乳腺癌BAG—1基因表達(dá)與表皮生長因子受體表達(dá)的相關(guān)性

楊輝　徐笑紅

[摘要] 目的 探討乳腺癌BAG-1基因表達(dá)與表皮生長因子受體（EGFR）表達(dá)的相關(guān)性。 方法 培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞株，采用實時聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測EGFR（+）和EGFR（-）細(xì)胞株中BAG-1 mRNA的表達(dá)情況，West blot法檢測其蛋白水平。分析BAG-1基因表達(dá)與EGFR表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果 MDA-MB-231、T47D細(xì)胞株EGFR mRNA和EGFR蛋白陽性表達(dá)，MCF-7、SLBP3細(xì)胞株EGFR mRNA和EGFR蛋白陰性表達(dá)。T47D細(xì)胞株BAG-1 mRNA的表達(dá)水平最高[（29.6±0.4）×10-4]，其次為MDA-MB-231細(xì)胞株[（6.9±0.3）×10-4]，兩者的表達(dá)水平均顯著高于MCF-7細(xì)胞株[（4.3±0.5）×10-4]、SKBR3細(xì)胞株[（0.3±0.1）×10-4]，差異的有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 BAG-1表達(dá)與EGFR存在相關(guān)性，可作為乳腺癌靶向治療的潛在靶點。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；表皮生長因子受體；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)抗凋亡基因

[中圖分類號] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（c）-0025-05

Correlation of BAG-1 gene expression and EGFR expression in breast cancer

YANG Hui1 XU Xiaohong2

1.Center of Tumor Radiation and Chemotherapy， Yinzhou People's Hospital of Ningbo City， Zhejiang Province， Ningbo 315000， China； 2.The Center of Tumor Radiation， Zhejiang Provincial Tumor Hospital， Zhejiang Province， Hangzhou 310022， China

[Abstract] Objective To discuss the correlation of BAG-1 gene expression and EGFR expression in breast cancer. Methods Breast cancer cell lines were cultured， BAG-1 mRNA expression was detected by PCR in EGFR （+） and EGFR （-） cell lines. BAG-1 protein expression was detected by West blot. Correlation of BAG-1 gene expression and EGFR expression in breast cancer was analyzed. Results EGFR mRNA and EGFR protein were positive expression in EGFR MDA-MB-231 and T47D cell lines， and negative expression in MCF-7 and SLBP3 cell lines. BAG-1 mRNA expression was highest in T47D cell line [（29.6±0.4）×10-4]， followed by MDA-MB-231 cell line [（6.9±0.3）×10-4]. Both expression levels were significantly higher than that of MCF-7 cell line [（4.3±0.5）×10-4] and SKBR3 cell line [（0.3±0.1）×10-4]， the differences were statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Expression of BAG-1 shows correlation with EGFR， which can be used as a potential targets for targeted therapy of breast cancer.

[Key words] Breast cancer； EGFR； BAG-1

乳腺癌是外科常見腫瘤，威脅女性的健康。近年來隨著篩查方法的不斷發(fā)展，早期乳腺癌的檢出率和治愈率逐漸升高，患者的生存時間也逐漸延長。綜合治療的發(fā)展極大地提高了乳腺癌的治療效果。乳腺癌靶向治療的分子靶點主要有人類表皮生長因子受體-2（epidermal growth factor receptor，EGFR-2）及EGFR[1-2]。EGFR屬于表皮生長因子家族成員之一，是一種跨膜蛋白，由原癌基因c-erbB編碼，具有抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤血管化、促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用，能夠加快腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[3-4]。BAG-1是一種抗凋亡基因，編碼一種多功能結(jié)合蛋白，與細(xì)胞多種蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、增殖、分化以及凋亡等[5]。BAG-1的過表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，包括放療、化療等誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致癌細(xì)胞對治療耐受。研究顯示采用siRNA技術(shù)降低肺癌中BAG-1的表達(dá)，結(jié)果EGFR基因及蛋白的表達(dá)升高，提示二者存在一定的相關(guān)性[6]。本研究分析乳腺癌腫BAG-1基因表達(dá)與EGFR表達(dá)的相關(guān)性，并分析其對乳腺癌靶向治療的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

乳腺癌細(xì)胞株EGFR（+）株MDA-MB-231、T47D和EGFR（-）株SKBR3、MCF-7。細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶由Hyclone公司提供。四甲基乙二胺、甘氨酸、預(yù)染蛋白Marker、丙烯酰胺、ECL顯影液、PVDF膜，一抗兔抗BAF-1抗體、抗β-actin抗體、抗EGFR、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自美國CST公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

從冰箱中取出細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇。觀察細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶的平底壁時，倒掉培養(yǎng)液，沖洗后，胰蛋白酶消化，37℃孵育3 min，觀察細(xì)胞變圓、間隙變大時，加入RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，細(xì)胞分瓶培養(yǎng)。

1.2.2 實時聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）檢測EGFR mRNA和BAG-1 mRNA的表達(dá)

1.2.2.1 總RNA提取 （5～10）×106個細(xì)胞中加Trizol 1 mL，吹吸裂解后室溫靜置5 min。取出勻漿，加氯仿200 μL，混勻，4℃下12 000 r/min 離心15 min。取上層，加等體積的異丙醇，混勻，室溫下放置10 min，4℃下12 000 r/min離心10 min。棄上清，加75%乙醇1 mL，4℃，7500 r/min離心5 min，棄上清。晾干后加DEPC 20 μL溶解。

1.2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 反應(yīng)體系5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix1 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，Total RNA 1 μg，RNase Free dH2O加至反應(yīng)體系體積20 μL，條件37℃，15 min，85℃ 5 s。-20℃冰箱保存。

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增 采用預(yù)混試劑Premis Taq擴(kuò)增。94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 min，BAG-1 57℃退火30 min，EGFR 58℃退火30 min，7℃延伸15 min，72℃延伸10 min，進(jìn)行35個循環(huán)。BAG-1產(chǎn)物片段160 bp，EGFR產(chǎn)物片段163 bp，β-actin產(chǎn)物片段205 bp。1.5瓊脂糖將凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物。

1.2.2.4 Real-time PCR 反應(yīng)液體系20 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，目的基因上游引物0.4 μL， 下游引物0.4 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，57℃退火30 s，變性和退火進(jìn)行39個循環(huán)。溶解曲線65～95℃。分析結(jié)果，根據(jù)實時熒光定量PCR相對定量檢測方法。

1.2.3 Western blot 法檢測EGFR蛋白和BAG-1蛋白表達(dá)

倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS液沖洗3次，每孔加裂解液80 μL，在冰面上晃動6孔板10次，細(xì)胞充分裂解，將蛋白吸入到EP管中，100℃水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清至EP管內(nèi)，檢測蛋白濃度。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，灌注凝膠后，上樣，恒流20 mA電流電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗，4℃過夜，TBST洗5～10 min，重復(fù)3次，加二抗，室溫1 h，TBST洗5～10 min，重復(fù)3次。顯影，曝光。EGFR呈棕黃色顆粒，主要定位在細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，不同細(xì)胞株間BAG-1 mRNA、EGFR mRNA及其蛋白表達(dá)水平比較采用采用F檢驗和t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞株EGFR mRNA以及EGFR蛋白表達(dá)情況

圖1結(jié)果顯示，MDA-MB-231、T47D細(xì)胞株EGFR mRNA陽性表達(dá)，MCF-7、SLBP3細(xì)胞株EGFR mRNA不表達(dá)。圖2結(jié)果顯示T47D細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞株EGFR蛋白強(qiáng)表達(dá)，MCF-7、SLBP3細(xì)胞株EGFR蛋白陰性表達(dá)。

1為MCF-7細(xì)胞株β-actin；2為MDA-MB-231細(xì)胞株β-actin；3為SLBP3細(xì)胞株β-actin；4為T47D細(xì)胞株β-actin；5為MCF-7細(xì)胞株EGFR mRNA；6為MDA-MB-231細(xì)胞株EGFR mRNA；7為SLBP3細(xì)胞株EGFR mRNA；8為T47D細(xì)胞株EGFR mRNA；EGFR：表皮生長因子受體

圖1 不同細(xì)胞株EGFR mRNA水平

1為T47D細(xì)胞株；2為MDA-MB-231細(xì)胞株；3為MCF-7細(xì)胞株；4為SKBR3細(xì)胞株

圖2 不同細(xì)胞株表皮生長因子受體蛋白水平

2.2 EGFR（+）和EGFR（-）細(xì)胞株BAG-1 mRNA以及蛋白表達(dá)

EGFR（+）和EGFR（-）細(xì)胞株BAG-1 mRNA T47D細(xì)胞株BAG-1 mRNA的表達(dá)水平最高，其次為MDA-MB-231細(xì)胞株，兩者的表達(dá)水平均顯著高于MCF-7和SKBR3細(xì)胞株。△CT值：T47D細(xì)胞株與MDA-MB-231及MCF-7及SKBR3細(xì)胞株比較，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t = 14.8、19.8、36.3，P < 0.01）；MDA-MB-231細(xì)胞株與MCF-7及SKBR3細(xì)胞株比較，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t = 3.7、20.6，P < 0.01）；MCF-7細(xì)胞株比與SKBR3細(xì)胞株比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t = 17.4，P < 0.01）。mRNA表達(dá)量：T47D細(xì)胞株與MDA-MB-231、MCF-7及SKBR3細(xì)胞株比較，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t = 101.5、88.4、158.9，P < 0.01）；MDA-MB-231細(xì)胞株與MCF-7及SKBR3細(xì)胞株比較，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t = 9.9、46.7，P < 0.01）；MCF-7細(xì)胞株比與SKBR3細(xì)胞株比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t = 17.5，P < 0.01）。見表1，圖3、4。

表1 不同EGFR表達(dá)水平細(xì)胞BAG-1 mRNA表達(dá)量比較

注：△CT值=BAG-1 CT值-βactin CT值；EGFR：表皮生長因子受體

1為MDA-MB-231細(xì)胞β-actin；2為MCF-7細(xì)胞β-actin；3為SKBR3細(xì)胞β-actin；4為T47D細(xì)胞β-actin；5為MDA-MB-231細(xì)胞；6為MCF-7細(xì)胞；7為SKBR3細(xì)胞；8為T47D細(xì)胞

圖3 EGFR（+）和EGFR（-）細(xì)胞株BAG-1 mRNA表達(dá)

1為MDA-MB-231細(xì)胞株；2為MCF-7細(xì)胞株；3為SKBR3細(xì)胞株；4為T47D細(xì)胞株

圖4 不同ERGF表達(dá)水平的細(xì)胞株BAG-1蛋白表達(dá)水平

3 討論

乳腺癌是臨床常見腫瘤，主要以女性為主，嚴(yán)重威脅女性的生活質(zhì)量及生命健康。隨著檢測方法的不斷發(fā)展，其檢出率在逐漸上升，并且早期乳腺癌的檢出率越來越高，為根治手術(shù)提供了可能。目前，臨床上根治乳腺癌的方法主要是手術(shù)治療，術(shù)后輔以化療以及內(nèi)分泌治療?；熑狈Π邢蛐裕涣挤磻?yīng)較嚴(yán)重，造成醫(yī)療資源的浪費，還可導(dǎo)致耐藥的發(fā)生，甚至產(chǎn)生不可逆的副作用，而導(dǎo)致治療失敗。目前學(xué)界的研究方向是試圖找到在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的分子，通過針對性的靶向治療，提高療效，降低不良反應(yīng)。目前乳腺癌靶向治療的靶點包括催乳素受體（PR）、雌激素受體（ER）、人類表皮受體（Her-2）等。目前針對PR、ER、Her-2的治療已經(jīng)實現(xiàn)了個體化治療，能夠顯著延長患者的無病生存期以及總生存率[7-9]。但是研究顯示，Herceptin單藥治療Her-2陽性的乳腺癌患者的有效率較低，僅為15%～30%[10]。這提示已經(jīng)明確的靶向治療的靶點外，還存在其他與靶點相互作用的分子，影響了靶向治療的效果。

EGFR與Her-2均屬于表皮生長因子家族，根據(jù)結(jié)構(gòu)功能分為4種類型，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和存活。EGFR是一種跨膜蛋白，編碼的蛋白具有酪氨酸激酶活性[11-12]。EGFR分為細(xì)胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)以及細(xì)胞外區(qū)。細(xì)胞外由621個氨基酸殘基，是受體部位，跨膜區(qū)由23個氨基酸殘基，細(xì)胞內(nèi)分為近膜區(qū)與激酶區(qū)。轉(zhuǎn)化生長因子α、表皮生長因子、表皮素等配體與受體部位結(jié)合，相互作用，形成同源二聚體或者異源二聚體，跨膜區(qū)發(fā)生變化，激活細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶，其與ATP酶結(jié)合，發(fā)生自身磷酸化及轉(zhuǎn)磷酸化從而促使底物水平磷酸化，產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，信息傳入細(xì)胞核，促進(jìn)腫瘤血管化形成及細(xì)胞增殖，甚至促進(jìn)腫瘤的局部浸潤以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等[13-15]。EGFR在上皮性腫瘤存在高表達(dá)，往往惡性程度高、預(yù)后差。本次研究結(jié)果顯示乳腺癌T47D細(xì)胞株和MDA-MB-231細(xì)胞株中EGFR mRNA以及EGFR蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)，尤其以T47D細(xì)胞株的表達(dá)最高。

基底樣型乳腺癌不表達(dá)PR、ER和Her-2/neu，但是表達(dá)EGFR，對患者的預(yù)后具有預(yù)測作用。BLBC亞型缺乏具有針對性的靶點，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，預(yù)后差。而將EGFR作為靶點可能是有效的治療途徑。EGFR的高表達(dá)與乳腺癌患者針對ER和PR的內(nèi)分泌治療的耐藥具有一定的相關(guān)性[16-18]。而在針對ER和PR的內(nèi)分泌治療中聯(lián)合吉非替尼可延緩耐藥情況的出現(xiàn)。EGFR絡(luò)氨酸激酶抑制劑的耐藥機(jī)制可能包括EGFR發(fā)生突變、c-MET擴(kuò)增、Her-2突變、上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、PTEN信號通路作用、胰島素樣生長因子的表達(dá)、KRAS基因發(fā)生突變等。EGFR TK區(qū)發(fā)生突變影響吉非替尼的敏感性。EGFR第20號外顯子的突變與抑制TKIs作用降低有關(guān)。EGFR外顯子20 790密碼子的突變，與EGFR-TKI的耐藥有關(guān)。c-MET的擴(kuò)增依賴Her-3活化的PI3K信號通路。研究顯示，Her-2發(fā)生突變的患者對EGFR TKI耐藥，但對針對Her-2的靶向治療仍然敏感。去除Her-2后，對EGFRTKI的敏感性恢復(fù)，說明Her-2的突變與EGFR的靶向治療耐藥有關(guān)。因此在臨床工作中可以考慮聯(lián)合抗Her家族抗體治療。PTEN通路能夠下調(diào)Akt基因，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PTEN功能喪失，Akt呈現(xiàn)過度表達(dá)，導(dǎo)致抵抗凋亡，產(chǎn)生針對EGFR TKI的耐藥。胰島素樣生長因子-1的表達(dá)與吉非替尼的敏感性呈負(fù)相關(guān)。KRAS是EGFR信號通路的下游分子，其突變影響EGFR的靶向治療，是導(dǎo)致EGFR TKI的耐藥機(jī)制之一。

BAG-1屬于抗凋亡基因，屬于共分子伴侶家族，其編碼的蛋白與細(xì)胞的多部位靶點結(jié)合，具有多種功能[19-20]。BAG-1 mRNA翻譯的起始點不同，獲得的亞型也不同，不同亞型在結(jié)構(gòu)、功能、細(xì)胞內(nèi)定位等均存在一定的差異。L亞型N端有定位信號，定位于細(xì)胞核，M亞型存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，BAG-1S與p29存在于細(xì)胞質(zhì)中。BAG-1的四個亞型均具有共同的C末端結(jié)構(gòu)域以及泛素樣結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)果對細(xì)胞維持生長發(fā)揮重要的作用。BAG結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)BAG-1和熱休克蛋白（HSP）發(fā)揮作用，恢復(fù)變性蛋白的作用。BAG的結(jié)構(gòu)域還與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶相互作用介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)。BAG-1泛素樣結(jié)構(gòu)域在BAG-1蛋白酶復(fù)合物的形成過程中發(fā)揮重要的作用。BAG-1參與抑制細(xì)胞的凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)，其與不同分子位點結(jié)合而發(fā)揮抗凋亡的作用，其與熱休克蛋白結(jié)合可抑制因放療、化療、細(xì)胞表面死亡分子活化、熱休克等導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[21]。BAG-1屬于共分子伴侶家族成員，直接與分子伴侶HSP70以及HSC70結(jié)合，刺激ATP酶活性，改變HSP70與底物的親和力。BAG蛋白可直接激活RAF-1而傳遞細(xì)胞信號。其還在其他細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮作用。BAG-1可直接與配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子NHR結(jié)合，并調(diào)節(jié)其功能，影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性。BAG-1還可ER等結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性。BAG-1可偶聯(lián)分子伴侶和蛋白酶復(fù)合體，調(diào)節(jié)蛋白折疊和降解平衡。BAG-1與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其在正常的乳腺組織中并不表達(dá)，但是在乳腺癌中卻可高表達(dá)。

在本次研究中，EGFR（+）的乳腺癌細(xì)胞株BAG-1也存在高表達(dá)，而EGFR（-）的乳腺癌細(xì)胞株中BAG-1也呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)，因此推測乳腺癌組織EGFR的表達(dá)與BAG-1的表達(dá)具有一定的相關(guān)性。理論上BAG-1可以作為治療靶點，通過抑制BAG-1，從而降低其對細(xì)胞凋亡的抑制以及細(xì)胞核激素功能的調(diào)節(jié)作用，從而促使腫瘤細(xì)胞的凋亡，達(dá)到抑制腫瘤的目的。從本次研究結(jié)果也顯示BAG-1與EGFR具有一定的相關(guān)性，而EGFR是重要的靶向治療的靶點，如果將BAG-1作為靶向治療的靶點，可以達(dá)到降低患者耐藥的情況，獲得更好的治療效果。研究顯示，在腸癌中，BAG-1是EGFR的調(diào)節(jié)基因，位于EGFR啟動子部位的DNA復(fù)合物中，用siRNA降低BAG-1的表達(dá)，可以顯著提高EGFR的表達(dá)水平，從而增加以EGFR為靶點抗癌藥物的治療效果[22]。有研究在乳腺癌發(fā)現(xiàn)BAG-1與EGFR的表達(dá)具有相關(guān)性，并且通過siRNA技術(shù)降低BAG-1水平，能夠升高EGFR水平，并且該項研究還比較干預(yù)前后細(xì)胞對針對EGFR靶向治療的吉非替尼藥物的治療耐受情況，結(jié)果顯示，干預(yù)后吉非替尼對細(xì)胞的抑制率顯著升高，這也提示，理論上將BAG-1作為靶向治療，降低乳腺癌小中BAG-1的表達(dá)，從而升高EGFR的表達(dá)，能夠提高靶向治療的效果[23]。

綜上所述，BAG-1抑制細(xì)胞的凋亡，其表達(dá)與EGFR的表達(dá)存在一定的相關(guān)性。EGFR陽性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株中BAG-1也呈現(xiàn)高表達(dá)，提示BAG-1可以作為乳腺癌靶向治療耐藥的靶點。本研究因條件有限，對BAG-1與EGFR相互的作用機(jī)制沒有進(jìn)行進(jìn)一步研究，期望在今后的研究中能夠進(jìn)一步明確其相互作用的機(jī)制。

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（收稿日期：2014-09-26 本文編輯：任 念）