楊德敏　劉良波

摘要：為建立動物組織中氯霉素殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，以氯霉素-D5為內(nèi)標(biāo)，乙腈和4% NaCl溶液渦旋振蕩提取動物組織中氯霉素，正己烷除去脂溶性雜質(zhì)，再用水飽和乙酸乙酯液液萃取， 濃縮后HLB小柱凈化，甲醇：水（50：50）定容，HPLC-MS/MS測定。采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式檢測，用氯霉素-D5作內(nèi)標(biāo)來定量。 結(jié)果表明，氯霉素檢測的線性范圍為0.5～10.0 μg/kg，r2=0.999 1，加標(biāo)水平為0.2、0.4、1.0μg/kg時(shí)，平均回收率72.40%～114.20%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11%，氯霉素的定量檢測下限為0.2μg/kg 。說明該方法基質(zhì)影響小，檢測靈敏度高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，回收率好，適用于動物組織中氯霉素殘留的檢測。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）；動物組織；氯霉素；殘留

中圖分類號：R978.1+3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）11-0014-02

氯霉素（Chloramphenicol）屬廣譜抗生素，曾在畜牧業(yè)中廣為應(yīng)用，但在動物可食組織中的殘留會通過食物鏈傳給人類，長期微量攝入，不僅使人體腸道正常菌群失調(diào)[1]，而且還會抑制人體骨髓造血功能導(dǎo)致引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病[2]。氯霉素殘留問題已引起國際組織和世界上許多國家和地區(qū)的高度重視，歐盟、美國等均在法規(guī)中規(guī)定氯霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”，即不得檢出。近年來，我國出口到歐盟、美國等地區(qū)的畜禽、水產(chǎn)品等多次因?yàn)槁让顾爻瑯?biāo)被限制，損失達(dá)到數(shù)十億美元。我國禁止使用氯霉素，但仍存在用氯霉素治療畜禽、水產(chǎn)品疾病的現(xiàn)象。

目前國內(nèi)外對氯霉素殘留的研究集中在畜禽肌肉、水產(chǎn)品、蝦及牛奶等的測定[3-6]，常用的檢測方法包括氣相色譜法、高效液相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，現(xiàn)在多采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法（HPLC-MS/MS）。為了保障我國人民的健康及擴(kuò)大動物性食品的貿(mào)易往來，有必要建立動物組織中氯霉素殘留量專屬、靈敏、定性、定量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

畜禽肉類，取可食用肌肉組織；畜禽肝臟可取整塊；水產(chǎn)品類去皮后，取魚肉部分，用高速勻漿機(jī)將其均質(zhì)。

1.2 儀器和試劑

儀器：液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀Quattro Premier XE（美國Waters公司）；去離子水發(fā)生器；TL-18M型高速冷凍離心機(jī)；BS210S型電子天平（北京startorius公司）；OA-SYS型恒溫水浴氮吹濃縮儀；MS1/MS2型渦旋振蕩器；S180H型超聲波。

試劑：所用乙腈、乙酸乙酯、正己烷、甲醇均為進(jìn)口色譜純；水為去離子水； 氯化鈉為分析純，4% NaCl溶液臨用前配制；水飽和乙酸乙酯用50 mL水加400 mL乙酸乙酯超聲30 min，靜置分層后取上層乙酸乙酯用。

1.3 HPLC色譜條件

Waters超高效液相色譜柱 （WATERS ACQUITY UPLC？BEH C18柱50×2.1mm，1.7μm）；流動相：甲醇：水（50：50），用前過0.20 μm濾膜，除雜脫氣；柱溫：40 ℃；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；運(yùn)行時(shí)間1.5 min。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電離電壓：2.8 kV；碰撞氣：氬氣3.0×10-3mbar；脫溶劑氣速：500 L/hr；錐孔氣速：20 L/hr。數(shù)據(jù)采集窗口：1.5 min；駐留時(shí)間：0.6 s。離子化模式：ESI-；質(zhì)譜分辨率：單位分辨率；離子化溫度：350 ℃；離子源溫度：110 ℃。定性、定量離子及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞電壓見表1。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱量氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解，再用甲醇稀釋為1.0 ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，再將其用流動相（甲醇：水=50：50）稀釋為濃度0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，均含內(nèi)標(biāo)4 ng/mL。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱量氯霉素-D5，用甲醇超聲溶解為100 μg/mL的氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)儲備液，將其用流動相稀釋為濃度40 ng/mL的使用液。

1.6 樣品處理

稱取5.00 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入100 μL氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)使用液（40 ng/mL），加入5 mL乙腈和5 mL 4% NaCl溶液渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液至另一50 mL離心管中，殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并上清液。加入5 mL正己烷脫脂凈化兩次，棄去正己烷層，水層用5mL水飽和乙酸乙酯提取兩次，然后合并乙酸乙酯層在50 ℃下氮吹濃縮至干，加入1 mL甲醇渦旋1 min溶解待測物，加水至20 mL超聲3 min混勻。依次用5 mL甲醇、5 mL水活化Oasis HLB（6cc 200 mg），20 mL待測物過柱，再用5 mL水洗柱子，抽干柱子后用6 mL甲醇洗脫接收，將接收液在50 ℃下氮吹濃縮至干，準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇：水 （50：50），旋渦振蕩30 s后超聲2 min，過0.20μm 微孔濾膜后上HPLC-MS/MS分析。

1.7 樣品加標(biāo)試驗(yàn)

稱取5.00 g不同類別陰性樣品后，分別添加為氯霉素濃度0.2、0.4、1.0 μg/kg 的陽性樣品，加入100 μL氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)使用液（40 ng/mL），室溫下放置20～30 min后進(jìn)行樣品處理后上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍

配制濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，均含內(nèi)標(biāo)4 ng/mL。以質(zhì)量濃度x（ng/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積的比值y（氯霉素峰面積/氯霉素-D5峰面積）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y = 0.220 312x ±0.033 617 3，r2 = 0.999 1。結(jié)果表明，氯霉素在0.5～10.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

分別稱取禽類、豬肉、豬肝、水產(chǎn)品類陰性樣品5.00 g，每類都添加氯霉素0.2、0.4、1.0 μg/kg，每個(gè)濃度水平取6個(gè)平行樣，加入100 μL氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)使用液（40 ng/mL），加標(biāo)樣品的回收率為72.40%～114.20%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11%（表2），氯霉素-D5的回收率為82.9%～102.5%。

2.3 定量檢測下限

樣品中添加濃度為0.2 μg/kg時(shí)，定量離子信噪比S/N為10.51，回收率為72.40～108.60%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11%，因此方法定量檢測下限為0.2 μg/kg。

2.4 樣品的測定

抽取市場中畜禽產(chǎn)品53批，水產(chǎn)品60批，其中雞肉在一批樣品中檢出有氯霉素殘留樣品一批，其殘留量為0.35 μg/kg。

3 討論

3.1 提取溶液的選擇

氯霉素為中性化合物，可以用甲醇、乙腈、丙酮、和乙酸乙酯等溶劑提取，乙酸乙酯提取效率高但與水不互溶，當(dāng)樣品為干粉類含水量較少的動物組織時(shí)，提取效率明顯降低。用乙腈加入4% NaCl溶液對各類干、濕動物組織樣品中的氯霉素殘留都有較高的提取效率，且加入4% NaCl溶液后能有效的降低提取物中蛋白質(zhì)和油脂的含量，利于凈化。

3.2 提取方式的選擇

樣品提取時(shí)，渦旋振蕩、超聲或者振蕩提取都可以，但超聲或振蕩的時(shí)間要10 min，而渦旋振蕩只2 min。樣品批量少時(shí)可以選擇渦旋振蕩，批量多時(shí)可以選擇超聲或者振蕩，能夠大批量放入同時(shí)提取。

3.3 流動相的選擇

有報(bào)道指出在負(fù)離子模式下用乙腈代替流動相中的甲醇會增強(qiáng)信號強(qiáng)度[10]。試驗(yàn)以乙腈：水（50：50）作為流動相，未觀察到靈敏度的顯著提高。而以甲醇：水（50：50）作為流動相，靈敏度已滿足要求而且出峰時(shí)間縮短，提高檢測效率。

4 結(jié)論

本方法受基質(zhì)影響小，檢測靈敏度高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適用于各類干、濕動物組織中氯霉素殘留的檢測。

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