hSNF2H在非小細(xì)胞肺癌中存在過(guò)表達(dá)

謝玲玲，金素芬，賀佳妮，付琳，王曉榮，邢濟(jì)麟，李慶昌

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122；2.遼寧省鞍山市中心醫(yī)院病理科，遼寧 鞍山 114001）

·論著·

hSNF2H在非小細(xì)胞肺癌中存在過(guò)表達(dá)

謝玲玲1，金素芬2，賀佳妮1，付琳1，王曉榮1，邢濟(jì)麟1，李慶昌1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122；2.遼寧省鞍山市中心醫(yī)院病理科，遼寧 鞍山 114001）

目的分析hSNF2H在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與臨床病理因素間的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化、Western blot和免疫熒光的方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌中hSNF2H的蛋白表達(dá)情況及其與Rsf-1的共定位情況。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示54.05%（40/74）的病例存在hSNF2H蛋白的過(guò)表達(dá)，其過(guò)表達(dá)與肺癌患者的年齡、性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P分別為0.485 0、0.159 0、0.815 0），而與肺癌的TNM分期以及分化成正相關(guān)（P分別為0.002 0、0.037 0）。結(jié)論肺癌中存在hSNF2H蛋白的高表達(dá)，并與TNM分期和分化相關(guān)。

hSNF2H；Rsf-1；非小細(xì)胞肺癌；免疫組織化學(xué)；免疫熒光

hSNF2H是SWI2/SNF2家族的一個(gè)成員，它是由SMARCA5編碼的一種染色質(zhì)重塑蛋白［1～3］。SMARCA5包含一個(gè)由3 156個(gè)核苷酸編碼的含有1 052個(gè)氨基酸的肽段的開(kāi)放閱讀框架。ISWI家族中hSNF2H的ATP酶結(jié)合域是高度保守的。hSNF2H與Rsf-1形成染色質(zhì)重塑復(fù)合物RSF，在這個(gè)復(fù)合物中Rsf-1作為組蛋白分子伴侶調(diào)整復(fù)合物與DNA的結(jié)合活性，同時(shí)hSNF2H利用其ATP酶活性和解螺旋酶活性參與核小體的移動(dòng)和DNA的解螺旋，RSF復(fù)合物動(dòng)員核小體調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)以適應(yīng)各種生長(zhǎng)信號(hào)和環(huán)境變化的需求［4～6］。已報(bào)道這種核小體的改變也發(fā)生在其他ISWI復(fù)合物和SWI/SNF復(fù)合物中，且它在轉(zhuǎn)錄的激活或抑制［7～9］，DNA的復(fù)制［10］，細(xì)胞周期的進(jìn)展中有一定作用［12］。另外有研究報(bào)道，高h(yuǎn)SNF2H蛋白質(zhì)或mRNA水平與卵巢癌中最惡性類型密切相關(guān)，并且與卵巢癌患者的較短的生存期相關(guān)。迄今為止，越來(lái)越多的證據(jù)表明染色質(zhì)重塑參與調(diào)控細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展。

有文獻(xiàn)報(bào)道hSNF2H在卵巢癌中存在過(guò)表達(dá)，但是hSNF2H在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理因素的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。因此，本課題擬通過(guò)免疫組化、Western blot、免疫熒光雙染等方法研究肺癌組織及肺癌細(xì)胞系中hSNF2H表達(dá)情況及其與臨床病理因素之間的關(guān)系，為肺癌的診斷和治療提供新的基因靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

74例非小細(xì)胞肺癌及相應(yīng)正常肺組織標(biāo)本均來(lái)自2008年至2010年在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行手術(shù)治療的患者，組織經(jīng)10%中性甲醛固定、石蠟包埋?；颊咝g(shù)前均未接受放化療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色：將石蠟組織塊切成4 μm厚切片，脫蠟，脫水，按S-P法說(shuō)明操作?？筯SNF2H單克隆抗體（1∶1 000，Upstate，美國(guó)），DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。2名病理診斷醫(yī)師分別對(duì)組織切片染色情況進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果判定：hSNF2H以細(xì)胞核染色為陽(yáng)性細(xì)胞。根據(jù)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞百分比：0%記為0分，1%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，76%～100%記為4分。同時(shí)根據(jù)染色強(qiáng)度：陰性或淺黃色記為0分，黃色記為1分，棕褐色記為2分。著色細(xì)胞數(shù)得分乘以著色強(qiáng)度得分為hSNF2H得分。我們將得分為4～8分記做hSNF2H高表達(dá)。

1.2.2 Western blot：收集細(xì)胞加入裂解液充分裂解，低溫高速離心（4℃，12 000 r/min，15 min），提取上清為總蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法蛋白定量，上樣蛋白量為60 μg。8%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore，Bedford，美國(guó)），5%脫脂奶粉封閉，抗hSNF2H（1∶1 000，Upstate，美國(guó)），抗Rsf-1（1∶1 000，Abcam，美國(guó)）和β-actin、GAPDH（1∶1 000，Santa Cruz）4℃孵育過(guò)夜，分別與對(duì)應(yīng)的二抗（1∶2 000，Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)）室溫孵育2 h，ECL（Pierce）顯色，結(jié)果經(jīng)BioImaging System（UVP Inc.，Upland，美國(guó)）采集。

1.2.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)：H1299、LTE細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，用1%BSA封閉1 h后，hSNF2H（1∶100，Upstate，美國(guó)）抗體，Rsf-1（1∶1 000，Abcam，美國(guó)）抗體4℃孵育過(guò)夜，然后用山羊抗兔/鼠二抗羅丹明二抗孵育。細(xì)胞核采用DAPI染色，采用Radiance 2000激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss，Thornwood，美國(guó)）進(jìn)行共聚焦掃描觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌中hSNF2H和Rsf-1共定位于細(xì)胞核

對(duì)74例肺癌組織連續(xù)切片進(jìn)行免疫組化染色，分別檢測(cè)hSNF2H和Rsf-1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在連續(xù)切片中，hSNF2H和Rsf-1共定位于細(xì)胞核（圖1A）。然后，我們應(yīng)用Western blot的方法檢測(cè)了hSNF2H和Rsf-1蛋白在11種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系和正常支氣管上皮細(xì)胞系（HBE）中的表達(dá)水平（圖1B）。我們篩選出hSNF2H高表達(dá)的2個(gè)細(xì)胞系（H1299和LTE）。進(jìn)而在H1299、LTE細(xì)胞中進(jìn)行免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)，然后激光共聚焦證實(shí)Rsf-1和hSNF2H共同定位于細(xì)胞核（圖1C）。

2.2 hSNF2H在非小細(xì)胞肺癌組織中存在過(guò)表達(dá)

采用免疫組化方法檢測(cè)hSNF2H蛋白在74例非小細(xì)胞肺癌及其癌旁正常肺組織中的表達(dá)情況。hSNF2H在正常支氣管上皮及肺泡上皮均為陰性表達(dá)或弱著色，而在肺癌組織中過(guò)表達(dá)。肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為54.1%（40/74）（圖2）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明：hSNF2H的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的高TNM分期和分化正相關(guān)（P分別為0.002 0、0.037 0，表1），但與患者的年齡、性別、病理組織學(xué)類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。

3 討論

在人類癌癥中，基因擴(kuò)增是一種非常普遍的現(xiàn)象［11～14］。Rsf-1作為癌基因之一，其11q13.5區(qū)域同樣也存在著基因擴(kuò)增。有文獻(xiàn)報(bào)道，在肺癌中，存在著Rsf-1基因的擴(kuò)增。有研究表明Rsf-1蛋白或RNA水平的增高與卵巢癌有關(guān)，并且在卵巢癌中Rsf-1和hSNF2H是共同過(guò)表達(dá)的。所以我們推測(cè)，在非小細(xì)胞肺癌中Rsf-1和hSNF2H是否也存在著共同過(guò)表達(dá)呢？于是，我們?cè)?4例非小細(xì)胞肺癌患者的組織切片中進(jìn)行了免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有48例存在著hSNF2H的過(guò)表達(dá)，并且hSNF2H的過(guò)表達(dá)與TNM分期和分化相關(guān)，這表明hSNF2H與肺癌的惡性行為有關(guān)。

免疫組化連續(xù)切片及熒光雙染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rsf-1和hSNF2H存在共定位，并且Rsf-1和hSNF2H共定位于細(xì)胞核。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中存在著hSNF2H的過(guò)表達(dá)，并且hSNF2H的過(guò)表達(dá)與肺癌的高分期、低分化相關(guān)。此后，我們將進(jìn)一步研究hSNF2H在肺癌中的分子機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路，使其成為治療肺癌可能的新靶點(diǎn)。

圖1 hSNF2H和Rsf-1共定位于細(xì)胞核Fig.1 hSNF2H and Rsf-1 were co-localized in the nucleus

圖2 hSNF2H在非小細(xì)胞肺癌中存在過(guò)表達(dá)Fig.2 hSNF2H overexpressed in NSCLC

表1 hSNF2H與肺癌臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 Distribution of hSNF2H status in lung cancer according to clinicopathological characteristics

［1］Aihara T，Miyoshi Y，Koyama K，et al.Cloning and mapping of SMARCA5 encoding hSNF2H，a novel human homologue of Drosophila ISWI［J］.Cytogenet Cell Genet，1998，81（3-4）：191-193.

［2］Sumegi J，Nishio J，Nelson M，et al.A novel t（4；22）（q31；q12）produces an EWSR1-SMARCA5 fusion in extraskeletal Ewing sarcoma/ primitive neuroectodermal tumor［J］.Mod Pathol，2011，24（3）：333-342.

［3］Tai HC，Huang HY，Lee SW，et al.Associations of Rsf-1 overexpression with poor therapeutic response and worse survival in patients with nasopharyngeal carcinoma［J］.J Clin Pathol，2012，65（3）：248-253.

［4］Sheu JJ，Choi JH，Yildiz I，et al.The roles of human sucrose nonfermenting protein 2 homologue in the tumor-promoting functions of Rsf -1［J］.Cancer Res，2008，68（11）：4050-4057.

［5］Loyola A，Huang JY，LeRoy G，et al.Functional analysis of the subunits of the chromatin assembly factor RSF［J］.Mol Cell Biol，2003，23（19）：6759-6768.

［6］Mao TL，Hsu CY，Yen MJ，et al.Expression of Rsf-1，a chromatin-remodeling gene，in ovarian and breast carcinoma［J］.HumPathol，2006，37（9）：1169-1175.

［7］Holstege FC，Jennings EG，Wyrick JJ，et al.Dissecting the regulatory circuitry of a eukaryotic genome［J］.Cell，1998，95（5）：717-728.

［8］Vignali M，Hassan AH，Neely KE，et al.ATP dependent chromatinremodeling complexes［J］.Mol Cell Biol，2000，20（6）：1899-1910.

［9］Huang JY，Shen BJ，Tsai WH，et al.Functional interaction between nuclear matrix-associated HBXAP and NF-kappaB［J］.Exp Cell Res，2004，298（1）：133-143.

［10］Flanagan JF，Peterson CL.A role for the yeast SWI/SNF complex in DNA replication［J］.Nucleic Acids Res，1999，27（9）：2022-2028.

［11］Cosma MP，Tanaka T，Nasmyth K.Ordered recruitment of transcription and chromatin remodeling factors to a cell cycle-and developmentally regulated promoter［J］.Cell，1999，97（3）：299-311.

［12］Shih IM，Sheu JJ，Santillan A，et al.Amplification of a chromatin remodeling gene，Rsf-1 HBXAP，in ovarian carcinoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（39）：14004-14009.

［13］Li Q，Dong Q，Wang E.Rsf-1 is overexpressed in non-small cell lung cancers and regulates cyclinD1 expression and ERK activity［J］.BBRC，2012，420（1）：6-10.

［14］Maeda D，Chen X，Guan B，et al.Rsf-1（HBXAP）Expression is Associated With Advanced Stage and Lymph Node Metastasis in Ovarian Clear Cell Carcinoma［J］.Int J Gyne Pathol，2011，30（1）：30-35.

（編輯 裘孝琦）

Overexpression ofhSNF2Hin Non-smallCellLung Cancer

XIE Ling-ling1，JINSu-fen2，HEJia-ni1，F(xiàn)ULin1，WANGXiao-rong1，XINGJi-lin1，LIQing-chang1

（1.DepartmentofPathology，College ofBasic MedicalScience，China MedicalUniversity，Shenyang 110122，China；2.DepartmentofPathology，Anshan CentralHospital，Anshan 114001，China）

Objective To detectthe expression ofhSNF2H in non-smallcelllung cancer（NSCLC）and analyze the relationship between its expression and clinical pathological factors.MethodsImmunohistochemical methods，Western blot and immunofluorescence assay were employed to evaluate protein levels of hSNF2H in NSCLC.The co-localization of Rsf-1 and hSNF2H in the nucleus was determined.ResultshSNF2H expression was observed in the nuclear compartments of tumor cells，while normal lung tissues and the normal bronchial epithelia exhibited negative or weak expression.In 88 cases ofnon-smallcelllung cancertissues，hSNF2Hoverexpression（score≥4）was observed in 54.05%ofcases（40/74）. There were no statistical differences among hSNF2H overexpression and age（P=0.485 0），gender（P=0.159 0）or nodal status（P=0.815 0）. Strong hSNF2H expression correlated with differentiation（P=0.037 0）.Those patients with high hSNF2H expression had advanced stage of NSCLC（I&IIvs.III，P=0.002 0）.ConclusionThe hSNF2H protein wasoverexpressed in NSCLC.Strong hSNF2Hexpression is correlated with differentiation and the patients with high hSNF2H expression had advanced stage ofNSCLC.

hSNF2H；Rsf-1；NSCLC；immunohistochemistry；immunofluorescence

R36

A

0258-4646（2015）09-0833-04

謝玲玲（1986-），女，碩士研究生.

李慶昌，E-mail：liqingch@hotmail.com

2015-03-10

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