色氨酸羥化酶基因A218C多態(tài)性對(duì)抑制控制影響的事件相關(guān)電位研究

劉 永，詹向紅，韓賀云，王慧霞，閆秀娟，侯俊林，王友杰

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250300；2. 河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450008)

論 著

色氨酸羥化酶基因A218C多態(tài)性對(duì)抑制控制影響的事件相關(guān)電位研究

劉 永1，2，詹向紅2，韓賀云2，王慧霞2，閆秀娟2，侯俊林2，王友杰2

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250300；2. 河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450008)

目的 應(yīng)用事件相關(guān)電位技術(shù),檢測(cè)不同色氨酸羥化酶(TPH)基因A218C多態(tài)性被試抑制控制的腦電特征。方法 以51名在校正常大學(xué)生為受試者,PCR-LDR法測(cè)定受試者基因型(AA/AC/CC),采用Go/Nogo范式,由Neuroscan系統(tǒng)記錄并分析受試者腦電特征,比較不同基因型受試者的腦電成分。結(jié)果 不同基因型受試者Go/Nogo任務(wù)的行為反應(yīng)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同基因型受試者N2差異波幅比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P3波幅、N2成分波幅和潛伏期比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 不同色氨酸羥化酶基因A218C多態(tài)性對(duì)大腦信息加工和處理過(guò)程產(chǎn)生了影響,不同基因型影響對(duì)刺激的監(jiān)控過(guò)程,具有不同的腦電活動(dòng)特征。

色氨酸羥化酶多態(tài)性;連接酶特異檢測(cè)反應(yīng);事件相關(guān)電位;執(zhí)行功能;抑制控制

情緒個(gè)體差異的遺傳背景受到越來(lái)越多的關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn)情緒的產(chǎn)生、表達(dá)和控制受到遺傳因素的影響。基因多態(tài)性是指DNA堿基序列的差異,這種差異在群體中出現(xiàn)的頻率大于1%,且以孟德?tīng)栠z傳方式遺傳。色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)是5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)合成的限速酶，定位于人類(lèi)11號(hào)染色體短臂上，TPH基因中存在一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)A218C，研究報(bào)道其與自殺沖動(dòng)等多種情緒精神障礙的發(fā)生相關(guān)[1-2]，也與憤怒特質(zhì)相關(guān)[3]。憤怒、抑郁情緒等的產(chǎn)生均與抑制控制密切相關(guān)[4]。為探討TPH基因多態(tài)性對(duì)情緒的影響是否與人的抑制控制能力有關(guān)，本研究選擇事件相關(guān)電位技術(shù)(event related potentials,ERPs)考察了不同TPH基因型受試者抑制控制的能力，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 研究資料

1.1研究對(duì)象 經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后招募在校正常大學(xué)生51人為受試者,填寫(xiě)知情同意書(shū)及一般情況調(diào)查表，參考文獻(xiàn)[5]方法設(shè)立入組及排除標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試驗(yàn)程序和任務(wù) 刺激由E-prime 2.0系統(tǒng)控制呈現(xiàn)。參考文獻(xiàn)[6]做法,以黑色單/雙三角形構(gòu)成Go/Nogo任務(wù)刺激圖形,共8組刺激,每組含100個(gè)試次,其中Go任務(wù)為60個(gè),Nogo任務(wù)為40個(gè)。要求受試者Go任務(wù)時(shí)做按鍵反應(yīng),出現(xiàn)Nogo任務(wù)則不做任何反應(yīng)，按鍵手在受試者中交叉以平衡左右手動(dòng)作對(duì)腦電的影響。整個(gè)實(shí)驗(yàn)約需要20 min,實(shí)驗(yàn)完成后給予被試一定酬勞。

1.3 數(shù)據(jù)采集與處理 采用NuAmps 40導(dǎo)系統(tǒng)(Neuroscan Inc)記錄腦電圖(EEG)，同步記錄連續(xù)EEG與行為學(xué)數(shù)據(jù)。用Neuroscan 4.5軟件對(duì)腦電數(shù)據(jù)進(jìn)行離線分析。對(duì)反應(yīng)正確的EEG進(jìn)行分類(lèi)疊加,得到Go和Nogo刺激產(chǎn)生的兩類(lèi)ERPs數(shù)據(jù)，對(duì)得到的ERPs進(jìn)行30 Hz(24 dB/oct)無(wú)相移低通數(shù)字濾波。

1.4 基因分型 采用PCR-LDR法進(jìn)行基因分型。聘請(qǐng)檢驗(yàn)科護(hù)士采血,以血樣白細(xì)胞基因組DNA為模板,擴(kuò)增目的基因片段。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物序列為5’-GCA TTT AGA ATG GTA CCT GGC-3’，5’-CAC CAC TCG ATG CAA CAT TTG-3’。PCR反應(yīng)體系:模板DNA 1 μL,10×PCR buffer 1.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL,dNTP(10 mmol/L)0.3 μL，Taq酶1.25 IU,引物各0.25 μL,使用去離子水補(bǔ)足體積至25 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)連接酶特異檢測(cè)反應(yīng)(LDR)檢測(cè)基因多態(tài)性位點(diǎn)。針對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)識(shí)別兩種不同堿基的左端探針(長(zhǎng)度相差3 bp)以及帶熒光(FAM)的右端共用探針,終產(chǎn)物長(zhǎng)度差別即為左端探針的長(zhǎng)度差別。LDR探針序列為右端公用探針P-TAG CTG CTA TTC TGA GCA TAG GGA A-FAM；左端探針TA：TAT TAA TTG ACA ACC TAT TAC GTG A，連接產(chǎn)物為50/A；左端探針TC：TTT TAT TAA TTG ACA ACC TAT TAC GTG C,連接產(chǎn)物為53/C。10 μL連接體系為：PCR產(chǎn)物3 μL、10×Taq DNA ligase buffer 1 μL、Taq DNA ligase 5 IU,特定LDR探針各0.1 pmol,去離子水補(bǔ)足體積至10 μL。連接反應(yīng)參數(shù):94 ℃變性30 s、60 ℃退火并連接3 min,循環(huán)20次。反應(yīng)結(jié)束后,4 ℃保存待用。取1 μL連接反應(yīng)產(chǎn)物,加10 μL上樣buffer(已混入MarKer),95 ℃變性3 min,立即冰水浴。連接產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730XL測(cè)序儀掃描,根據(jù)目的峰與MarKer的位置差距來(lái)讀取結(jié)果(上海捷瑞生物工程有限公司合成引物并完成測(cè)定)。最終各基因型納入受試者AA型14人,AC型22人,CC型15人。

1.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。導(dǎo)出行為學(xué)數(shù)據(jù)(反應(yīng)時(shí)、正確率)進(jìn)行單因素方差分析。對(duì)于EEG結(jié)果本研究主要對(duì)中線的5個(gè)電極位點(diǎn)(Fz、Fcz、Cz、Cpz和Pz)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以刺激出現(xiàn)后200～300 ms時(shí)間窗內(nèi)最大負(fù)向波峰值及其出現(xiàn)時(shí)間為N2幅值和潛伏期，300～500 ms時(shí)間窗內(nèi)最大正向波峰值及出現(xiàn)時(shí)間為P3的幅值和潛伏期。為了強(qiáng)調(diào)Nogo效應(yīng)和進(jìn)行組間比較,研究使用相減技術(shù)從Nogo成分中減去Go成分,分別獲得N2和P3的差異波(N2d和P3 d),以刺激出現(xiàn)后200～300 ms、300～500 ms時(shí)間窗內(nèi)N2d和P3d的面積作為Nogo效應(yīng)的指標(biāo)[7]。分別對(duì)N2、P3 峰潛伏期和波幅以及差異波進(jìn)行混合重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析。重復(fù)測(cè)量方差分析的P值采用Greenhouse-Geisser法校正。在以上所有統(tǒng)計(jì)分析中,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同基因型受試者行為學(xué)數(shù)據(jù) 不同基因型受試者正確率、反應(yīng)時(shí)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 不同基因型受試者行為數(shù)據(jù)比較

2.2 不同基因型受試者ERPs分析 不同基因型在不同刺激條件下產(chǎn)生的N2、P3成分及差異波成分見(jiàn)圖1～3。

圖1 不同基因型受試者Go刺激下產(chǎn)生的ERPs成分(額中央?yún)^(qū)Fcz)

圖2 不同基因型受試者在Nogo刺激下產(chǎn)生的ERPs成分(額中央?yún)^(qū)Fcz)

圖3 不同基因型受試者ERPs差異波成分(額中央?yún)^(qū)Fcz)

2.2.1 潛伏期 不同基因型組間Go和Nogo 刺激產(chǎn)生的N2成分及反應(yīng)類(lèi)型間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(2,48)=0.277,P=0.759,η2=0.011；F(1,48)=0.137,P=0.713,η2=0.003]；不同組間Go和Nogo刺激產(chǎn)生的P3成分潛伏期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(2,48)=2.705,P=0.077,η2=0.101],但反應(yīng)類(lèi)型間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(1,48)=10.526,P=0.002,η2=0.180],事后檢驗(yàn)顯示Nogo效應(yīng)峰潛伏期(390.34±4.29)ms較Go效應(yīng)峰潛伏期[(376.98±5.17)ms]長(zhǎng)。

2.2.2 波幅 各基因受試者在不同刺激條件下產(chǎn)生的N2成分波幅比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(2,48)=1.075,P=0.349,η2=0.043]，反應(yīng)類(lèi)型間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(1,48)=108.08,P=0.000,η2=0.692]，事后檢驗(yàn)表明Nogo效應(yīng)N2波幅較大[(-2.75±0.59)μV]，Go效應(yīng)波幅較小[(0.07±0.60)μV](N2波為負(fù)向波)；不同基因型間與反應(yīng)類(lèi)型間交互效應(yīng)顯著[F(2,48)=7.50,P=0.001,η2=0.238]，簡(jiǎn)單效應(yīng)分析顯示Nogo任務(wù)中AC型和CC型波幅比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032)；不同基因型受試者Nogo任務(wù)波幅均大于Go任務(wù)。不同基因型受試者在不同刺激條件下產(chǎn)生的P3成分波幅比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(2,48)=2.673,P=0.079,η2=0.100]；反應(yīng)類(lèi)型間效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(1,48)=14.19,P=0.000,η2=0.228]，事后檢驗(yàn)表明Nogo效應(yīng)P3波幅較大[(8.51±0.57)μV]，Go效應(yīng)波幅較小[(7.23±0.56)μV](P3波為正向波)；不同基因型間與反應(yīng)類(lèi)型間交互效應(yīng)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(2,48)=0.816,P=0.448,η2=0.033]。

2.2.3 N2d面積 中線部位5個(gè)電極的N2d面積不同基因型間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(2,48)=7.248,P=0.002,η2=0.232] ，事后檢驗(yàn)表明CC型N2d面積最大為-336.50±35.17，AC型和AA型的N2d面積分別為-214.65±29.04和-148.14±36.40。中線部位5個(gè)電極的P3d面積不同基因型間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(2,48)=1.720,P=0.190,η2=0.067]。

3 討 論

執(zhí)行功能是指在完成復(fù)雜的認(rèn)知任務(wù)時(shí),對(duì)各種認(rèn)知過(guò)程進(jìn)行協(xié)調(diào),以保證認(rèn)知系統(tǒng)以靈活、優(yōu)化的方式實(shí)行特定目標(biāo)的一般性控制機(jī)制；其本質(zhì)就是對(duì)其他認(rèn)知過(guò)程進(jìn)行控制和調(diào)節(jié)。執(zhí)行功能的主要成分包括抑制控制、轉(zhuǎn)換和刷新等,其中抑制控制是執(zhí)行功能的核心成分[8-9]。前期研究表明TPH基因A218C多態(tài)性與憤怒等情緒產(chǎn)生與表達(dá)的差異性相關(guān)[10-11]。個(gè)體憤怒特質(zhì)與攻擊、自殺等行為關(guān)系密切,高特質(zhì)憤怒個(gè)體在敵意情境下會(huì)表現(xiàn)出更多的攻擊傾向,而攻擊等與執(zhí)行功能尤其是抑制控制功能呈負(fù)相關(guān)[12]。那么TPH 基因A218C多態(tài)性對(duì)憤怒情緒產(chǎn)生和表達(dá)的影響是不是通過(guò)影響執(zhí)行功能而實(shí)現(xiàn)的是當(dāng)前需要解決的問(wèn)題。

事件相關(guān)電位具有較高的時(shí)間分辨率和一定的空間分辨率。大量研究表明,Go/Nogo任務(wù)可以用來(lái)檢測(cè)抑制控制[13-16]。在Go/Nogo任務(wù)中受試者需要對(duì)靶刺激作出反應(yīng)而抑制對(duì)非靶刺激的反應(yīng)沖動(dòng)。該任務(wù)產(chǎn)生2個(gè)主要腦電成分,第1個(gè)是波峰在200～300 ms潛伏期內(nèi)的Nogo-N2成分，第2個(gè)是波峰在300～500 ms潛伏期內(nèi)的Nogo-P3成分。這2個(gè)ERPs成分都被認(rèn)為與抑制控制有關(guān)。N2波反映了對(duì)刺激信息的監(jiān)測(cè), 包括對(duì)新異刺激的察覺(jué)和對(duì)視覺(jué)注意資源的分配等[17]。Nieuwenhuis等[18]報(bào)道N2波幅在低頻刺激下增大且定位于前扣帶回,認(rèn)為Nogo-N2代表了信息輸入及加工過(guò)程中干擾信息的監(jiān)測(cè)。Kok等[19]在Stop-Signal任務(wù)發(fā)現(xiàn)正確的Nogo試次明顯比錯(cuò)誤的Nogo試次誘發(fā)出來(lái)的Nogo-P3大，認(rèn)為前中央部誘發(fā)出來(lái)的Nogo-P3增大反映了反應(yīng)抑制過(guò)程。盡管兩成分的心理過(guò)程沒(méi)有最終確定,但可以認(rèn)為Nogo-N2和Nogo-P3可能分別代表了與抑制控制有關(guān)的2個(gè)加工過(guò)程——沖突監(jiān)測(cè)[20]和反應(yīng)抑制[21]。本研究結(jié)果顯示，不同基因型受試者Go/Nogo任務(wù)的行為反應(yīng)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)Go/Nogo任務(wù)比較簡(jiǎn)單所致。從ERPs數(shù)據(jù)來(lái)看,受試者在Nogo試次的N2及P3波波幅均較大,表明本次研究成功誘發(fā)出了Nogo效應(yīng)。N2波不同基因型間與反應(yīng)類(lèi)型間交互效應(yīng)顯著，簡(jiǎn)單效應(yīng)分析顯示Nogo任務(wù)中AC型和CC型波幅比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另外N2d比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CC型波幅最大，而AA型波幅較小,顯示受試者在認(rèn)知信息加工處理過(guò)程中具有不同的腦電活動(dòng)特征。不同基因型受試者N2d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，N2d是Nogo任務(wù)減去Go任務(wù)后的差異波，相減后的成分被認(rèn)為代表了純粹的抑制控制腦電成分，因此該結(jié)果表明不同基因型受試者的抑制控制能力存在不同，CC型最強(qiáng)而AA型最弱。但不同基因型受試者P3成分及差異波的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明不同TPH A218C基因多態(tài)性對(duì)大腦后期信息加工和處理過(guò)程影響不顯著。因此可認(rèn)為不同基因型受試者對(duì)刺激信息的監(jiān)測(cè)存在差異,不同基因型影響對(duì)刺激的監(jiān)控過(guò)程具有不同的腦電活動(dòng)特征。

[1] González-Castro TB, Juárez-Rojop I, López-Narváez ML，et al. Association of TPH-1 and TPH-2 gene polymorphisms with suicidal behavior：a systematic review and meta-analysis[J]. BMC Psychiatry，2014，14:196

[2] Koh KB，Choi EH，Lee YJ,et al. Serotonin-related gene pathways associated with undifferentiated somatoform disorder[J]. Psychiatry Res，2011，189(2):246-250

[3] 侯俊林，詹向紅，劉永，等. TPH基因A218C多態(tài)性與憤怒啟動(dòng)及控制特質(zhì)的關(guān)系[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(7):1801-1804

[4] Adler LA,Dirks B,Deas PF,et al. Lisdexamfetamine dimesylate in adults with attention-deficit/ hyperactivity disorder who report clinically significant impairment in executive function:results from a randomized, double-blind, placebo-controlled study[J]. J Clin Psychiatry，2013，74(7):694-702

[5] Yang B,Yang S,Zhao L,et al. Event-related potentials in a Go/Nogo task of abnormal response inhibition in heroin addicts[J]. Sci China C Life Sci, 2009，52(8):780-788[6] 張炳蔚,許晶,趙侖. 晚發(fā)性抑郁患者情緒調(diào)節(jié)機(jī)制的ERPs研究[J]. 航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程,2006，19(2):150-152

[7] Gajewski PD,Falkenstein M. Effects of task complexity on ERP components in Go/Nogo tasks[J]. Int J Psychophysiol，2013，87(3):273-278

[8] Selemon LD. A role for synaptic plasticity in the adolescent development of executive function[J]. Transl Psychiatry，2013，3:e238

[9] Chiu YC,Egner T. Inhibition-induced forgetting:when more control leads to less memory[J]. Psychol Sci，2015，26(1)：27-38

[10] 侯俊林,詹向紅,劉永,等. TPH基因A218C多態(tài)性與憤怒啟動(dòng)及控制特質(zhì)的關(guān)系[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2012,27(7):1801-1804

[11] 詹向紅,侯俊林,閆秀娟,等. 色氨酸羥化酶A218C多態(tài)性與憤怒啟動(dòng)及表達(dá)特質(zhì)的關(guān)系[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(7):2001-2004

[12] Potegal M. Temporal and frontal lobe initiation and regulation of the top-down escalation of anger and aggression[J]. Behav Brain Res，2012，231(2):386-395

[13] Moreno S,Wodniecka Z,Tays W,et al. Inhibitory control in bilinguals and musicians: event related potential (ERP) evidence for experience-specific effects[J]. PLoS One，2014，9(4):e94169

[14] Woltering S,Liu Z,Rokeach A,et al. Neurophysiological differences in inhibitory control between adults with ADHD and their peers[J]. Neuropsychologia，2013，51(10):1888-1895

[15] Covey TJ,Shucard JL,Violanti JM,et al. The effects of exposure to traumatic stressors on inhibitory control in police officers: a dense electrode array study using a Go/NoGo continuous performance task[J]. Int J Psychophysiol，2013，87(3):363-75

[16] Benikos N,Johnstone SJ,Roodenrys SJ. Varying task difficulty in the Go/Nogo task: the effects of inhibitory control, arousal, and perceived effort on ERP components[J]. Int J Psychophysiol，2013，87(3):262-272

[17] Folstein JR,Van Petten C. Influence of cognitive control and mismatch on the N2 component of the ERP:a review[J]. Psychophysiology，2008，45(1):152-170

[18] Nieuwenhuis S,Yeung N,van den Wildenberg W,et al. Electrophysiological correlates of anterior cingulate function in a go/no-go task:effects of response conflict and trial type frequency[J]. Cogn Affect Behav Neurosci，2003，3(1):17-26

[19] Kok A,Ramautar JR,De Ruiter MB,et al. ERP components associated with successful and unsuccessful stopping in a stop-signal task[J]. Psychophysiology,2004，41(1):9-20

[20] Wang S,Hui N,Zhou X,et al. Neural mechanisms underlying conflict monitoring over risky decision alternatives:evidence from ERP in a Go/Nogo task[J]. J Integr Neurosci，2014，13(3):497-508

[21] Cid-Fernandez S1,Lindin M,Diaz F. Effects of amnestic mild cognitive impairment on N2 and P3 Go/NoGo ERP components[J]. J Alzheimers Dis，2014，38(2):295-306

Association study on tryptophan hydroxylase gene A218C polymorphism and inhibitory control: an ERPs study

LIU Yong1,2, ZHAN Xianghong2, HAN Heyun2, WANG Huixia2, YAN Xiujuan2, HOU Junlin2, WANG Youjie2

(1.School of Basic Medicine，Shandong University of TCM，Ji’nan 250300，Shandong，China；2. School of Basic Medicine，He’nan College of TCM，Zhengzhou 450008, He’nan, China)

Objective It is to observe the association on tryptophan hydroxylase gene A218C polymorphism and inhibitory control by event related potentials(ERPs). Methods 51 healthy undergraduates at school were selected as subjects, behavioral data and ERPs data relevant to a visual Go/Nogo task were recorded and analyzed by Neuroscan system. The participants were assigned to 3 groups(AA/AC/CC)by their single nucleotide polymorphism type. Results No significant difference was found in either reaction time or accuracy of Nogo task among different gene type subjects(P>0.05). The N2 Difference Wave (Nogo minus Go)amplitudes showed a significant difference among different gene type subjects. No significant difference was found in the P3 amplitude, N2 component amplitude,latency among different gene type subjects. Conclusion The TPH A218C polymorphism participates in the process of cognitive control, different gene type can effect the conflict monitoring of novel stimuli with different electrical activity features.

tryptophan hydroxylase polymorphism；ligase detection reaction；event related potentials；executive function；inhibitory control

劉永,男,講師,博士在讀,研究方向?yàn)榍橹九c衰老及相關(guān)疾病的機(jī)制研究。

詹向紅，E-mail：zxh371@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30772686；30973695)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.11.001

R596

A

1008-8849(2015)11-1141-04

2014-12-30