多器官功能障礙綜合征患者腸道菌群多樣性研究

徐文秀,張 謙

(江蘇省蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

臨床研究

多器官功能障礙綜合征患者腸道菌群多樣性研究

徐文秀,張 謙

(江蘇省蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

目的應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)多器官功能障礙(MODS)患者腸道菌群多樣性進(jìn)行研究，分析其與疾病的關(guān)系。方法收集15例MODS患者和15例正常對(duì)照人群的糞便樣本，提取樣本細(xì)菌總基因組DNA。根據(jù)MODS評(píng)分分成低分組(<5分)、中分組(5～10分)、高分組(≥10分)。然后對(duì)細(xì)菌總基因組DNA的16SrRNA的V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行DGGE圖譜及多樣性分析，分析MODS患者及對(duì)照人群腸道菌群的相似性，并通過Shannon-Weaver(H')指數(shù)來分析樣本的條帶數(shù)、均勻度指數(shù)、多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)。結(jié)果低分組及高分組與對(duì)照組菌群結(jié)構(gòu)差異顯著；低分組腸道菌群結(jié)構(gòu)的種類及數(shù)量、優(yōu)勢(shì)菌種類及相對(duì)含量均明顯低于中分組。中分組與高分組腸道菌群結(jié)構(gòu)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高分組腸道菌群的種類多于低分組，但是數(shù)量差異不大；優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)含量及種類差異顯著。結(jié)論MODS患者腸道中獨(dú)有的細(xì)菌與疾病有關(guān)，它們與MODS的關(guān)系尚需進(jìn)一步探索。

PCR-DGGE；多器官功能障礙綜合征；腸道菌群

多器官功能障礙綜合征(MODS)是危重病患者的常見并發(fā)癥。Mayr等[1]對(duì)ICU危重患者死亡原因及危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析顯示，急性MODS引起的死亡占ICU總死亡人數(shù)的47%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過單個(gè)器官衰竭和突發(fā)的心搏驟停而居ICU死亡原因的首位。目前國內(nèi)外最常用的是加拿大Marshall等[2]的MODS評(píng)分和1995年全國危重病急救醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議[3]上提出并通過的MODS診斷標(biāo)準(zhǔn)，1986年Carrico等[4]首先提出腸道是發(fā)生MODS的原動(dòng)力，腸道參與創(chuàng)傷、燒傷和感染后的各種應(yīng)激反應(yīng)，是MODS的始動(dòng)器官。其主要損傷腸道黏膜屏障，影響腸道動(dòng)力。近年隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于腸道微生物的研究[5]。本研究應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)MODS患者腸道菌群多樣性進(jìn)行了觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 收集2010年10月—2012年3月蘇州市中醫(yī)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科及蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科15例符合標(biāo)準(zhǔn)MODS患者的糞便標(biāo)本作為MODS組，同時(shí)采集15例同期健康體檢者糞便標(biāo)本作為對(duì)照組。MODS診斷符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且存在2個(gè)或2個(gè)以上系統(tǒng)或器官功能障礙，年齡大于18周歲，以感染為誘因。MODS組年齡(74.82±14.69)歲，對(duì)照組年齡(81.40±10.49)歲，2組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MODS組又根據(jù)MODS評(píng)分分成3組：低分組(<5分)6例，中分組(5～10分)5例，高分組(≥10分)4例。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備 Eppendorf 5804R低溫高速離心機(jī)；Vortex-2 Genie旋渦振蕩器；DK-8D型電熱恒溫水槽；PTC-225 Peltier Thermal Cycler PCR儀；PAC3000水平電泳儀；Syngene凝膠成像系統(tǒng)；Nanophotometer儀；垂直流超凈工作臺(tái)；DGGE儀(The DCode TM Universal Mutation Detection System)；GS-800灰度掃描儀。

1.3腸道糞便樣本采集 采樣前，將30 mL糞便收集塑料杯高壓滅菌烘干備用。用無菌塑料杯收集每個(gè)個(gè)體新鮮糞便的中后端部分。標(biāo)本采集完成后用蠟?zāi)⑺芰媳诜忾]。同時(shí)對(duì)每個(gè)個(gè)體胃腸道問題信息進(jìn)行采集。采集的樣本先于冰箱凍存，并立即轉(zhuǎn)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4PCR-DGGE分析 16S rRNA 基因V3高變區(qū)通用引物[6]V3F：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’；V3R：5’- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’，其中CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G為GC夾。采用Touch-down程序，94 ℃，3 min預(yù)變性；94 ℃，1 min 變性；65 ℃，1 min退火；72 ℃，1 min 延伸，之后每2個(gè)循環(huán)退火溫度就下降 1 ℃，直到退火溫度降到 55 ℃，再以此為退火溫度循環(huán)4次；72 ℃，5 min延伸；4 ℃，10 min。隨后通過對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Recon-condition PCR去除嵌合體以及異源雙鏈的影響。擴(kuò)增產(chǎn)物檢驗(yàn)：將擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠，Gel Red染色，于0.5×TAE緩沖液中150 V電泳30 min，以50 bp DNA ladder為Marker，使用凝膠成像系統(tǒng)Syngene進(jìn)行檢驗(yàn)。之后進(jìn)行DGGE凝膠制備，220 V，電泳10 min。隨后150 V，電泳5 h，電泳結(jié)束后對(duì)凝膠進(jìn)行Gel-Red染色15 min，使用Bio-Rad凝膠成像儀拍照。并通過QuantityOne軟件對(duì)DGGE分子指紋圖譜進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1MODS患者腸道狀況分析 15例MODS樣本大部分是直接從直腸部位吸取而來，呈水樣或粥樣，部分樣本帶有少量食物殘?jiān)⒛钗镔|(zhì)等。臨床體檢聽診腸鳴音結(jié)果發(fā)現(xiàn)腸鳴音減弱的共有5例，其中低分組為0例，中分組3例，高分組2例。15例患者中大便隱血陽性3例，低分組0例，中分組2例，高分組1例(便隱血，并出現(xiàn)嘔血現(xiàn)象)。

2.2低分組與對(duì)照組DGGE圖譜分析 低分組和對(duì)照組條帶數(shù)、均勻度指數(shù)、多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。低分組多樣性指數(shù)與豐富度指數(shù)均低于對(duì)照組，說明對(duì)照組腸道菌群種類及數(shù)量較大；均勻度指數(shù)與優(yōu)勢(shì)度指數(shù)均低于對(duì)照組，說明二者腸道優(yōu)勢(shì)菌種種類及相對(duì)含量差異也較大。見表1和圖1。

2.3中分組和對(duì)照組DGGE圖譜分析 中分組和對(duì)照組條帶數(shù)、均勻度指數(shù)、多樣性指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和豐富度指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示中分組與對(duì)照組在細(xì)菌的種類和數(shù)量以及優(yōu)勢(shì)菌的種類和相對(duì)含量各方面差異不明顯。見表2和圖2。

表1 低分組與對(duì)照組DGGE圖譜分析

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。

圖1 低分組和對(duì)照組電泳圖

表2 中分組與對(duì)照組DGGE圖譜分析

圖2 中分組和對(duì)照組電泳圖

2.4高分組和對(duì)照組DGGE圖譜分析 高分組和對(duì)照組條帶數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和豐富度指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，而均勻度指數(shù)、多樣性指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示高分組樣本和對(duì)照組腸道菌群在種類上有明顯差異，優(yōu)勢(shì)菌的種類和相對(duì)含量較豐富。見表3和圖3。

表3 高分組與對(duì)照組DGGE圖譜分析

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.5特異性條帶克隆測(cè)序分析 選擇8條具有代表性的DGGE條帶進(jìn)行切膠回收、PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，測(cè)序后所得的序列和數(shù)據(jù)庫GenBank和RDP中的16SrRNA序列進(jìn)行比對(duì)。顯示相似性最高的分別是類桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸球菌屬和大腸桿菌。這提示MODS患者腸道中類桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸球菌屬和大腸桿菌含量相對(duì)較高。見圖4。

圖3 高分組和對(duì)照組電泳圖

圖4 MODS各組與對(duì)照組電泳圖

3 討 論

腸道菌群與MODS的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。早在1988年，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ICU患者大腸桿菌、脆弱擬桿菌、腸球菌普遍存在，而表皮葡萄球菌、念珠菌、假單胞菌對(duì)MOF高分有影響[7]。Marshall等[8]1993年采用含血的瓊脂和Macconkey瓊脂培養(yǎng)需氧菌、血瓊脂和苯乙醇瓊脂培養(yǎng)厭氧菌對(duì)患者胃腸道提取物進(jìn)行定量培養(yǎng)，通過API20E系統(tǒng)進(jìn)行定量和定性分析。該研究揭示了腸道細(xì)菌與遠(yuǎn)距離器官感染之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，器官功能障礙的患者上消化道內(nèi)容物經(jīng)培養(yǎng)后，出現(xiàn)一些與上呼吸道感染有關(guān)并有時(shí)會(huì)造成尿路感染的病原微生物，如念珠菌、糞鏈球菌、假單胞菌和表皮葡萄球菌。

本研究中，16S rRNA V3區(qū)的PCR-DGGE圖譜能夠?qū)θ梭w腸道主要菌群組成進(jìn)行區(qū)分。所有糞便標(biāo)本的DGGE圖譜顯示高度的多態(tài)性，而且不同標(biāo)本間的帶型均存在很大的差異。MODS低分組患者樣本與對(duì)照組以及高分組相比，在菌群組成和數(shù)量以及優(yōu)勢(shì)菌的種類及相對(duì)含量各方面具有顯著差異。中分組與對(duì)照組及高分組和低分組相比，菌群結(jié)構(gòu)的差異不是很明顯。這可能的原因是樣本量較小，尚不能取得更詳盡的信息。也可能提示MODS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)與腸道菌群結(jié)構(gòu)有一定的聯(lián)系。

本研究還針對(duì)DGGE圖譜上顯示的，在MODS患者中亮度較高(即相對(duì)含量較高)以及在MODS患者中特異存在的條帶做了切膠回收克隆測(cè)序的實(shí)驗(yàn)，顯示MODS患者腸道類桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸球菌屬和大腸桿菌含量相對(duì)較高。提示這些菌屬在MODS患者疾病的發(fā)生發(fā)展上起到一定作用。不動(dòng)桿菌屬是一種毒力較低的機(jī)會(huì)致病菌，當(dāng)機(jī)體由于疾病導(dǎo)致免疫力低下的時(shí)候，便可引起感染，引發(fā)炎癥反應(yīng)，如果控制不及時(shí)造成SIRS進(jìn)而導(dǎo)致MODS。有研究顯示不動(dòng)桿菌在肺炎、血液傳染病、膿胸等患者體內(nèi)濃度很高[9]。腸球菌屬為橢圓形或圓形鏈狀排列的革蘭陽性球菌，是人和動(dòng)物腸道正常菌群的一部分。毒力較低，只有在一定條件下如必須在宿主組織定植、并能抵抗機(jī)體的免疫防御機(jī)制后才能引起組織病理改變，導(dǎo)致感染。Hung等[10]從腎膿腫患者的體液中培養(yǎng)出大量大腸桿菌以及腸球菌，也提示這2種菌屬與SIRS及MODS的發(fā)生有關(guān)。通過合理使用抗生素以及飲食調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，有可能減輕MODS患者的臨床癥狀，對(duì)于MODS患者的預(yù)防、治療和轉(zhuǎn)歸都有著重要的作用。

MODS是一類發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的綜合征,對(duì)患者、家庭和整個(gè)社會(huì)都導(dǎo)致了嚴(yán)重的傷害。過去對(duì)MODS病因的研究主要集中在對(duì)炎癥反應(yīng)的控制上，雖然也認(rèn)識(shí)到腸道菌群的重要作用，但是多數(shù)也是通過培養(yǎng)法針對(duì)某些細(xì)菌做的定量、定性分析，而從總體上分析腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究并不多。前期學(xué)者多集中于益生菌對(duì)腸道菌群調(diào)節(jié)作用的研究上，而本文是從腸道菌群總體結(jié)構(gòu)上的探索。再者，以人的腸道為研究對(duì)象，每個(gè)人的飲食、生活環(huán)境和宿主基因等都會(huì)影響腸道菌群結(jié)構(gòu)的組成，因此本研究結(jié)果與他們的研究結(jié)果均有一定的差異。

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Study on the intestinal microbial flora diversity in the patients with MODS

XU Wenxiu, ZHANG Qian

(Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Suzhou 215000, Jiangsu, China)

Objective It is to study the intestinal microbial flora diversity in the patients with MODS by PCR-DGGE technology, and to analyze its relationship with the disease. Methods The stool samples of 15 patients with MODS and 15 healthy people were collected and the genomic NDA of the microbial flora was extracted. According to MODS scores, the patients were divided into low score group (<5), medium score group (5-10), high score group (>=10). V3 area of 16S rRNA of total genomic DNA of bacteria was chosen for PCR amplification to do DGGE profiles and diversity analysis, intestinal flora similarity was analyzed between MODS patients and control group, and through the Shannon-Weaver (H ') index the sample number of bands, evenness index, diversity index, richness index and dominance index were analyzed. Results The differences in the microorganism community structure between low score group, high score group and control group were significant. Sample amount and type of structure of intestinal flora, kind and relative content of advantage strains in low score group was significantly lower than that in medium score group, but there was no significant difference in the microorganism community structure between low score group and high score group. The kinds of intestinal flora in high score group was more than that in low score group, but the difference in quantity was not significant. The difference in kind and relative content of advantage strains was significant. Conclusion Unique intestinal microbial flora in MODS patients is related to the disease, but their relationship with the MODS remains to be further explored.

PCR-DGGE; MODS: intestinal microbial flora

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.28.009

R0541.64

B

1008-8849(2015)28-3104-04

2014-12-30