PARP-1抑制劑PJ34對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障的影響

李巖，吳捧蓮，杜良鶴，付新慧，王東玉

（1.遼寧省錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000；2.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生院，遼寧 錦州 121001）

·論著·

PARP-1抑制劑PJ34對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障的影響

李巖1，吳捧蓮2，杜良鶴2，付新慧2，王東玉1

（1.遼寧省錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000；2.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生院，遼寧 錦州 121001）

目的探討PARP-1抑制劑PJ34對(duì)大鼠局灶腦缺血再灌注損傷后血腦屏障的影響。方法線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，135只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組）、缺血再灌注模型組（IR組）、PJ34干預(yù)組（PJ34組），每組45只，每組大鼠再隨機(jī)分為3個(gè)亞組，分別在再灌注6、24和48 h時(shí)間點(diǎn)處死。測定伊文思藍(lán)（EB）含量，觀察腦組織血腦屏障通透性。免疫組織化學(xué)及Western bolt方法觀察缺血側(cè)皮層腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的活性變化。結(jié)果與sham組比較，IR組大鼠EB含量、TNF-α及MMP-9的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與IR組比較，PJ34組EB含量、TNF-α及MMP-9表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)ARP-1抑制劑PJ34對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與降低缺血側(cè)皮層TNF-α、MMP-9的表達(dá)水平，維持血腦屏障的穩(wěn)定性有關(guān)。

腦缺血再灌注；血腦屏障；PARP-1；PJ34；腫瘤壞死因子α；基質(zhì)金屬蛋白酶9

缺血性腦血管病是危害人類健康的一種常見疾病，治療關(guān)鍵在于恢復(fù)缺血腦組織的血液供應(yīng)，但不可避免會(huì)帶來再灌注損傷，再灌注損傷目前仍是臨床治療的瓶頸。腦缺血再灌損傷與血腦屏障破壞關(guān)系密切，血腦屏障通透性增加可引起嚴(yán)重的血管源性腦水腫和出血轉(zhuǎn)化等并發(fā)癥［1］。近年動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1［poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1］通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控炎性反應(yīng)、加重出血轉(zhuǎn)化等途徑加重腦缺血損傷［2～4］，但其與缺血損傷后的血腦屏障的關(guān)系國內(nèi)尚無相關(guān)報(bào)道。本研究以一種高效PARP-1抑制劑PJ34作為干預(yù)因素，利用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，觀察血腦屏障（blood brain barrier，BBB）通透性、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步探索PARP-1抑制劑的腦保護(hù)途徑，為臨床治療缺血性腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD雄性大鼠135只，體質(zhì)量250～300 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試劑

PJ34（上海藍(lán)木化工有限公司）；TNF-α、MMP-9一抗（武漢博士德生物工程有限公司）；伊文思藍(lán)（Evans blue，EB）（北京化學(xué)試劑公司）；甲酰胺（天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司提供）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組：將135只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組）、缺血再灌注組（IR組）、PJ34干預(yù)組（PJ34組），每組45只。每組又根據(jù)再灌注時(shí)間分為6 h、24 h、48 h 3個(gè)亞組。PJ34組于缺血再灌注時(shí)及再灌注后2 h腹腔注射給藥PJ34（10 mg/kg）。sham組、IR組于同時(shí)間點(diǎn)給予等劑量生理鹽水。

1.3.2 模型制備：參照改良的Longa法［5］制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈局部腦缺血再灌注模型。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，頸部正中切口，在左側(cè)肩胛舌骨肌與胸鎖乳突肌三角處暴露左頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎左頸總動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈起始端。將一端燒成圓頭（圓頭直徑約0.26～0.30 mm）的魚線經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉處通過頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，插至大腦中動(dòng)脈起始部，插入深度約為（18.0±0.5）mm。缺血2 h后，固定大鼠，輕輕提拉所留線頭，拔出10 mm，使血流再通。sham組除不插入魚線外，其余操作相同。在手術(shù)結(jié)束大鼠麻醉清醒后按Longa 5分制（0～4分）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺失程度評(píng)分。評(píng)分為1～3分的大鼠為合格腦缺血再灌注模型，對(duì)不合格大鼠所在組進(jìn)行補(bǔ)充。術(shù)后保持環(huán)境溫度在25～30℃，再灌注相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)除死大鼠。

1.3.3 EB滲透法定量分析BBB通透性變化：模型制備成功后，取腦前半小時(shí)股靜脈注射2%EB。麻醉下用肝素化的生理鹽水對(duì)大鼠進(jìn)行心臟灌流，直至右心房流出清澈液體后斷頭取腦。腦組織稱重，浸入甲酰胺（100 mg/mL），置于60℃水浴箱內(nèi)孵育24 h。用分光光度計(jì)檢測波長為620 nm的吸光度，根據(jù)繪制的EB標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析染料的含量。

1.3.4 TNF-α和MMP-9免疫組化檢測：在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)將大鼠以10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，快速打開胸腔，經(jīng)左心室灌流內(nèi)固定后，斷頭取腦，在視交叉前2 mm及視交叉后2 mm處冠狀切面切開，取中間腦組織放入相同固定液中繼續(xù)外固定，4℃過夜，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，連續(xù)冠狀切片（厚5 μm），每隔5片取1片，用SABC免疫組化染色法檢測TNF-α、MMP-9的表達(dá)。免疫組化染色操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，陰性對(duì)照以PBS代替TNF-α、MMP-9一抗。光鏡下觀察TNF-α和MMP-9的表達(dá)和分布，400倍光鏡下隨機(jī)選取缺血側(cè)額葉皮層3個(gè)視野，計(jì)算平均積分光密度值（mean oprieal density，MOD）。

1.3.5 Western blot檢測TNF-α和MMP-9：取缺血側(cè)視交叉后2 mm皮層腦組織用于Western blot檢測。將腦組織剪成碎塊，加入0.3 mL裂解液，超聲波細(xì)胞破碎20 s。5℃、12 000 r/min、離心30 min，取上清分裝50 μL/管，用Bradford蛋白染色法檢測蛋白含量。將上樣緩沖液60 μL與30 μL樣品上清裂解液混合，混勻后沸水浴上煮沸5 min。制備10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔加變性后的總蛋白含量皆為50 μg。在100 V下電泳，至溴酚蘭到凝膠底部。電壓80 V恒壓，1.5 h后將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉緩沖液室溫封閉1 h。加入抗體4℃孵育過夜，加入辣根酶標(biāo)記過的二抗，室溫振蕩孵育1 h。用ECL試劑盒顯色，用發(fā)光法進(jìn)行X線膠片曝光，然后進(jìn)行條帶掃描和分析TNF-α和MMP-9的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BBB通透性（通過檢測EB含量）

結(jié)果表明，IR組及PJ34組內(nèi)，隨缺血再灌注時(shí)間延長，腦內(nèi)EB含量逐漸增多，48 h達(dá)高峰；與sham組比較，IR組腦內(nèi)EB含量明顯增多（P＜0.01），48 h時(shí)間點(diǎn)增加最多（P＜0.01）；與IR組比較，PJ34組的腦內(nèi)EB含量明顯減少，以48 h時(shí)間點(diǎn)減少幅度最大（P＜0.05）。見表1。

2.2 免疫組化染色檢測各組大鼠TNF-α和MMP-9蛋白分布與表達(dá)

2.2.1 TNF-α免疫組化染色：TNF-α陽性表達(dá)為缺血側(cè)皮層細(xì)胞質(zhì)棕黃色著色（圖1）。與sham組比較，IR組和PJ34組TNF-α表達(dá)增加，24 h時(shí)間點(diǎn)增加到最多（P＜0.01）；與IR組比較，PJ34組TNF-α表達(dá)減少（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠EB含量、缺血側(cè)皮層MMP-9和TNF-α MOD值及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Tab.1 Comparison of the EB content of brain，the MOD values and the relative protein expression of TNF-α and MMP-9 in the ischemic cortex of rats

圖1 免疫組化法檢測缺血再灌注皮層TNF-α的表達(dá)與分布 ×400Fig.1 Immunohistochemical staining showing the expression of TNF-α in the ischemia-reperfusion cortical of rats×400

2.2.2 MMP-9免疫組化染色：MMP-9陽性表達(dá)為缺血側(cè)皮層細(xì)胞質(zhì)棕黃色著色（圖2）。與sham組比較，IR組和PJ34組MMP-9表達(dá)增加，并隨時(shí)間呈遞增趨勢，48 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)高峰（P＜0.01）；與IR組比較，PJ34組MMP-9表達(dá)減少（P＜0.05）。見表1。

2.3 Western bolt檢測各組大鼠缺血側(cè)皮層TNF-α和MMP-9蛋白含量

2.3.1 TNF-α蛋白含量：與sham組比較，IR組和PJ34組TNF-α蛋白表達(dá)量增加，24 h時(shí)間點(diǎn)增加最多（P＜0.01）；與IR組比較，PJ34組TNF-α蛋白表達(dá)量減少（P＜0.05）。見表1、圖3。

2.3.2 MMP-9蛋白含量：與sham組比較，IR組及PJ34組MMP-9蛋白表達(dá)量增加，并隨時(shí)間呈遞增趨勢，48 h時(shí)間點(diǎn)增加最多（P＜0.01）；與IR組比較，PJ34組MMP-9蛋白表達(dá)量減少（P＜0.05）。見表1、圖3。

圖2 免疫組化法檢測缺血再灌注皮層MMP-9的表達(dá)與分布 ×400Fig.2 Immunohistochemical staining showing the expression of MMP-9 in the ischemia-reperfusion cortical of rats×400

圖3 Western blot法檢測大鼠腦缺血再灌注皮層TNF-α和MMP-9蛋白的表達(dá)水平Fig.3 Western blot analysis of the TNF-α and MMP-9 protein expression in the ischemia-reperfusion cortical of rats

3 討論

PARP是一類單體蛋白酶，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，PARP抑制劑PJ34能抑制缺血后誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活［5］，減少炎性因子TNF-α、白細(xì)胞介素6表達(dá)［6］，發(fā)揮腦保護(hù)作用。而缺血后炎性因子的過度表達(dá)，能加重BBB通透性，后者又可進(jìn)一步增加血液中白細(xì)胞入侵腦組織，加重炎性反應(yīng)，形成惡性循環(huán)［7］。Wu等［8］利用帕金森模型，研究表明應(yīng)用PARP抑制劑3-AB能減少TNF-α、白細(xì)胞介素1β的表達(dá)，增加緊密連接蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的表達(dá)，降低BBB的通透性。本研究制備大鼠腦缺血再灌注模型后，腦內(nèi)TNF-α表達(dá)迅速增加，BBB通透性顯著提高，應(yīng)用PJ34干預(yù)后TNF-α表達(dá)下降，BBB通透性減少，提示PJ34通過調(diào)節(jié)TNF-α的表達(dá)，影響B(tài)BB。

在本研究中，TNF-α表達(dá)高峰在缺血再灌注24 h，而BBB通透性高峰在缺血再灌注48 h或48 h之后，二者達(dá)峰時(shí)間不一致，推測TNF-α間接影響B(tài)BB。為進(jìn)一步檢測PJ34對(duì)BBB的影響，本研究選擇MMP-9作為檢測指標(biāo)。有研究表明，MMP-9是降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的重要蛋白水解酶，而細(xì)胞外基質(zhì)是維持BBB完整性的重要結(jié)構(gòu)，因此調(diào)控MMP-9對(duì)腦缺血再灌注損傷后BBB通透性改變至關(guān)重要［9］。MMP-9的生物活性受基因轉(zhuǎn)錄、酶的活化等多種因素調(diào)控，既往在動(dòng)物腸黏膜炎的模型研究中表明，TNF-α是MMP-9的重要的誘導(dǎo)因子，能在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)MMP-9的表達(dá)［10］。Lescot等［11］應(yīng)用外傷性腦損傷大鼠模型研究PARP-1參與外傷后BBB通透性的改變，發(fā)現(xiàn)PAPR-1抑制劑3-AB能下調(diào)MMP-9的表達(dá)，減輕外傷后血腦屏障通透性。本研究證實(shí)在腦缺血再灌注損傷早期（48 h內(nèi)），MMP-9的表達(dá)上調(diào)，BBB通透性也增加，且MMP-9的活性與BBB開放程度趨勢相一致，推測MMP-9直接參與腦缺血再灌注后BBB的破壞，這與已往的研究結(jié)果一致［12］，且其表達(dá)高峰在TNF-α之后，提示在腦缺血再灌注損傷模型中，TNF-α同樣是MMP-9的誘導(dǎo)因子。應(yīng)用PJ34干預(yù)后，腦內(nèi)TNF-α和MMP-9的表達(dá)都降低，推測PJ34通過調(diào)控TNF-α影響MMP-9的活性。

綜上所述，在腦缺血再灌注后應(yīng)用PJ34干預(yù)后，抑制炎性因子TNF-α的表達(dá)，TNF-α的表達(dá)下降誘導(dǎo)MMP-9的活性降低，從而減少對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分的分解，降低BBB通透性，對(duì)腦再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。PARP抑制劑的臨床應(yīng)用將為腦缺血再灌注損傷的治療提供一個(gè)新思路。

參考文獻(xiàn)：

［1］Yang Y，Rosenberg GA.Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease［J］.Stroke，2011，42（11）：3323-3328.

［2］Cozzi A，Cipriani G，F(xiàn)ossati S，et al.Poly（ADP-ribose）accumulation and enhancement of postischemic brain damage in 110-kDa poly（ADP-ribose）glycolhydrolase null mice［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26（5）：684-695.

［3］Hamby AM，Suh SW，Kauppinen TM，et al.Use of a poly（ADP-ribose）polymerase inhibitor to suppress inflammation and neuronal death after cerebral ischemia-reperfusion［J］.Stroke，2007，38（2 Suppl）：632-636.

［4］Haddad M，Beray-Berthat V，Coqueran B，et al.Reduction of hemorrhagic transformation by PJ34，a poly（ADP-ribose）polymerase inhibitor，after permanent focal cerebral ischemia in mice［J］.Eur J Pharmacol，2008，588（1）：52-57.

［5］Wang J，Yang Z，Liu C，et al.Activated microglia provide a neuroprotective role by balancing glial cell-line derived neurotrophic factor and tumor necrosis factor-α secretion after subacute cerebral ischemia［J］.Int J Mol Med，2013，31（1）：172-178.

［6］Haddad M，Rhinn H，Bloquel C，et al.Anti-inflammatory effects of PJ34，a poly（ADP-ribose）polymerase inhibitor，in transient focal cerebral ischemia in mice［J］.Br J Pharmacol，2006，149（1）：23-30.

［7］Kelly MA，Shuail A，Todd KG.Matrix metalloproteinase activation and blood-brain barrier breakdown following thrombolysis［J］.Exp Neurol，2006，200（1）：38-49.

［8］Wu XL，Wang P，Liu YH，et al.Effects of Poly（ADP-ribose）polymerase inhibitor 3-aminobenzamide on blood-brain barrier and dopaminergic neurons of rats with lipopolysaccharide-induced parkinson’s disease［J］.J Mol Neurosci，2014，53（1）：1-9.

［9］Piao MS，Lee JK，Park CS，et al.Early activation of matrix metalloproteinase-9 is associated with blood-brain barrier disruption after photothrombotic cerebral ischemia in rats［J］.Acta Neurochir，2009，151（12）：1649-1653.

［10］de Araújo RF Jr，Reinaldo MP，Brito GA，et al.Olmesartan decreased levels of IL-1β and TNF-α，down-regulated MMP-2，MMP-9，COX-2，RANK/RANKL and up-regulated SOCs-1 in an intestinal mucositis model［J］.PLoS One，2014，9（12）：e114923.

［11］Lescot T，F(xiàn)ulla-Oller L，Palmier B，et al.Effect of acute poly（ADP-ribose）polymerase inhibition by 3-AB on blood-brain barrier permeability and edema formation after focal traumatic brain injury in rats［J］.J Neurotrauma，2010，27（6）：1069-1079.

［12］Kelly MA，Shuail A，Todd KG.Matrix metalloproteinase activation and blood-brain barrier breakdown following thrombolysis［J］.Exp Neurol，2006，200（1）：38-49.

（編輯 陳 姜）

Influence of Poly（ADP-ribose）Polymerase Inhibitor PJ34 on Blood Brain Barrier in Ratswith CerebralIschemia-reperfusion Injury

LIYan1，WUPeng-lian2，DU Liang-he2，F(xiàn)U Xin-hui2，WANG Dong-yu1

（1.DepartmentofNeurology，Jinzhou CentralHospital，Jinzhou 121000，China；2.Graduate School，Liaoning MedicalUniversity，Jinzhou 121001，China）

Objective To investigate the influence ofpoly（ADP-ribose）polymerase inhibitorPJ34 on blood brain barrier（BBB）in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.MethodsRat model of cerebral ischemia-reperfusion injury was established by the middle cerebral artery occlusion.A total of 135 SD rats were randomly divided into 3 groups：sham-operated group（sham group），ischemia-reperfusion group（IR group）and PJ34 group（PJ34 group）.45 animalsin each group were then equally divided into subgroups and the rats were sacrificed at6 h，24 h，48 h afterreperfusion，respectively.BBB permeability was evaluated by detection of extravasated Evans blue（EB）.The expression of tumor necrosis factor α（TNF-α）and matrix metalloproteinase 9（MMP-9）activity were measured by immunohistochemistry and Western blotatdifferenttime points.ResultsCompared with sham group，the contents of EB and the expressions of TNF-α and MMP-9 in IR group were increased significantly（P＜0.05）.Compared with IR group，the contents of EB and the expressions of TNF-α and MMP-9 in PJ34 group were markedly decreased at the same time point（P＜0.05）.ConclusionThe presentstudy provided in vivo evidence thatPARPinhibitor PJ34 can protectagainstcerebralischemia reperfusion injury，and the mechanism might be related to maintaining the stability of blood-brain barrier by suppressing the expression of TNF-α and MMP-9 in ischemic cortex.

ischemia-reperfusion；blood brain barrier；poly（ADP-ribose）polymerase-1；PJ34；tumor necrosis factor α；matrix metalloproteinase 9

R743.3

A

0258-4646（2015）08-0709-05

遼寧省自然科學(xué)基金（201102074）

李巖（1980-），女，主治醫(yī)師，碩士.

王東玉，E-mail：1448219167@qq.com

2015-02-28

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：