疏肝健脾法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜中PPAR-γ相關(guān)因子基因和蛋白表達(dá)的影響

肖永峰

(河北省河間市人民醫(yī)院，河北 河間 062450)

疏肝健脾法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜中PPAR-γ相關(guān)因子基因和蛋白表達(dá)的影響

肖永峰

(河北省河間市人民醫(yī)院，河北 河間 062450)

目的研究疏肝健脾法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)的影響。方法將60只正常大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、研究1組、研究2組、研究3組、研究4組，每組10只。正常組不做任何處理，其他組均使用TNBS/乙醇灌腸、再用束縛法+飲食失節(jié)的復(fù)合方法建立大鼠肝郁脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎模型。造模成功后，模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌腸，研究1組、研究2組、研究3組、研究4組分別采用5倍(10g/kg)、10倍(20g/kg)、15倍(30g/kg)、20倍(40g/kg)成人劑量的疏肝健脾的中藥痛瀉要方溶液灌胃治療。治療4周后，將大鼠集體處死，觀察各組結(jié)腸黏膜情況、PPAR-γ蛋白表達(dá)平均光密度值和結(jié)腸黏膜PPAR-γ基因表達(dá)情況。結(jié)果模型組和研究1組、研究2組、研究3組、研究4組大鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白的表達(dá)量均明顯低于正常組(P均<0.05)；研究1組、研究2組、研究3組、研究4組結(jié)腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05),研究4組結(jié)腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)量均明顯高于研究1組、研究2組、研究3組(P均<0.05)。結(jié)論潰瘍性結(jié)腸炎會(huì)影響結(jié)腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)，疏肝健脾的痛瀉要方中藥可以提高結(jié)腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴(lài)性。

疏肝健脾法；潰瘍性結(jié)腸炎；PPAR-γ；痛瀉要方

潰瘍性結(jié)腸炎是常見(jiàn)的腸道疾病之一，其發(fā)病原因尚不明確，但發(fā)病率逐年增高，且復(fù)發(fā)率、癌變率高[1]。該病病程長(zhǎng)，易反復(fù)，常呈慢性病變。臨床癥狀主要有腹痛、腹瀉，糞便中夾有黏液，排便次數(shù)逐漸增多，里急后重，腹痛常排便后減輕，隨病情的發(fā)展會(huì)出現(xiàn)便血、膿血、糊狀黏液便和水樣便等，患者常痛苦不堪[2]。目前臨床尚無(wú)特效治療藥物，只能控制癥狀，且效果不佳，容易出現(xiàn)消化道出血、腸瘺等并發(fā)癥，多數(shù)患者家庭難以承受長(zhǎng)期的經(jīng)濟(jì)壓力[3]。目前潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與PPAR-γ相關(guān)因子基因和蛋白表達(dá)有關(guān)，使用PPAR-γ激動(dòng)劑治療潰瘍性結(jié)腸炎療效較好[4]。本研究探討了疏肝健脾法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜中PPAR-γ相關(guān)因子基因和蛋白表達(dá)的影響，旨在為該病的治療提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康大鼠60只，體質(zhì)量170～200 g ，動(dòng)物合格證號(hào)：1310017，許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-003。

1.2試劑和藥物 痛瀉要方組成：陳皮、白術(shù)、白芍、防風(fēng)比例為3∶2∶1∶1，用70%乙醇提取藥液，成人量為2 g/kg。

1.3動(dòng)物分組及造模 將60只正常大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、研究1組、研究2組、研究3組、研究4組，每組10只。正常組不做任何處理，其他組均用0.03 mL/10 g的10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，將100 mg/kg TNBS再加上50%乙醇0.25 mL混合試劑灌腸(用橡膠輸液管輕緩將試劑注入大鼠距肛門(mén)7～8 cm深的腸腔內(nèi))，留置10 min，再用空針頭抽取5～10 mL的空氣以同樣的方法注入大鼠腸腔內(nèi)。再用束縛法和飲食失節(jié)的復(fù)合方法建立大鼠肝郁脾虛型模型：將大鼠四肢束縛住，不讓其隨意動(dòng)彈，飲食不能足量，讓其在饑餓、疲憊的環(huán)境中呆2 d，達(dá)到肝郁脾虛狀態(tài)。

1.4給藥方法 正常組不做任何處理。模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌腸；研究1組、研究2組、研究3組、研究4組分別采用5倍(10 g/kg)、10倍(20 g/kg)、15倍(30 g/kg)、20倍(40 g/kg)成人劑量的疏肝健脾的中藥痛瀉要方溶液灌胃治療，均1次/d。

1.5觀察指標(biāo) 治療4周，用肉眼觀察大鼠的體型，然后將大鼠集體采用脫頸椎法處死，并迅速剖腹，將肛門(mén)以上結(jié)腸(約8 cm)取出，沿腸系膜緣剪開(kāi)腸腔，用冷磷酸鹽緩沖液沖洗腸內(nèi)容物，肉眼觀察大鼠結(jié)腸黏膜組織的形態(tài)，然后選擇病變最明顯的一段約0.5 cm組織，將其迅速置入液氮中予以保存，使用4%中性多聚甲醛固定部分結(jié)腸組織，做病理切片，脫水，滴加3% H2O2，放置10 min，然后將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中予以抗原熱修復(fù)，自然冷卻后，滴入5% BSA封閉液放置約20 min，再滴入PPAR-γ一抗，在4 ℃冰箱中保存24 h，取出滴加生物素化山羊抗兔IgG，然后轉(zhuǎn)移至37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，滴加SABC試劑繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育20 min，之后使用蘇木素與DAB顯色劑輕度復(fù)染約3 min，乙醇脫梯度水，二甲苯透明，予以中性樹(shù)膠封片處理，最后使用顯微鏡觀察分析。鏡下PPAR-γ胞質(zhì)為黃褐色顆粒染色為陽(yáng)性，顏色越深表達(dá)越強(qiáng)，若無(wú)棕黃褐色顆粒顯現(xiàn)則為陰性，然后再隨機(jī)選擇5個(gè)視野，使用BI-2000圖像，予以免疫組化分析系統(tǒng)處理，對(duì)呈現(xiàn)出的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算其平均灰度值，灰度值越大表明該蛋白的表達(dá)越多。使用上海信裕生物科技有限公司的PPAR-γ檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PPAR-γ蛋白表達(dá)量。

1.6結(jié)腸黏膜組織大體形態(tài)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]參照Luketal標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：無(wú)損傷計(jì)為0分；有充血但沒(méi)有壁層變厚和潰瘍計(jì)為1分；充血伴有腸壁變厚但沒(méi)有潰瘍計(jì)為2分；有單處直徑0～1 cm以?xún)?nèi)的潰瘍計(jì)3分；有2處和2處以上、直徑1～2 cm的潰瘍，但腸管與外周臟器無(wú)粘連計(jì)4分；有2處和2處以上，直徑2 cm以上的潰瘍，腸管增厚，并且與周?chē)K器粘連嚴(yán)重者計(jì)5分。

2 結(jié) 果

2.1肉眼觀察結(jié)果 正常組大鼠活動(dòng)自如，飲食、體型、大便正常，結(jié)腸黏膜組織正常；各造模組大鼠飲食減少，活動(dòng)減少，出現(xiàn)消瘦、腹瀉，結(jié)腸黏膜組織炎癥和潰瘍形成，說(shuō)明造模成功。治療4周后，正常組大鼠結(jié)腸黏膜組織正常，模型組和研究1組、研究2組、研究3組、研究4組大鼠結(jié)腸黏膜均可見(jiàn)不同程度的充血、水腫、腸壁變厚、潰瘍、腸道縮短等表現(xiàn)，但研究1組、研究2組、研究3組、研究4組大鼠的結(jié)腸黏膜損傷情況均明顯輕于模型組，并且隨著痛瀉要方濃度的增高，結(jié)腸黏膜損傷情況越輕。

2.2各組大鼠黏膜損傷評(píng)分 正常組、模型組、研究1組、研究2組、研究3組、研究4組黏膜損傷評(píng)分分別為(0.07±0.02)分、(3.24±1.13)分、(2.14±1.53)分、(1.73±1.25)分、(1.07±0.78)分、(0.14±0.12)分。隨著痛瀉要方濃度的增高，黏膜損傷評(píng)分明顯降低，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3各組大鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)情況 模型組、研究1組、研究2組、研究3組、研究4組結(jié)腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)量均明顯低于正常組(P均<0.05)；研究1組、研究2組、研究3組、研究4組結(jié)腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)量均明顯高于模型組,而且研究4組結(jié)腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)量均明顯高于研究1組、研究2組、研究3組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)情況

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與研究4組比較，P<0.05。

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種非特異炎癥性腸病，致病因素與發(fā)病機(jī)制均較為復(fù)雜。目前研究顯示，該病與免疫反應(yīng)交互性、環(huán)境、遺傳易感性等緊密相關(guān)，其中腸道免疫失衡是該病的重要發(fā)病機(jī)制，這種免疫失衡下，機(jī)體各種炎性遞質(zhì)及細(xì)胞因子互相作用與影響，促進(jìn)了炎癥反應(yīng)，從而造成腸黏膜損傷[5-6]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)可以與一些處于基因上游的、具有特異性的PPAP反應(yīng)元件作用，從而達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的作用；PPARs屬于配體激活核轉(zhuǎn)錄因子，也是核激素受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一[7]。PPAR-γ作為PPARs的亞型，在脂肪組織、大腸等組織中有著高表達(dá)，在腎臟、肝臟、小腸以及骨骼肌中有一定表達(dá)，其主要存在于脂肪組織與免疫系統(tǒng)中，除了在胰島素致敏、脂肪代謝方面有調(diào)控作用外，還對(duì)炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞增殖分化等有著十分重要的調(diào)控作用，與潰瘍性結(jié)腸炎有緊密關(guān)聯(lián)[8]。PPAR-γ抗炎癥反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜，有研究表明，其對(duì)炎癥的抑制作用是經(jīng)抑制核因子NF-κB介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的[9]。但當(dāng)前PPAR-γ在腸道免疫炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制還未完全明了。目前對(duì)PPAR-γ在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中的機(jī)制研究一般多以動(dòng)物為研究對(duì)象?？孪?quán)等[10]應(yīng)用3%葡聚糖硫酸鈉制備大鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，結(jié)果表明益生菌可降低大鼠結(jié)腸組織學(xué)評(píng)分及DAI積分，增加結(jié)腸長(zhǎng)度，提高結(jié)腸黏膜中PPAR-γ的表達(dá)。卞紅磊等[11]和張燕等[12]應(yīng)用復(fù)2,4-二硝基氯苯十乙酸建立潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，并使用免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸黏膜中PPAR-γ的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，大鼠結(jié)腸黏膜上皮PPAR-γ表達(dá)明顯減少，通過(guò)柳氮磺胺吡啶治療后，大鼠結(jié)腸黏膜上皮PPAR-γ表達(dá)明顯升高。苗新普等[13]研究顯示，潰瘍性結(jié)腸炎炎癥組織中PPAR-γ表達(dá)水平明顯低于正常組織，炎癥越嚴(yán)重，其表達(dá)水平則越低，由此可見(jiàn)PPAR-γ相對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎屬于一種負(fù)性調(diào)控因子。梁紅亮等[14]研究表明PPAR-γ對(duì)NF-KB活化劑結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡有抑制作用，且其配體吡格列酮也可以促進(jìn)PPAR-γ的表達(dá)，最終達(dá)到治療結(jié)腸炎癥的目的。

中醫(yī)認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎屬“泄瀉”“痢疾”范疇，該病與肝郁脾虛有關(guān)，主張采用疏肝健脾法治療[15]。痛瀉要方出自《丹溪心法》,方中白術(shù)祛濕健脾治脾虛；白芍酸甘斂陰，柔肝止痛；陳皮行氣健脾，防風(fēng)升散疏肝[16]。諸藥合用補(bǔ)脾柔肝，祛濕止瀉，以達(dá)到疏肝健脾的功效,是治療肝郁脾虛所致腹瀉的代表方[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的結(jié)腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)均低于正常大鼠，給予痛瀉要方中藥灌胃治療可以提高大鼠結(jié)腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)，而且隨著痛瀉要方中藥濃度的升高，結(jié)腸黏膜中PPAR-γ相關(guān)因子基因和蛋白表達(dá)越高，說(shuō)明治療效果越好。

綜上所述，潰瘍性結(jié)腸炎會(huì)影響結(jié)腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)，疏肝健脾的痛瀉要方可以提高結(jié)腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)水平，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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Effect of soothing liver and invigorating spleen method on the expression of PPAR-gamma correlated factor gene and protein in colonic mucosa of ulcerative colitis

XIAO Yongfeng

(The People's Hospital of Hejian City, Hejian 062450, Hebei, China)

Objective It is to study the effect of soothing liver and invigorating spleen method on PPAR-gamma correlated factor gene and protein in colonic mucosa of ulcerative colitis. Methods 60 normal rats were randomly divided into normal group,model group, study group Ⅰ, study group Ⅱ, study group Ⅲ, study group Ⅳ, each group had 10 rats. All the rats except in normal group were used to establish liver stagnation and spleen deficiency type of ulcerative colitis model by the methods of TNBS/ethanol enema, binding method + inproper diet. After success establish of the models, model group was given 0.9% sodium chloride solution by enema, and the study group Ⅰ,study group Ⅱ, study group Ⅲ, study group Ⅳ were given 5 times, 10 times, 15 times, 20 times Tongxieyaofang which could sooth liver and invigorate spleen by intragastric administration. After treating for 4 weeks, all the rats were killed to observe colonic mucosa injury and the average optical density value of the expression of PPAR-protein and PPAR-gene in colonic mucosa. Results The expression of PPAR-gamma correlated factor gene and protein in colonic mucosa of the rats in model group and the study groups were significantly lower than that in normal group (P<0.05), and the expression in the study groups were higher than that in model group (P<0.05), the expression in study group IV was higher than that in the other three study groups (P<0.05). Conclusion Ulcerative colitis can influence the expression of PPAR-gamma correlated factor gene and protein, soothing liver and invigorating spleen decoction Tongxieyaofang can increase the expression of PPAR-gamma correlated factor gene and protein in colonic mucosa with a dose dependence.

Shuganjianpi therapy; ulcerative colitis; PPAR- gamma; Tongxieyaofang

肖永鋒，男，主治醫(yī)師，從事中醫(yī)內(nèi)科臨床工作，擅長(zhǎng)腫瘤、消化系統(tǒng)疾病的中西醫(yī)綜合治療。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.28.008

R0714.433

A

1008-8849(2015)28-3101-03

2014-09-30