActR，ActF：TCCACGAAA

C T A C C T T C A A C T C C；A c t R：ATGGTGGTGCCGCCAGACA。

利用RNA提取試劑盒從目的材料中提取高質量的Total RNA，所得RNA使用BIO-RAD公司的iScriptTM cDNA Synthesis Kit進行反轉錄，在PCR儀上25℃ 5min，42℃ 30min，85℃ 5min，所得cDNA用Nuclease-free water 稀釋10倍，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

熒光定量PCR 所用試劑盒為BIO-RAD 公司的SsoFastTM EvaGreen ?Superemix，具體體系如表2所示，反應程序為 95℃變性2 min后，進入95℃ 10 s，60℃1 min的45個循環(huán)，最后從65℃到95℃進行溶解曲線分析，去除引物二聚體和其他非特異性擴增。每個樣品均重復三次以避免加樣誤差，實驗數(shù)據(jù)利用iQ5-Cycler進行分析，分析方法為ΔΔCt法。

表2 熒光定量PCR反應體系

1.2.5 烏頭堿處理細胞 待接種細胞生長至對數(shù)生長期后，加入烏頭堿，使受試物染毒終濃度分別為500 μg．mL-1，100 μg．mL-1，50 μg．mL-1和10 μg．mL-1，置37℃孵箱染毒1.5 h。

1.2.6 烏頭堿處理后bcl-2基因表達水平檢測 提取Total RNA，反轉錄后按上述方法進行實時熒光定量PCR。所得數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 細胞總RNA的質量分析

圖中RNA條帶清晰，亮度高，無彌散帶，提取的RNA質量好，可用于后續(xù)實驗。

圖1 細胞Total RNA的瓊脂糖凝膠電泳結果

2.2 實時熒光定量檢測體系的建立

引物的擴增曲線（Ct值在15～30之間）、溶解曲線（為單一主峰）以及標準曲線（相關系數(shù)達到0.99）均符合實驗要求，可以用于后續(xù)實驗。

圖2 引物擴增曲線、溶解曲線和標準曲線

A、B分別為bcl-2和actin基因定量引物的擴增曲線、溶解曲線和標準曲線

2.3 不同劑量烏頭堿作用下bcl-2基因的表達分析

與陰性對照組相比，烏頭堿作用組細胞的bcl-2蛋白表達量增加（p＜0.05），且不同劑量組呈現(xiàn)出劑量-反應關系。

圖3 不同劑量烏頭堿作用下bcl-2蛋白的表達量

3 討論

bcl-2基因屬于bcl-2基因家族，是一種重要的細胞凋亡抑制基因，在多種類型細胞凋亡的調控方面起著重要作用[3]?；蜣D染實驗已證實，bcl-2基因處于凋亡調控的終末部分，其表達的Bcl-2蛋白可能阻止DNA損傷后激活凋亡機制的信號到達其靶位，中斷凋亡感應子和效應子階段的聯(lián)系，因而Bcl-2蛋白的過表達會打破細胞的自穩(wěn)平衡機制，產(chǎn)生凋亡抑制作用，從而使得受損或突變細胞不能得到及時的清除和修復[4]。

烏頭堿是烏頭類中藥的代表性毒性成分和有效成分之一，其毒性研究對于探討烏頭類中藥的毒效相關性具有重要意義。應用熒光定量PCR技術可以較好地反映凋亡相關因子表達的變化[5]，本研究采用熒光定量PCR技術檢測表明，烏頭堿可以使bcl-2基因的表達量增加，且不同劑量組呈現(xiàn)出明顯的劑量-反應關系，與本課題組前期采用流式細胞術的檢測結果一致。流行病學理論認為劑量-反應關系的存在對于因果聯(lián)系的推斷具有積極意義。本結論進一步證實烏頭類藥物具有促進bcl-2基因表達的作用，細胞凋亡的抑制作用增強，從而使得損傷無法通過凋亡的主動途徑被修復并得以固定下來，從而產(chǎn)生細胞形態(tài)和功能的進一步損傷。此外，本課題組還研究了烏頭類生物堿對ras基因、p53基因等凋亡相關基因的作用。上述研究結果將有助于進一步明確烏頭類中藥的毒效作用模式和結局通路。

由于人肝細胞系HepG2細胞具有和人類相似的代謝能力，可作為化學物短期體外遺傳學評價常規(guī)試驗的指示細胞，因而，歐盟等機構均認為，在體外試驗中使用HepG2細胞可以得到模擬體內實驗的結果，其結果用于評價DNA損傷作用時更具實際意義。目前已在體外試驗研究中得到了廣泛的應用[6]。

[1] 饒朝龍,彭成.應用彗星試驗檢測烏頭類生物堿致細胞DNA損傷作用[J].中藥與臨床,2010,1(2):36.

[2] 周宗燦.毒作用模式和有害結局通路[J].毒理學雜志,2014, 28(1):1.

[3] 王曉輝,朱玉真.硫酸鎳誘導小鼠卵巢細胞P53、P16、Bcl-2蛋白表達的研究[J].毒理學雜志,2008,22(5):377.

[4] Thompson CB.Apoptosis in the Pathogenesis and Treatment of Disease[J].Science,1995, 267(12):1456.

[5] 孫云峰,王浩,蔣寧,等.消癰潰得康對胃潰瘍模型大鼠生長因子和凋亡相關因子的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19 (5):186.

[6] 單蕾,范雪梅,王義明,等.中藥復方四味肝泰對荷瘤小鼠和HepG2肝癌細胞的影響[J].世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2012,14(2):1428.

（責任編輯：陳思敏）

Quantitative study on the effect of aconitine on the expression of bcl-2 gene

RAO Chao-long, PENG Cheng // (School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To study the effect of aconitic alkaloid on the expression of bcl-2 gene, and explore the mechanism of toxicity.Method:The reaction system of Q-RT-PCR was established. HepG2 cell was cultivated in vitro, then treated with aconitine (500，100，50 and 10 μg．mL-1) respectively for 1. 5 h at 37℃. And then the cell was determined with Q-RT-PCR.Result:After treated by aconitine, the amount of expression of bcl-2 gene was increased significantly. And its dose-response relationship was observed.Conclusion:Aconitic alkaloid plays an important role in promoting bcl-2 gene expression which may be the mechanism of aconitic toxicity.

Aconitine; bcl-2 gene; toxicity; quantifcation

R 285.5

A

1674-926X(2015)04-005-03

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2012CB723502）；四川省科技廳重點項目（2012JYZ006）；四川省教育廳重點項目（12ZA044）；四川省科技廳“中藥藥理四川省青年基金科技創(chuàng)新研究團隊”（2014TD0007）

成都中醫(yī)藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

饒朝龍，男，教授，主要從事中藥毒理學研究Email：raochaolong@sina.com.cn

彭成，教授，博士生導師，主要從事中藥毒理學研究 Email：pengchengchengdu@126.com

2015-02-15