tRNA抑制子對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5提前終止密碼子的通讀

歐陽平，劉遠(yuǎn)航，黃志剛，齊小娟，倪倩，劉亞萍，宋仁生，李濤，吳柱國

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tRNA抑制子對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5提前終止密碼子的通讀

歐陽平1，劉遠(yuǎn)航2，黃志剛3，齊小娟1，倪倩1，劉亞萍1，宋仁生4，李濤1，吳柱國4

1. 廣東醫(yī)學(xué)院廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東莞 523808；2. 內(nèi)蒙古呼和浩特市第一醫(yī)院急診科，呼和浩特 010050；3. 廣東醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，東莞 523808；4. 廣東醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院， 東莞 523808

人類基因(NK2 homeobox 5，NKX2.5)提前終止密碼子(Premature termination codon，PTC)突變會(huì)引起房間隔缺損、房室傳導(dǎo)阻滯等先天性心臟病。目前，已報(bào)道的PTC突變有8個(gè)(E109X、Q149X、Q170X、Q187X、Q198X、Y256X、Y259X和C264X)。為了檢測(cè)tRNA抑制子是否對(duì)PTC突變誘導(dǎo)通讀產(chǎn)生有功能的全長蛋白，文章將8個(gè)PTC突變克隆到pcDNA3.1(-)載體，將全長和E109X、Q149X及C264X克隆到pEGFP-N1載體，形成NKX2.5-EGFP融合質(zhì)粒。將NKX2.5-EGFP與對(duì)應(yīng)的tRNA抑制子質(zhì)粒分別或共轉(zhuǎn)染后觀察綠色熒光數(shù)量定性判斷tRNA抑制子是否誘導(dǎo)通讀。Western blotting檢測(cè)通讀后全長蛋白和截短蛋白表達(dá)并計(jì)算通讀效率。Real-time PCR檢測(cè)下游重要調(diào)控基因mRNA的表達(dá)判斷通讀后蛋白功能。結(jié)果表明，文章成功構(gòu)建了8個(gè)基于pcDNA3.1(-)的表達(dá)質(zhì)粒、4個(gè)基于pEGFP-N1的質(zhì)粒；tRNA抑制子tRNA am能有效通讀Q149X、Q170X、Q187X和Q198X，且對(duì)后三者的通讀效率均在50%以上；tRNA op能有效通讀C264X，通讀效率約50%左右；tRNA oc不能通讀PTC突變；各通讀后樣本mRNA相對(duì)表達(dá)量增加7%~41.7%；tRNA am和tRNA op能有效通讀PTC突變，產(chǎn)生具有功能的全長蛋白，但tRNA抑制子對(duì)細(xì)胞的其他影響還不明確，有待于進(jìn)一步觀察。

tRNA抑制子；；提前終止密碼子；通讀；先天性心臟病

先天性心臟病(Congenital heart disease，CHD)是胎兒時(shí)期心臟血管發(fā)育異常所致的畸形，其發(fā)病率約占出生活產(chǎn)嬰兒的1%，是新生兒致死致殘的主要原因之一。先天性心臟病形成的原因很復(fù)雜，隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)遺傳因素在CHD的發(fā)生中影響重大，通過連鎖分析、候選基因克隆等方法發(fā)現(xiàn)了很多與CHD發(fā)生相關(guān)的基因或位點(diǎn)，如心臟轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5 (NK2 homeobox 5，NKX2.5)就是與CHD相關(guān)的基因之一?；蛭挥谌祟惾旧w5q34，包含2個(gè)外顯子，編碼324個(gè)氨基酸，蛋白大小為35 kDa。NKX2.5蛋白具有3類結(jié)構(gòu)域：TN、Homeodomain(HD)和NK結(jié)構(gòu)域[1]。NKX2.5在心臟發(fā)育早期以及成熟心臟的功能維護(hù)中起重要的作用[2]。在小鼠模型中，E7.5時(shí)期在心肌發(fā)生板的內(nèi)胚層和中胚層細(xì)胞核中均有高表達(dá)。-/-的小鼠心臟環(huán)化受阻，約在E10.5時(shí)期胚胎死亡[3]。人類突變引起CHD，產(chǎn)生房間隔缺損(Atrial septal defect，ASD)、房室傳導(dǎo)阻滯(Atrioventricular block，AVB)等心臟異常[4]。根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫(Human Gene Mutation Database，HGMD)報(bào)道，提前終止密碼子(Premature termination codon，PTC)突變約占已報(bào)道突變總數(shù)的14%，分別是E109X、Q149X、Q170X、Q187X、Q198X、Y256X、Y259X和C264X[1,5~10]。盡管ASD可以通過外科手術(shù)修復(fù)，但AVB無法手術(shù)修復(fù)且隨著年齡增加而嚴(yán)重，甚至發(fā)生猝死，所以對(duì)PTCs進(jìn)行基因修復(fù)將有可能從根本阻止以上癥狀發(fā)生。

PTC是指編碼某一氨基酸的三聯(lián)體密碼經(jīng)堿基替換后，變成不編碼任何氨基酸的終止密碼UAA、UAG或UGA，使翻譯時(shí)多肽鏈在提前終止密碼子處終止，形成比全長蛋白短的截短蛋白[11]。截短蛋白不僅影響蛋白功能，而且在細(xì)胞內(nèi)聚集可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性[12]。PTC通讀是指通過藥物或其他方法使核糖體能夠通讀PTC，繼續(xù)翻譯直至正常的終止密碼子，產(chǎn)生全長蛋白質(zhì)。目前主要有藥物誘導(dǎo)[13,14]和質(zhì)粒介導(dǎo)的通讀[15]，與藥物誘導(dǎo)通讀相比，質(zhì)粒介導(dǎo)通讀具有通讀效率較高，且有可能通過基因重組，徹底修正突變。tRNA抑制子是具有通讀能力的質(zhì)粒之一，包含tRNA am、tRNA oc和tRNA op三類，分別通讀UAG、UAA和UGA PTC突變[15]。tRNA抑制子具有很高的通讀效率，目前研究發(fā)現(xiàn)能夠抑制PTC的都是正常細(xì)胞的tRNA抑制子，tRNA抑制子是通讀與之同源有意義密碼子的必要因素，能夠通過非傳統(tǒng)的密碼子-反密碼子結(jié)合方式進(jìn)行堿基配對(duì)，但是正常細(xì)胞中存在的tRNA抑制子較少。體外研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人工合成的人類tRNA抑制子能在體外誘導(dǎo)β-珠蛋白含UAG的PTC通讀[16]。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染tRNA抑制子和PTC表達(dá)質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)有全長蛋白產(chǎn)生[15]。本研究通過檢測(cè)tRNA抑制子是否對(duì)PTC突變誘導(dǎo)通讀產(chǎn)生有功能的全長蛋白，從而為該類突變導(dǎo)致的房室傳導(dǎo)阻滯提供可能的治療方法。

1 材料和方法

1.1 材料

pEGFP-N1、pcDNA3.1(-)和表達(dá)全長NKX2.5的質(zhì)粒WT-NKX2.5(連在pcDNA3.1(-))為本實(shí)驗(yàn)室保存。3種tRNA抑制子tRNA-am、tRNA-oc和tRNA-op由Olivier Jean-Jean教授惠贈(zèng)，分別通讀UAG、UAA和UGA PTCs，且通讀后取代氨基酸為人類絲氨酸。DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、Real-time PCR試劑等購自大連寶生物。Lipofectamine 2000脂質(zhì)體、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、細(xì)胞用青霉素-鏈霉素雙抗和TRizol等均購自Invitrogen公司。高純DNA質(zhì)粒抽提試劑購自O(shè)mega公司。NKX2.5抗體購自Santa Cruz，GAPDH抗體和二抗購自武漢博士德。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

全長克隆到pEGFP-N1的引物(F/I和/H I)、PTC各定點(diǎn)突變引物以及Real-time PCR使用的和引物見表1。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

NKX2.5-EGFP質(zhì)粒用于檢測(cè)tRNA抑制子通讀可行性的定性分析，WT-NKX2.5-EGFP采用常規(guī)酶切連接方法構(gòu)建，其他質(zhì)粒采用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建。PCR反應(yīng)體系和程序參照試劑盒說明書進(jìn)行。各PTC突變構(gòu)建質(zhì)粒以突變位點(diǎn)所在氨基酸位置命名，克隆到pcDNA3.1(-)的質(zhì)粒依次命名為E109X、Q149X、Q170X、Q187X、Q198X、Y256X、Y259X和C264X，分別表達(dá)截短蛋白分子量約為11、16、18、20、22、28、28.4和29 kDa，通讀后NKX2.5全長蛋白約為35 kDa?？寺〉絧EGFP-N1的質(zhì)粒命名為E109X-EGFP、Q149X-EGFP和C264X-EGFP，分別表達(dá)截短蛋白分子量約為11、16和29 kDa，通讀后NKX2.5-EGFP全長蛋白分子量約為62 kDa。所有質(zhì)粒均經(jīng)過雙向測(cè)序驗(yàn)證。

表1 本研究使用的引物序列

注：*大寫加粗的為酶切位點(diǎn)；粗體下劃線指PTC所在位置。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HeLa細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染按照常規(guī)方法進(jìn)行。6孔板轉(zhuǎn)染時(shí)每孔轉(zhuǎn)染量如下：NKX2.5表達(dá)質(zhì)?；蚩蛰d體2 μg；共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)，E109X、Y256X和Y259X分別與tRNA oc共轉(zhuǎn)染，Q149X、Q170X、Q187X和Q198X分別與tRNA am共轉(zhuǎn)染，C264X與tRNA op共轉(zhuǎn)染，突變表達(dá)質(zhì)粒與tRNA抑制子各2μg。每組平行做3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 通讀效率

tRNA抑制子的通讀效率根據(jù)Western blotting結(jié)果進(jìn)行如下計(jì)算來評(píng)估：tRNA抑制子的通讀效率=“全長蛋白/(全長蛋白+截短蛋白)×100%”。

1.2.5 Real-time PCR

Cx43是一個(gè)間隙蛋白，在細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要作用。是NKX2.5的重要下游基因[17,18]，擬通過檢測(cè)mRNA表達(dá)變化判斷通讀后蛋白活性。根據(jù)Western blotting結(jié)果可知tRNA抑制子能通讀5個(gè)(Q149X、Q170X、Q187X、Q198X和C264X)PTC突變，進(jìn)一步的通讀后蛋白功能實(shí)驗(yàn)分成兩組：組1，分別轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-NKX2.5、Q149X、Q170X、Q187X、Q198X和C264X；組2，WT-NKX2.5、Q149X、Q170X、Q187X和Q198X分別與tRNA am共轉(zhuǎn)染，WT-NKX2.5、C264X分別與tRNA op共轉(zhuǎn)染。另設(shè)計(jì)非轉(zhuǎn)染空白對(duì)照、pcDNA3.1(-)空載體對(duì)照和單轉(zhuǎn)tRNA抑制子對(duì)照，每樣本做3個(gè)平行復(fù)孔。細(xì)胞收集、總RNA提取和RNA反轉(zhuǎn)錄按常規(guī)方法，分別用和引物擴(kuò)增進(jìn)行半定量實(shí)驗(yàn)，每樣本平行做3個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通讀前后mRNA的變化采用配對(duì)檢驗(yàn)分析，<0.05為數(shù)據(jù)有顯著意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 tRNA抑制子誘導(dǎo)NKX2.5-EGFP通讀表達(dá)全長蛋白

單獨(dú)轉(zhuǎn)染E109X-EGFP、Q149X-EGFP和C64X- EGFP的細(xì)胞未觀察到綠色熒光。在tRNA抑制子共轉(zhuǎn)后，Q149X-EGFP和C64X-EGFP組觀察到較強(qiáng)的綠色熒光，E109X-EGFP無熒光產(chǎn)生(圖1)。進(jìn)一步通過Western blotting檢測(cè)單轉(zhuǎn)和tRNA抑制子共轉(zhuǎn)染后樣本的蛋白表達(dá)情況。WT-NKX2.5-EGFP、E109X-EGFP、Q149X-EGFP和C264X-EGFP表達(dá)蛋白分子量分別在62、11、16和29 kDa左右。Western blotting結(jié)果(圖2)顯示，E109X-EGFP、Q149X-EGFP和C264X-EGFP均檢測(cè)不到全長蛋白，C264X可檢測(cè)到截短蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染tRNA抑制子后，Q149X-EGFP和C264X-EGFP可檢測(cè)到全長蛋白表達(dá)，且C264X-EGFP可同時(shí)檢測(cè)到截短蛋白，但E109X-EGFP未檢測(cè)到蛋白。此外，所有樣本均未檢測(cè)到大于62 kDa的蛋白。這些結(jié)果說明tRNA am能有效通讀UAG PTC，tRNA op能高效通讀UGA PTC，且兩者均能在EGFP正常終止密碼子處終止，但tRNA oc不能通讀UAA PTC。

2.2 tRNA抑制子通讀NKX2.5 PTC突變

為進(jìn)一步確定tRNA抑制子對(duì)NKX2.5-EGFP的定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文將8個(gè)NKX2.5表達(dá)質(zhì)粒E109X、Q149X、Q170X、Q187X、Q198X、Y256X、Y259X和C264X進(jìn)行單轉(zhuǎn)染、與對(duì)應(yīng)tRNA抑制子共轉(zhuǎn)染后檢測(cè)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，Q170X、Q187X、Q198X、Y256X、Y259X和C264X表達(dá)蛋白大小與預(yù)期一致(圖3A)。共轉(zhuǎn)tRNA抑制子后，Q170X、Q187X和Q198X檢測(cè)到了全長蛋白、截短蛋白和比全長更大的非特異性蛋白；Q149X檢測(cè)到全長蛋白(圖3B)，表明tRNA am能高效通讀UAG類PTC，檢測(cè)到大于35 kDa的蛋白提示可能存在通讀過正常終止密碼子的“過通讀”現(xiàn)象。C264X檢測(cè)到了全長蛋白和截短蛋白(圖3B)，說明tRNA op能誘導(dǎo)UGA類PTC通讀，并且無過通讀。E109X、Y256X和Y259X均未見全長蛋白，這與E109X-EGFP的定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明tRNA oc不能誘導(dǎo)UAA類PTC的通讀。tRNA oc的通讀效率為0；tRNA am對(duì)Q170X、Q187X和Q198X的通讀效率均在50%以上，對(duì)Q149X的通讀效率因?yàn)榻囟痰鞍椎奈茨軝z出而無法正確評(píng)估；tRNA op的通讀效率約為50%。

圖1 tRNA抑制子通讀NKX2.5-EGFP融合質(zhì)粒

圖2 Western blotting檢測(cè)NKX2.5-EGFP蛋白

2.3 Cx43 mRNA表達(dá)變化

用突變表達(dá)質(zhì)粒與WT-NKX2.5中mRNA表達(dá)量比值（%）來評(píng)估通讀后蛋白活性。單轉(zhuǎn)染Q149X、Q170X、Q187X、Q198X和C264X的比值分別是32%、37.7%、38.3%、31%和21.7%，共轉(zhuǎn)染tRNA抑制子后分別為46%、46.7%、45.3%、72.7%和37.7%。mRNA相對(duì)表達(dá)量上調(diào)了7%~41.7%，其中Q198X增加41.7%，其余突變活性增加在7%~16%（圖4），且通讀前后mRNA差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），表明tRNA抑制子通讀后的蛋白均具有活性。

3 討論

NKX2.5-EGFP通讀后高效表達(dá)綠色熒光蛋白及Western blotting結(jié)果證明，tRNA抑制子tRNA am和tRNA op均能高效通讀對(duì)應(yīng)的PTC突變。從對(duì)正常終止密碼子有無影響而言，本研究發(fā)現(xiàn)tRNA op優(yōu)于tRNA am。tRNA op不能通讀和的正常終止密碼，然而tRNA am在正常終止密碼子處終止的能力與基因有關(guān)。tRNA am不影響正常終止密碼子(圖2)，但對(duì)Q170X、Q187X和Q198X，通讀后產(chǎn)生了極少量比NKX2.5全長更大的蛋白，說明tRNA am存在少量的“過通讀”(圖3B)。從通讀效率來看，tRNA am比tRNA op通讀效率略高，前者對(duì)Q170X、Q187X和Q198X的通讀效率均大于50%，后者對(duì)C264X的通讀效率為50%左右。另外，tRNA oc不能通讀E109X、Y256X和Y259X，該結(jié)果與前人報(bào)道的一致，可能因?yàn)閁AA是三類終止密碼子中最強(qiáng)的終止信號(hào)，很難通過[19]。

圖3 tRNA抑制子高效誘導(dǎo)截短突變表達(dá)全長蛋白

A：8個(gè)NKX2.5提前終止突變表達(dá)質(zhì)粒單轉(zhuǎn)時(shí)蛋白表達(dá)；B：8個(gè)NKX2.5提前終止突變表達(dá)質(zhì)粒與對(duì)應(yīng)tRNA抑制子共轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)。

圖4 tRNA抑制子通讀前后Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

WT-NKX2.5的活性定義為100%。

tRNA抑制子通讀后能營救部分NKX2.5蛋白功能。人類心臟轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5具有3個(gè)重要的功能域：TN結(jié)構(gòu)域(10~21位氨基酸)、Homeobox結(jié)構(gòu)域(139~197位氨基酸)和NK結(jié)構(gòu)域(210~233位氨基酸)[1]，其中Homeobox結(jié)構(gòu)域保守性最強(qiáng)，與轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。tRNA抑制子能有效通讀已報(bào)道的5個(gè)PTCs，其中有3個(gè)(Q149X、Q170X和Q187X)位于Homeobox結(jié)構(gòu)域，另外兩個(gè)突變(Q198X和C264X)不在結(jié)構(gòu)域中。本研究中tRNA抑制子通讀后原PTC位點(diǎn)處氨基酸都將被人類絲氨酸取代，因此，理論上通讀后Q198X和C264X的蛋白功能應(yīng)更接近野生蛋白，而Q149X、Q170X和Q187X蛋白功能可能由于被取代位點(diǎn)十分保守而受到較大影響。Kasahara等[17]報(bào)道NKX2.5蛋白過表達(dá)抑制基因表達(dá)，而本研究結(jié)果表明外部轉(zhuǎn)染的野生型較突變明顯促進(jìn)的基因表達(dá)，究其原因，本研究采用的是非心肌細(xì)胞背景的HeLa細(xì)胞，而其他研究是在心肌細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因鼠中進(jìn)行[18]。tRNA抑制子通讀突變后可以部分恢復(fù)NKX2.5的活性，促進(jìn)的基因表達(dá)。已通讀的5個(gè)蛋白中Q198XmRNA相對(duì)表達(dá)量最高，蛋白功能恢復(fù)最理想，由通讀前的31%增加至72.7%，增幅為41.7%；C264X由21.7%增加至37.7%，增幅16%，Q149X、Q170X和Q187X增加7%~14%。

相比藥物誘導(dǎo)的PTC通讀，tRNA抑制子的通讀高效性是較高的，如已報(bào)道的氨基糖苷類抗生素慶大霉素的通讀效率為12%左右，明星小分子PTC124孤兒藥物的通讀效率為20%[20]，而tRNA am對(duì)UAG的通讀效率大于50%，tRNA op對(duì)UGA的通讀效率也達(dá)到了50%[15]。tRNA抑制子通讀的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是取代氨基酸明確，藥物通讀是通過降低核糖復(fù)合體的保真性，被取代氨基酸可能是任意的，因此可能產(chǎn)生無活性、甚至有毒性的蛋白。因此可針對(duì)特定的PTC突變?cè)O(shè)計(jì)tRNA抑制子，使之通讀后恢復(fù)成“原始的”氨基酸序列，通讀后蛋白與野生型蛋白一致。然而tRNA抑制子通讀也存在不足，有報(bào)道稱tRNA抑制子存在過通讀問題[21]，這點(diǎn)與本研究結(jié)果一致，解決辦法有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編委: 宋旭)

Readthrough on transcription factor NKX2.5 premature stop codon by tRNA suppressors

Ping Ouyang1, Yuanhang Liu2, Zhigang Huang3, Xiaojuan Qi1, Qian Ni1, Yaping Liu1, Rensheng Song4, Tao Li1, Zhuguo Wu4

Human(NK2 homeobox 5) premature stop codon (PTC) mutations cause congenital heart diseases such as atrial septal defect and atrioventricular block. At present, eightPTC mutations were reported as E109X, Q149X, Q170X, Q187X, Q198X, Y256X, Y259X and C264X. To observe the ability of tRNA suppressors to read throughPTC mutations and produce functional full-length proteins, eightPTC mutations were cloned into pcDNA3.1(-) vectors and four fragments (wild-type, E109X, Q149X and C264X) were cloned in pEGFP-N1 vectors to acquire NKX2.5-EGFP fusing plasmids. After transfection of NKX2.5-EGFP with or without corresponding tRNA suppressor into HeLa cells, the quantity of EGFP was measured to confirm the readthrough ability of the PTCs. NKX2.5 full-length and truncated protein expression levels were examined by Western blotting and the readthrough efficiency of tRNA suppressors on the PTCs was calculated respectively. The activity of NKX2.5 full-length and truncated protein was confirmed on NKX2.5 target gene-mRNA level measured by Real-time PCR. Three tRNA suppressors were used: tRNA am, tRNA oc and tRNA op. tRNA am could suppress UAG-containing PTCs Q149X, Q170X, Q187X, Q198X and the readthrough efficiency for the latter three was above 50%. tRNA op could suppress UGA-containing PTC C264X with ~50% readthrough efficiency. tRNA oc failed to read throughPTC mutations. The relativemRNA level in all readthrough samples was increased to 7%–41.7%. In conclusion, tRNA am and tRNA op could suppressPTCs and induce functional protein expression. However, the effects of tRNA suppressors on cellular function are not clear yet, warranting further researches.

tRNA suppressors;; premature stop codon (PTC); readthrough; congenital heart disease

2014-11-24;

2015-01-19

國家青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：81200082)，廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(編號(hào)：B2012272)和廣東醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(編號(hào)：B2011019)資助

歐陽平，博士，助理研究員，研究方向：醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)。E-mail: ouyang_ping@126.com

吳柱國，博士，教授/主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：臨床心血管病學(xué)。E-mail: wugdmc@126.com

10.16288/j.yczz.14-410

2015-3-12 10:40:57

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150312.1040.001.html