纖溶系統(tǒng)對羅格列酮治療肺纖維化的影響及信號機制

張彥萍，白林林，李 娜，馬麗華，崔麗亞

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)二科，河北 石家莊 050000； 2.河北省邢臺市人民醫(yī)院呼吸科，河北 邢臺 054000)

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·論 著·

纖溶系統(tǒng)對羅格列酮治療肺纖維化的影響及信號機制

張彥萍1，白林林2，李 娜1，馬麗華1，崔麗亞1

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)二科，河北 石家莊 050000； 2.河北省邢臺市人民醫(yī)院呼吸科，河北 邢臺 054000)

目的探討纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)對羅格列酮抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響及信號機制。方法大鼠胚肺成纖維細(xì)胞隨機分為3組：羅格列酮組、PAI-1組、對照組。羅格列酮組加入羅格列酮30 mmol/L，PAI-1組加入羅格列酮30 mmol/L及PAI-1 20 mmol/L，對照組加入培養(yǎng)基。分別于24 、48 、72 h收取細(xì)胞凍存。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測成纖維細(xì)胞24 h PAI-1和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)mRNA的表達(dá)；Western Blot方法分析3個時間點絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase,AKT)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的蛋白表達(dá)。結(jié)果羅格列酮抑制成纖維細(xì)胞PAI-1 mRNA、α-SMA mRNA及ERK的蛋白表達(dá)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)成纖維細(xì)胞內(nèi)PAI-1表達(dá)后，羅格列酮對PAI-1、α-SMA 的基因表達(dá)及3個時間點ERK蛋白表達(dá)的抑制作用均減弱，與羅格列酮組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；羅格列酮對AKT蛋白表達(dá)無抑制作用(P>0.05)。結(jié)論羅格列酮通過抑制大鼠成纖維細(xì)胞PAI-1的表達(dá)活化纖溶系統(tǒng)；上調(diào)PAI-1表達(dá)可以使羅格列酮抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力減弱，這種作用可能是通過PAI-1與ERK信號途徑之間的相互作用實現(xiàn)的。

肺纖維化；羅格列酮；纖溶酶原激活物抑制物1

肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病率逐年增加，已成為臨床亟待解決的課題。以往研究認(rèn)為，微環(huán)境變化、上皮細(xì)胞損傷、細(xì)胞因子釋放、成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞等可能參與了肺纖維化的發(fā)病[1]。近年研究表明，纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)可能是一個獨立的促纖維化因子，降低PAI-1表達(dá)可以減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[2]。在治療方面，雖然激素、免疫抑制劑及抗纖維化藥物已在臨床應(yīng)用，但肺纖維化還沒有規(guī)范的治療方法。有報道顯示羅格列酮除了調(diào)節(jié)脂肪代謝、糖代謝、動脈硬化外，還具有強烈的抗器官纖維化作用[3]，但機制尚不清楚。本研究探討PAI-1是否參與了羅格列酮抑制大鼠胚肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的過程，以及改變纖溶系統(tǒng)的活性對絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase,AKT)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信號途徑的影響，旨在從羅格列酮治療肺纖維化的角度說明纖溶系統(tǒng)在肺纖維化發(fā)病中的作用。報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與試劑 大鼠胚肺成纖維細(xì)胞(本室凍存)；胎牛血清、DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco公司)；PAI-1蛋白(美國 PEPROTECH公司)；PAI-1、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)引物(上海生工生物工程有限公司)；兔抗大鼠ERK、AKT多克隆抗體(美國Bioworld公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(中山金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇 取出呼吸病研究室凍存的大鼠胚肺成纖維細(xì)胞，迅速置于37 ℃水浴中復(fù)蘇。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基中，于5% CO2、37 ℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。傳至第三代時進(jìn)行藥物干預(yù)。將細(xì)胞分為3組：羅格列酮組、PAI-1組、對照組。羅格列酮組加入羅格列酮(30 mmol/L)，PAI-1組加入羅格列酮30 mmol/L及PAI-1 20 mmol/L，對照組加入培養(yǎng)基。分別于24、48、72 h收取細(xì)胞凍存。

1.2.2 RT-PCR法測定24 h PAI-1、α-SMA mRNA含量 采用Trizol法提取總RNA，按照TaKaRa公司試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成CDNA，保存于-20 ℃中備用。PAI-1上游引物：5′-CCTTCCAGAGTCCC-ATACA-3′；下游引物：5′-CTGG CTCTTTCCACC-TCT-3′。α-SMA上游引物：5′- CCTTCCAGAG TCCCATACA-3′；下游引物：5′-CTGGCTCTTTC-CACCTCT-3′。內(nèi)參照GAPDH上游引物：5′-CCATGTTTGTGATGGGTGTGAACCA-3′；下游引物:5′- ACCAGTGGATGCAGGATGATGTTC-3′。

1.2.3 Westen-Blot測定24、48、72 h AKT、ERK的蛋白表達(dá) 用RIPA細(xì)胞裂解液將細(xì)胞充分裂解，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，加溴酚藍(lán)沸水中煮沸5 min變性，按照SDS-聚丙烯酰胺二凝膠電泳操作說明書經(jīng)過電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入相應(yīng)一抗(AKT、ERK一抗以1∶500稀釋，β-actin一抗以1∶2 000稀釋)，洗膜，HRP標(biāo)記的特異性二抗以1∶2 000稀釋，增強化學(xué)發(fā)光法顯色后，圖像采集，軟件分析得出數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠胚肺成纖維細(xì)胞PAI-1和α-SMA mRA的基因表達(dá) 羅格列酮組成纖維細(xì)胞內(nèi)加入羅格列酮24 h后，PAI-1 mRNA和α-SMA mRNA的表達(dá)下調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PAI-I組成纖維細(xì)胞內(nèi)加入羅格列酮后，再加入外源性PAI-1，PAI-1 mRNA和α-SMA mRA的表達(dá)再次上調(diào)，與羅格列酮組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，2和表1。

圖1 羅格列酮抑制大鼠胚肺成纖維細(xì)胞PAI-1 mRNA的表達(dá)C：對照組；R：羅格列酮組；P：PAI-1組

Figure 1 Rosiglitazone inhibited PAI-1 mRNA expressions of fibroblasts from rats′ embryo lung tissues

圖2 上調(diào)PAI-1表達(dá)對羅格列酮抑制成纖維細(xì)胞α-SMA mRNA表達(dá)的影響C：對照組；R：羅格列酮組；P：PAI-1組

Figure 2 The effect of up-regulation PAI-1 expression in rosiglitazone inhibition on α-SMA mRNA expression of fibroblasts

表1 各組成纖維細(xì)胞PAI-1 mRNA和α-SMA mRNA表達(dá)比較

Table 1 The expression of PAI-1 mRNA and α-SMA mRNAin fibroblasts among three groups

組別PAI-1mRNAα-SMAmRNA對照組 0.921±0.0381.087±0.048羅格列酮組0.379±0.024*0.944±0.028*PAI-1組 0.900±0.006#1.225±0.027#F 84.30585.580P 0.0000.000

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與羅格列酮組比較(q檢驗)

2.2 上調(diào)PAI-1表達(dá)對成纖維細(xì)胞AKT及ERK蛋白表達(dá)的影響 Western Blot結(jié)果顯示羅格列酮作用后對AKT蛋白表達(dá)沒有影響(P>0.05)；羅格列酮使ERK蛋白表達(dá)下調(diào)，3個時間點與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；上調(diào)PAI-1表達(dá)后，羅格列酮對ERK蛋白的抑制作用均減弱，3個時間點PAI-1組與羅格列酮組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3和表2。

圖3 上調(diào)PAI-1表達(dá)對羅格列酮抑制成纖維細(xì)胞AKT及ERK蛋白表達(dá)的影響C:對照組;R:羅格列酮組;P:PAI-1組

Figure 3 The effect of up-regulation PAI-1 expression in rosiglitazone inhibition on AKT and ERK protein expressions of fibroblasts

表2 不同時間點成纖維細(xì)胞內(nèi)AKT和ERK表達(dá)比較

Table 2 The protein expression of AKT and ERK in fibroblasts at different time

組別AKT/β-actinERK/β-actin對照組0.519±0.0303.007±0.211羅格列酮組24h0.562±0.0111.048±0.030*PAI-1組24h0.503±0.0331.616±0.020#羅格列酮48h0.534±0.0322.114±0.041*PAI-1組48h0.523±0.0142.623±0.094#羅格列酮組72h0.485±0.0351.790±0.091*PAI-1組72h0.546±0.0442.616±0.035# F2.736153.548 P0.0570.000

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與羅格列酮組比較(q檢驗)

3 討 論

特發(fā)性肺纖維化發(fā)病機制尚不清楚。以往研究表明，吸煙、病毒感染、肺泡上皮反復(fù)發(fā)生微小損傷后的異常修復(fù)、成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為高表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等因素與發(fā)病有關(guān)[4]。研究表明，纖溶系統(tǒng)不但在凝血及纖溶過程中發(fā)揮重要作用，而且在細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤細(xì)胞遷移，尤其在器官纖維化中亦發(fā)揮著重要作用[5]。近年來對于PAI-1的研究已經(jīng)有了長足的進(jìn)展。我們前期研究表明，成纖維細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染PAI-1 siRNA，可以抑制其增殖、促進(jìn)其凋亡[6]，氣管內(nèi)滴入PAI-1 siRNA可減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[2]。PAI-1可能作為一個獨立的促纖維化因子，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

激素及免疫抑制劑對IPF患者的療效較差，已經(jīng)不推薦使用。雖然吡非尼酮已經(jīng)用于臨床[7]，但價格昂貴，療效有待進(jìn)一步觀察。近年研究表明，羅格列酮作為研究最多的外源性過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)激動劑，具有調(diào)節(jié)脂肪及糖代謝、細(xì)胞增殖及凋亡、炎癥及纖維化的作用[3]。尤其在肝、腎、角膜、肺纖維化等的治療過程中，可以是PPARγ依賴和非依賴性的[8-9]。本研究從基因水平證實羅格列酮抑制大鼠胚肺成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)，抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，阻滯肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。這與以往研究觀察到羅格列酮抑制轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)的人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化并降低大鼠死亡率等結(jié)果相一致[10]。本研究探討在羅格列酮治療肺纖維化過程中是否有纖溶系統(tǒng)參與以及PAI-1與AKT、ERK信號途徑的關(guān)系，從治療角度說明纖溶系統(tǒng)在肺纖維化發(fā)病中的作用。

關(guān)于羅格列酮抑制肺纖維化的分子學(xué)機制，以往研究表明，PPARγ活化可以調(diào)節(jié)炎癥到損傷愈合的轉(zhuǎn)換及上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[3]；通過減低轉(zhuǎn)化生長因子β水平減輕博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化[10]；通過抑制 JAK/STAT和ERK信號途徑減輕IL-13誘導(dǎo)的氣道成纖維細(xì)胞膠原沉積[11]。本研究觀察到，羅格列酮可以抑制成纖維細(xì)胞PAI-1表達(dá)，使纖溶活性升高，同時羅格列酮持續(xù)抑制ERK蛋白的活性；上調(diào)PAI-1表達(dá)后，羅格列酮抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的能力減弱，同時對ERK表達(dá)的抑制作用也減弱。因此，我們認(rèn)為纖溶系統(tǒng)的參與可能是羅格列酮治療肺纖維化的新機制，也進(jìn)一步說明PAI-1在肺纖維化發(fā)病中起重要作用。

近期國外已有研究表明羅格列酮通過改變纖溶活性抑制心肌、腎纖維化及腫瘤活性。如Meng等[12]觀察到PPARγ與Smad信號蛋白的相互作用抑制血管緊張素2誘導(dǎo)的PAI-1產(chǎn)生，進(jìn)而抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖。Carter等[13]觀察到PPARγ激動劑降低PAI-1表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，這個過程可能是通過改變纖溶系統(tǒng)的活性實現(xiàn)的。羅格列酮通過改變纖溶活性抑制成纖維細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化的報道尚未檢索到。本研究結(jié)果表明PAI-1與ERK信號途徑的相互作用可能是羅格列酮治療肺纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，PAI-1是肺纖維化發(fā)病的獨立危險因素，降低PAI-1活性可能對肺纖維化治療有益。

綜上所述，羅格列酮抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，與以往研究機制不同。我們認(rèn)為，PAI-1與ERK信號途徑之間的相互作用可能參與了這一過程，纖溶系統(tǒng)在羅格列酮治療肺纖維化過程中發(fā)揮了重要作用。

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(本文編輯：許卓文)

Rosiglitazone in treatment of lung fibrosis through activation fibrinolysis system and ERK signal pathway

ZHANG Yan-ping1,BAI Lin-lin2，LI Na1,MA Li-hua1，CUI Li-ya1

(1.Department of Respiratory Medicine,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China；2.Department of Respiratory Medicine,the People′sHospital of Xingtai City,Hebei Province,Xingtai 054000,China)

Objective To investigate the effect of plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) in rosiglitazone inhibition the transformation of fibroblasts and the signal mechanism in the process.Methods The fibroblasts from rats' embryo lung tissues were divided into three groups: rosiglitazone,PAI-1 and control groups.The fibroblasts in rosiglitazone group were added with 30 mmol/L rosiglitazone,the fibroblasts in PAI-1 group were added with 30 mmol/L rosiglitazone and 20 mmol/L extrinsic PAI-1,and the amount of culture medium was added in the control group.The fibroblasts were collected at 24 h,48 h and 72 h,and were storaged at frozen condition.The mRNA expression of PAI-1 and α-SMA at 24 h were determined by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).Western Blot analysis was used to determine the expression of serine/threonine kinase(AKT) and extracellular regulated protein kinases(ERK) at 24 h,48 h and 72 h.Results Rosiglitazone inhibited PAI-1 mRNA,α-SMA mRNA and ERK protein expression of fibroblasts,and there were significant difference in rosiglitazone group compared with control group(P<0.05).The inhibition effect was alleviated by up-regulation PAI-1 expression of fibroblasts,there was significant difference in PAI-1 group compared with rosiglitazone group(P<0.05).The expression of AKT showed no difference among three groups(P>0.05).Conclusion Rosiglitazone inhibits the transformation of lung fibroblasts through inhibition on the expression of PAI-1 that activates fibrinolytic system and through the cross-talk between PAI-1 and ERK signal pathway.

pulmonary fibrosis；rosiglitazone；plasminogen activator inhibitor 1

2015-05-28；

2015-08-04

河北省自然科學(xué)基金(C2009001161)

張彥萍(1968-)，女，河北吳橋人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事肺間質(zhì)纖維化疾病診治研究。

R563.13

A

1007-3205(2015)11-1241-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.001