缺失PHO13基因與進化工程構(gòu)建高效利用木糖酵母

汪晨宇，張國暢，陳 洵

（天津大學化工學院，天津 300072）

生物乙醇被認為是替代化石能源最潔凈的液體燃料，近年來利用可再生資源生產(chǎn)生物乙醇受到越來越多的關(guān)注。相比傳統(tǒng)的基于淀粉或者蔗糖的材料，木材廢料和農(nóng)業(yè)廢棄物中的木質(zhì)纖維素具有來源豐富，價格低廉并且不占用糧食資源等優(yōu)點，木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇已經(jīng)成為了極具吸引力的生物乙醇生產(chǎn)途徑［1-3］。然而作為廣為人知的用來生產(chǎn)工業(yè)乙醇的微生物，釀酒酵母本身并不能利用木質(zhì)纖維素中第二豐富的木糖，所以近20年來大量研究致力于利用釀酒酵母發(fā)酵木糖，其中主流方法是在酵母菌株內(nèi)整合外源木糖還原酶（XR）和木糖醇脫氫酶（XDH）代謝通路，同時過表達內(nèi)源木酮糖激酶（XK）編碼基因。在XR/XDH代謝通路中木糖首先被依賴NADPH的XR轉(zhuǎn)化成木糖醇，接著被依賴NAD+的XDH轉(zhuǎn)化為木酮糖，這兩步反應(yīng)依賴的輔酶不同，造成的細胞內(nèi)輔酶不平衡和木糖醇的積累是XR/XDH代謝通路的主要問題［4-7］。PHO13基因編碼的蛋白同時具有蛋白磷酸化酶活性和對硝基苯磷酸鹽的堿性磷酸化酶活性，研究表明缺失PHO13基因能提高釀酒酵母在木糖培養(yǎng)基里的生長速率和乙醇產(chǎn)量［8-9］。但是最初的研究是在實驗室菌株上進行，并且對照菌的木糖代謝能力并不突出。同時，進化工程作為一個有力的提高工業(yè)微生物性狀的方法，已經(jīng)被應(yīng)用于提高重組釀酒酵母利用木糖的能力［10-15］。因此，我們在重組工業(yè)菌株內(nèi)缺失了PHO13基因，同時利用進化工程的方法，獲得了能更加高效發(fā)酵木糖的工業(yè)菌株。釀酒酵母作為兼性厭氧微生物，能夠在有氧條件利用木糖生長，在無氧條件下產(chǎn)出乙醇，所以我們選擇有氧條件測試菌株生長情況，微好氧條件測試菌株木糖發(fā)酵性能，對所得菌株與出發(fā)菌株在不同木糖濃度培養(yǎng)基中進行了發(fā)酵實驗，并測定了系列發(fā)酵數(shù)據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

本研究中使用的釀酒酵母菌株和質(zhì)粒列于表2。大腸桿菌Top10用于克隆和質(zhì)粒的擴增。釀酒酵母KAM-2［16］作為出發(fā)菌株進行基因操作，誘變和進化工程篩選。大腸桿菌在包含濃度0.1 g/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基（10 g/L胰化蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，pH值 7.0）37℃條件下培養(yǎng)。酵母菌在 YPD培養(yǎng)基（10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖）30℃條件下培養(yǎng)。YSCD培養(yǎng)基［6.7 g/L酵母基本氮源（YNB），根據(jù)營養(yǎng)缺陷型添加相應(yīng)的氨基酸，20 g/L葡萄糖］用于酵母轉(zhuǎn)化子的篩選，5-氟乳氫酸培養(yǎng)基用于URA3基因的反選擇。YSCX培養(yǎng)基（6.7 g/L YNB，根據(jù)營養(yǎng)缺陷型添加相應(yīng)的氨基酸，50 g/L木糖），YPX培養(yǎng)基（10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，50或100 g/L木糖）用于進化工程和木糖發(fā)酵。

1.2 質(zhì)粒和菌株構(gòu)建

核酸操作使用標準的分子遺傳技術(shù)，酵母的轉(zhuǎn)化使用醋酸鋰方法［17］。

從畢赤酵母NRRL7124和釀酒酵母W303菌株染色體中擴增出 XYL1，XYL2，XKS基因分別編碼XR，XDH和XK。質(zhì)粒 YIplac211-A8用啟動子 pCCW12和pFBA1分別過表達 XYL1和 XKS，質(zhì)粒 YI-plac211-Y8用啟動子pCCW12和pTPI1分別過表達XYL2和 XKS，質(zhì)粒 YIplac211-H8用啟動子 pHXT7和pFBA1分別過表達XYL1和XYL2，將它們整合到酵母染色體上獲得木糖利用重組酵母菌株KAM-6X（表 2）。

質(zhì)粒pUC18-PHO13pt-URA用于缺失PHO13基因，用引物 pPHO13-U和 pPHO13-D（表1）通過PCR將PHO13啟動子從W303染色體中擴增出來并插入到pUC18的 Hin d III與 Pst I酶切位點之間，同時用引物tPHO13-U和tPHO13-D（表1）擴增出PHO13終止子，插入到pUC18的BamHI與Eco RI酶切位點之間，得到質(zhì)粒pUC18-PHO13pt。用引物URA-U和URA-D（表1）從質(zhì)粒 YCplac33中擴增出篩選標記URA3基因，插入到 pUC18-PHO13pt的 Pst I和BamHI酶切位點之間，即得到質(zhì)粒pUC18-PHO13pt-URA（表2）。然后用 Hin d III和 Eco RI雙酶切質(zhì)粒pUC18-PHO13pt-URA將其線性化后轉(zhuǎn)化KAM-6X涂布CM-URA培養(yǎng)基，通過PHO13基因兩端的同源序列與染色體發(fā)生同源重組用URA3替換PHO13基因，能在 CM-URA平板上生長的菌株為整合上URA3基因即PHO13缺失的轉(zhuǎn)化子。接著將缺失PHO13的轉(zhuǎn)化子涂在5-氟乳氫酸培養(yǎng)基中反選擇URA3以排除URA3基因?qū)ιL的影響，由于 URA3基因會催化5-氟乳氫酸轉(zhuǎn)化為對細胞有毒性的物質(zhì)，因而能在5-氟乳氫酸平板上生長的為 URA3點突變失活的菌株，命名為KAM-6X（△PHO13）（表2）。

1.3 誘變和進化工程篩選

收集1 mL過夜培養(yǎng)的細胞（大約2×108個），無菌水沖洗后用0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH值7）重懸。將終體積分數(shù)為4%的EMS做為最適宜誘變劑量加入到細胞懸液中，震蕩混勻。然后將混合體系在30℃條件下輕微搖動培養(yǎng)1 h，加入等體積新鮮的質(zhì)量體積比（下同）為5%硫代硫酸鈉終止誘變反應(yīng)，離心收集誘變細胞，用5%硫代硫酸鈉沖洗2次，重懸在無菌水中，進行下一步的進化篩選。進化包括3個階段，每一輪都是以起始OD6000.1接入，生長至20后轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基中。第一階段是在有氧條件下的含50 g/L木糖的YSCX培養(yǎng)基中進行了8輪，第二階段是在微好氧條件下含50 g/L木糖的YPX培養(yǎng)基中進行了8輪，第三階段在微好氧條件下含100 g/L木糖的YPX培養(yǎng)基中進行了12輪。將最后的細胞稀釋涂布在含50 g/L木糖的YPX平板上，挑選較大的單菌落測試木糖發(fā)酵性能，獲得最優(yōu)發(fā)酵菌株P(guān)E（表2）。

表1 本研究中使用的引物Tab le 1 Primers used in this study

表2 本研究中使用的菌株和質(zhì)粒Tab le 2 Strains and p lasmid used in this study

1.4 酶活測定

在含50 g/L木糖的YPX培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞至對數(shù)期，離心收集后用400μL預(yù)冷的裂解緩沖液重懸。將細胞轉(zhuǎn)移至預(yù)先冷凍裝有200μL玻璃珠的細胞破碎管，放入細胞破碎儀（Thermo Electron，USA）中以速度4檔破碎30 s，重復3次。冷凍高速離心10 min，取上清液通過BioRad DC蛋白分析試劑盒（Bio-Rad，USA）測定蛋白濃度后用于酶活測定。酶活測定按照之前所報道的方法［7］，使用CECIL 2000 series分光光度計（Bioquest，England）在 340 nm波長，30℃條件下測定反應(yīng)曲線。所有酶活力的定義為每1 mg總蛋白每分鐘轉(zhuǎn)化NAD（P）H的微物質(zhì)的量。NADH的摩爾吸光系數(shù)為 6.22 mol·mmol-1·cm-1。

1.5 木糖發(fā)酵及結(jié)果分析

菌株在YPD培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)12 h，離心收集細胞，用無菌水洗去葡萄糖后接入100 mL三角瓶中的40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基。起始 OD為 1，干質(zhì)量約為0.25 g/L。發(fā)酵溫度30℃，好氧條件使用錫箔紙封口，微好氧條件使用封口膜封口，用0.5 mm的針頭刺一個外排CO2的孔。每24 h取樣用于代謝物組分分析。

代謝產(chǎn)物通過Waters Alliance 2695高效液相色譜（Waters， Milford， USA），HPX 87H交換色譜柱（BioRad，USA）和 Waters 2410示差檢測器進行定量分析。以5 mmol/L的 H2SO4作為流動相，流速和柱溫分別保持在0.4 mL/min和45℃。細胞干質(zhì)量經(jīng)過3次測量確定，用0.45μm預(yù)先稱質(zhì)量的玻璃纖維素膜過濾收集5 mL菌液，用無菌水過膜，放置于90℃烘箱14 h后稱質(zhì)量，細胞干質(zhì)量即為兩者質(zhì)量之差。

2 結(jié)果與討論

2.1 有氧條件下生長

我們首先測定了所得菌株在含50 g/L和100 g/L木糖的YPX培養(yǎng)基中有氧條件下的木糖消耗和生長情況，KAM-6X作對照。KAM-6X，KAM-6X（△PHO13）和PE的最大比生長速率，在50 g/L木糖濃度下分別為 0.153、0.261和 0.299 h-1，在100 g/L木糖濃度下分別為0.139、0.258和0.282 h-1，PE菌株比出發(fā)菌株在2種木糖濃度下比生長速率分別提高了95.43%和102.87%。在含50 g/L木糖的YPX中，前24 h內(nèi)PE能耗掉36.12 g/L木糖，PHO13缺失菌能耗掉27.93 g/L木糖，而 KAM-6X只能耗掉8.16 g/L木糖。在100 g/L木糖的YPX中，前48 h內(nèi)PE能耗掉70.25 g/L木糖，PHO13缺失菌能耗掉46.37 g/L木糖而KAM-6X只能耗掉41.5 g/L木糖。從圖1能看出改造后的菌株在2種木糖濃度下都顯示延遲期縮短，但指數(shù)期生長和耗糖情況差別不大，這與之前的報道一致［9］。

酶活測定所得如表3，PHO13缺失菌以及進化工程所得的菌株與出發(fā)菌株酶活沒有大的差別，證明進化方法產(chǎn)生了一些新的偏好于代謝木糖的基因性狀，也從另一角度證明了我們的進化方法可行。

圖1 菌株不同木糖濃度下有氧生長和木糖消耗情況Fig.1 G rowth and xylose consumption under aerobic condition in YPX

表3 酵母細胞培養(yǎng)粗提物中的體外酶活性Tab le 3 In vitro enzyme activities in crude extract fromcell cultu res of yeast strains

2.2 50 g/L木糖濃度下微好氧發(fā)酵

為了比較所得菌株的木糖發(fā)酵能力，我們在50 g/L的木糖濃度下進行了微好氧發(fā)酵實驗。發(fā)酵數(shù)據(jù)如表4所示，PHO13缺失菌株能更快的消耗木糖［圖2a）］，產(chǎn)生更多的乙醇［圖 2b）］和更少的木糖醇［圖2c）］，甘油產(chǎn)量的降低和乙酸產(chǎn)量的增加與之前的報道［8］一致。進化之后的菌株進一步提高耗糖速率［圖2a）］和乙醇產(chǎn)量［圖2b）］，甘油產(chǎn)量繼續(xù)減少，雖然木糖醇［圖2c）］和乙酸產(chǎn)量稍微增加，但是糖醇轉(zhuǎn)化率進一步提升。

2.3 100 g/L木糖濃度下KAM-6X（△PHO13）與PE微好氧發(fā)酵

圖2 菌株在50 g/L木糖濃度下微好氧發(fā)酵情況Fig.2 Xylose fermentation under oxygen-limited cond itions in YPX with 50 g/L xylose

由于 KAM-6X（△PHO13）和 PE能迅速耗掉50 g/L的木糖，我們接著測試了所得菌株在含100 g/L木糖的YPX中的發(fā)酵性能，結(jié)果如圖3所示。與有氧條件下相比，微好氧條件下木糖消耗速率有所降低，KAM-6X（△PHO13）菌株能在 120 h消耗掉88.44 g/L的木糖，糖醇轉(zhuǎn)化率為0.374 g/g，木糖醇轉(zhuǎn)化率為0.059 g/g。PE菌株能在120 h能完全消耗掉95.33 g/L的木糖，但是糖醇轉(zhuǎn)化率升高到0.382 g/g，木糖醇轉(zhuǎn)化率也僅為0.066 g/g。結(jié)果證明，PE是一株高效利用木糖發(fā)酵的釀酒酵母工業(yè)菌株。

表4 50 g/L木糖濃度下微好氧木糖發(fā)酵結(jié)果Tab le 4 Resu lts of oxygen-limited batch fermentation of xylose（50 g/L）

圖3 100 g/L木糖濃度下微好氧發(fā)酵情況Fig.3 Xylose fermen tation under oxygen-limited cond itions in YPX with 100 g/L xylose

PHO13基因缺失被認為是調(diào)節(jié)了細胞的氧化還原水平，之前有報道PHO13缺失強烈抑制了呼吸缺陷菌株在木糖培養(yǎng)基中的生長［11］，推測 PHO13缺失對木糖發(fā)酵的積極作用依靠細胞的呼吸作用，這和我們在微好氧條件下耗糖速率較慢的結(jié)果一致。在另一個報道中，PHO13缺失也提高了木糖利用速率和乙醇產(chǎn)出，但是甘油的產(chǎn)量卻大大的提升了［9］。由此可以看出，不同菌株內(nèi)氧化還原水平不同導致PHO13缺失對于不同基因背景的菌株效果有所差異。

我們在已經(jīng)具有較強木糖利用能力的工業(yè)菌株內(nèi)缺失了PHO13，有氧消耗木糖速率提高了將近1倍，微好氧發(fā)酵耗糖速度稍慢，糖醇轉(zhuǎn)化率得到提升，木糖醇和甘油產(chǎn)量下降而乙酸的含量增加，這與最初的報道效果基本一致［8］。

通過進化工程，我們進一步提升了木糖消耗速率和糖醇轉(zhuǎn)化率，這共分為三個階段。第一階段使用接近工業(yè)發(fā)酵營養(yǎng)成分的合成培養(yǎng)基，進行嚴格的篩選。第二階段使用天然培養(yǎng)基避免了由于營養(yǎng)物質(zhì)的限制造成的選擇壓力，使在微好氧條件下快速利用木糖成為唯一的篩選條件。第三階段提高培養(yǎng)基中的木糖濃度到100 g/L，這樣是為了拓寬木糖利用提升空間，獲得能更加高效利用木糖的菌株。由于PHO13缺失菌株本身的木糖代謝能力已經(jīng)很強，所以進化篩選得到的菌株提高的范圍有限，但也是一種可行的提高木糖利用能力的改造方法。

3 結(jié)論

通過在具有較強木糖利用能力的工業(yè)釀酒酵母菌株中缺失 PHO13基因，結(jié)合進化工程方法，我們獲得了一株高效利用木糖的工業(yè)菌株。有氧條件下最大比生長速率增加1倍，木糖消耗速度顯著提高。微好氧發(fā)酵的副產(chǎn)物大量減少，糖醇轉(zhuǎn)化率增加到0.382 g/g。結(jié)果證明PHO13基因缺失在不同于之前報道的基因背景的工業(yè)酵母菌株內(nèi)也有提高木糖發(fā)酵能力的作用，結(jié)合合適的進化工程策略能夠有效的構(gòu)建高效利用木糖的工業(yè)菌株，所得菌株可以進一步分析改造以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

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