前列腺癌細(xì)胞乳鼠移植瘤動(dòng)物模型的建立

曾家豫,張　虹,袁紅霞,?！⊥?廖世奇*

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州　730070；

2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院分子生物中心,甘肅蘭州　730050)

前列腺癌細(xì)胞乳鼠移植瘤動(dòng)物模型的建立

曾家豫1,張虹1,袁紅霞2,牛童1,廖世奇2*

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州730070；

2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院分子生物中心,甘肅蘭州730050)

摘要：為構(gòu)建前列腺癌細(xì)胞(PC3)乳鼠移植瘤動(dòng)物模型,在體外培養(yǎng)PC3細(xì)胞，經(jīng)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)篩選PC3細(xì)胞株中具有克隆形成能力的細(xì)胞，常規(guī)傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種約2×107mL-1單細(xì)胞懸液0.1 mL于出生2 d的乳鼠頸部和前肢交界處皮下，建立移植腫瘤動(dòng)物模型，觀察乳鼠腫瘤生長(zhǎng)特點(diǎn)，并用病理組織HE染色和免疫組織化學(xué)染色鑒定PC3在乳鼠皮下的成瘤情況.結(jié)果顯示注射后乳鼠未見(jiàn)明顯的不良反應(yīng).1~6 d可見(jiàn)乳鼠皮下腫脹，且能觸及到黃豆粒大小的腫物；7~15 d腫物變大，肉眼能觀察到明顯腫物；16~21 d時(shí)腫物有消退跡象.病理組織HE染色觀察顯示腫塊為腫瘤組織，免疫組織化學(xué)染色顯示腫物中CD133呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá).

關(guān)鍵詞：PC3；軟瓊脂克隆形成；乳鼠移植瘤；腫瘤組織

1材料與方法

1.1材料

Dulbecco’s modified eagie medium(DMEM)培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺(Gln)和胰蛋白酶(購(gòu)自Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(購(gòu)自Hyclone)，低熔點(diǎn)瓊脂糖(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，青霉素和鏈霉素(購(gòu)自甘肅省腫瘤醫(yī)院)，瑞士-吉姆薩染色液和臺(tái)盼蘭染液(購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，CD133抗體和免疫組化二抗試劑盒(購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，DAB染色試劑盒(購(gòu)自天根生化科技北京有限公司).

CO2培養(yǎng)箱(SANYO)，倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，普通光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)，細(xì)胞培養(yǎng)皿(NUNC)(蘭州鵬程生物技術(shù)有限公司).

3只Wistar孕鼠(購(gòu)自甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，待其生產(chǎn)后第2 d，對(duì)新生乳鼠進(jìn)行稱(chēng)重分類(lèi)，每只母鼠留8只乳鼠，每組設(shè)2只為對(duì)照組乳鼠，其余6只為實(shí)驗(yàn)組乳鼠.

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出凍存的PC3細(xì)胞，迅速放入預(yù)熱的37 ℃水浴鍋中，快速震蕩溶化，1 000 r·min-1離心5 min后，將細(xì)胞接種于已配制好的含10% FBS和1% L-Gln的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃,5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每隔2~3 d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待其長(zhǎng)到鋪滿皿底80%時(shí)傳代.

依據(jù)Friedenstein[11]提出的全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離和純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)做為陰性對(duì)照組細(xì)胞,常規(guī)傳代培養(yǎng).

1.3軟瓊脂克隆

1.3.1軟瓊脂儲(chǔ)備膠的制備下層膠制備：配制1.2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖，高壓滅菌，待其溫度降至37 ℃左右后置于37 ℃水浴鍋備用.取1.5 mL 1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖加入已經(jīng)配好的1.5 mL 2×DMEM培養(yǎng)基(含20% FBS+1% Gln)，混勻后倒入六孔板中制成軟瓊脂底板，置于冰袋上待其冷卻凝固后備用.上層膠制備：配制0.7%的低熔點(diǎn)瓊脂糖，高壓滅菌，待其溫度降至37 ℃左右后置于37 ℃水浴鍋備用，取1.5 mL 0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖加入已經(jīng)配好的約含有1~3×103mL-1PC3細(xì)胞的等體積2×DMEM培養(yǎng)基中，混勻后倒入軟瓊脂底層上，制成雙瓊脂層，置于冰袋上待其冷卻凝固后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7~14 d左右鏡檢，觀察軟瓊脂克隆團(tuán)的形成情況.

1.3.2單細(xì)胞軟瓊脂克隆團(tuán)的獲取軟瓊脂克隆團(tuán)形成第14 d置于倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)記并挑出較大克隆團(tuán)后置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng).第3 d觀察有無(wú)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)，若有則棄去含有瓊脂渣的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔2~3 d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿皿底80%~90%時(shí)傳代；若無(wú)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)則棄去培養(yǎng)皿，重新挑取單克隆團(tuán)細(xì)胞.

1.4乳鼠移植瘤動(dòng)物模型的構(gòu)建

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞PC3和對(duì)照組細(xì)胞BMSCs，經(jīng)胰蛋白酶消化后，DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r·min-1離心7 min，棄上清，DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度約為2×107mL-1.用1 mL注射器吸取0.1 mL PC3細(xì)胞懸液接種于實(shí)驗(yàn)組乳鼠皮下，對(duì)照組乳鼠皮下注射0.1 mL BMSCs細(xì)胞懸液.注射后每天定時(shí)觀察乳鼠皮下的成瘤情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下腫物的直徑，以大于0.5 cm為成瘤成功.

1.5病理組織觀察和免疫組織化學(xué)檢測(cè)

剝離乳鼠皮下產(chǎn)生的腫物，9% 福爾馬林液固定，組織過(guò)夜脫水后，石蠟包埋切片.切片組織經(jīng)過(guò)二甲苯和梯度酒精脫水脫蠟，蘇木精染色3~5 min，1% HCl分色1~3 s，碳酸鋰返藍(lán)2 min，伊紅染色2 min，酒精脫水，干燥后中性樹(shù)脂封片.在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理切片形態(tài).

免疫組織化學(xué)染色按照免疫組化二抗試劑盒說(shuō)明書(shū)操作：石蠟切片烘烤30 min后，二甲苯和梯度酒精脫水脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)5 min，PBS沖洗3×3 min，3%去離子水孵育15 min,PBS沖洗3×3 min，滴加試劑A(山羊血清)室溫孵育15 min，傾去勿洗，滴加一抗(陰性對(duì)照組一抗用PBS代替)，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗3×3 min，滴加試劑B室溫孵育15 min，PBS沖洗3×3 min，滴加試劑C室溫孵育15 min，PBS沖洗3×3 min，DAB顯色，自來(lái)水沖洗，干燥，中性樹(shù)脂封片.光學(xué)顯微鏡下觀察抗體表達(dá)部位.

2結(jié)果與分析

2.1PC3軟瓊脂克隆團(tuán)產(chǎn)生和單細(xì)胞克隆團(tuán)形成

圖1軟瓊脂克隆

Fig 1Soft agar colony formation assay

A.PC3細(xì)胞軟瓊脂克隆團(tuán)形成第7 d；B.PC3細(xì)胞軟瓊脂克隆團(tuán)形成第13 d；C.分離培養(yǎng) PC3細(xì)胞軟瓊脂克隆團(tuán)，D. PC3細(xì)胞軟瓊脂克隆團(tuán)挑出后瑞士吉姆薩染色.CCG.細(xì)胞克隆團(tuán)；SCPC.軟瓊脂克隆團(tuán)挑出細(xì)胞.

A.The 7 day of PC3 cells soft agar cloning formation;B.The 13 day of PC 3 soft agar cloning formation;C.Separately cultured PC3 cells;D.Switzerland - Jim dyeing separately cultured PC3 cells.CCG.Cell clone group.SCPC.Soft agar cloning pick out the cell.

PC3接種第7 d時(shí)軟瓊脂上產(chǎn)生了較小的細(xì)胞克隆團(tuán)(圖1：A)，待其長(zhǎng)到13 d時(shí)，形成較大的細(xì)胞克隆團(tuán)(圖1：B).選取較大克隆團(tuán)細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)(圖1：C，D)后發(fā)現(xiàn)，這部分從軟瓊脂克隆團(tuán)上挑出的單細(xì)胞比未經(jīng)軟瓊脂克隆的細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖能力.

2.2乳鼠皮下成瘤

18只實(shí)驗(yàn)組乳鼠皮下均有直徑大于0.5 cm的腫物產(chǎn)生，6只對(duì)照組乳鼠皮下均無(wú)異物產(chǎn)生且生長(zhǎng)狀態(tài)良好.肉眼觀察實(shí)驗(yàn)組乳鼠發(fā)現(xiàn)：注射第2 d后乳鼠腋下發(fā)紅腫脹，觸摸質(zhì)軟；第3~4 d乳鼠腋下發(fā)紅完全消失，腫脹部分逐漸變硬，觸摸可發(fā)現(xiàn)有黃豆粒大小可移動(dòng)腫物存在(圖2：A).第7 d乳鼠皮下腫物逐漸增大，觸摸質(zhì)硬(圖2：B).第16 d之后，部分乳鼠維持腫物大小不變，部分乳鼠腫物開(kāi)始消退(圖2：C).第21 d之后，除3只乳鼠皮下存在極小腫物外(圖2：D)，其余乳鼠腫物均消退.表明在初接種PC3細(xì)胞時(shí)乳鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，腫瘤細(xì)胞能夠被宿主的免疫系統(tǒng)接受并逃離免疫系統(tǒng)的監(jiān)控即具有免疫耐受性，使腫瘤在皮下發(fā)生并生長(zhǎng).接種16 d及之后，有部分乳鼠皮下腫物開(kāi)始消退，提示此時(shí)接種鼠的免疫系統(tǒng)已逐漸發(fā)育完全，能夠?qū)臃N的異質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫監(jiān)控和殺滅.接種21 d后，只有3只鼠皮下存在腫瘤，類(lèi)似于部分腫瘤存在于人類(lèi)非免疫缺陷人群中，其余鼠消退證明此時(shí)小鼠免疫功能已發(fā)育完全.

2.3病理組織變化和CD133表達(dá)

觀察病理組織切片HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：腫物組織內(nèi)有大片彌漫性分布、紊亂無(wú)章排列的腫瘤細(xì)胞存在，細(xì)胞形態(tài)大小不一，核大深染，可見(jiàn)明顯病理性不規(guī)則核分裂相，為中度不典型增生，病理學(xué)上診斷為腫瘤組織(圖3：A).免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示該腫瘤組織表達(dá)了前列腺癌干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物分子CD133細(xì)胞膜和細(xì)胞漿均呈陽(yáng)性(++)(圖3：B).

3討論

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，在生物體內(nèi)直接研究癌細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)理和細(xì)胞生物學(xué)特性受到很多因素的影響.因此，建立理想動(dòng)物移植瘤模型對(duì)各種基礎(chǔ)研究和臨床研究都有非常重要的意義，但要求該模型的腫瘤發(fā)生部位、發(fā)病機(jī)制以及生物學(xué)特性等方面均要符合所研究的人源腫瘤.可移植腫瘤動(dòng)物模型具有接種腫瘤細(xì)胞后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物帶有同一腫瘤，個(gè)體差異較小、生長(zhǎng)狀況和宿主反應(yīng)一致，可以較為客觀的判斷腫瘤治療的療效等特點(diǎn)，在目前腫瘤模型研究中應(yīng)用較為廣泛.腫瘤動(dòng)物模型的移植主要有兩種[12]：同種移植和異種移植；同種移植是指模型動(dòng)物間的移植，而異種移植是指任何人和裸鼠之間的移植.一般的鼠移植性實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤為自發(fā)性或者誘發(fā)性腫瘤，這部分腫瘤經(jīng)傳代后可保持其原有特性，從而成為移植性腫瘤.

圖2　乳鼠注射PC3后的成瘤圖

A.接種PC3 3 d乳鼠皮下腫物；B.接種PC3 7 d乳鼠皮下腫物；C.接種PC3 17 d乳鼠皮下腫物；D.接種PC3 21 d乳鼠皮下腫物；E.接種PC3 10 d皮下解剖圖；F.剝離腫物.Sm.皮下腫物；SMD.皮下腫物消失；SSM.皮下小腫物；Pt.剝離腫物.

A.The subcutaneous masses of inoculated with PC3 cells 3 day;B.The subcutaneous masses of inoculated with PC3 cells 7 day;C.The subcutaneous masses of inoculated with PC3 cells 17 day;D.The subcutaneous masses of inoculated with PC3 cells 21 day;E.Subcutaneous anatomy of inoculation with PC3 10 day;F.Peel tumor.Sm.Subcutaneous masses；SMD.Subcutaneous masses disappear；SSM.Subcutaneous small masses；Pt.Peel tumor；

圖3　乳鼠皮下腫物HE染色和免疫組化CD133抗體染色

A.乳鼠皮下腫物病理HE染色；B.乳鼠皮下腫物免疫組化CD133抗體染色;M.核分裂相．

A.Neonatal mice subcutaneous tumor of HE staining;B.Neonatal mice subcutaneous tumor of CD133 antibody immunohistochemical staining;M.Mitotic．

軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)(Soft agar assay)是體外研究腫瘤的一項(xiàng)重要實(shí)驗(yàn)，常用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞[13].Li等人的研究發(fā)現(xiàn)[14]：通過(guò)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)篩選出的腫瘤細(xì)胞在動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)中具有強(qiáng)的成瘤和轉(zhuǎn)移能力，并且具有腫瘤干細(xì)胞特性[15].因此本實(shí)驗(yàn)利用目前研究較為成熟的前列腺癌細(xì)胞PC3中存在極少部分具有致瘤性的CD133+前列腺癌干細(xì)胞[16-18]做為模型動(dòng)物的接種細(xì)胞系，通過(guò)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)篩選出此類(lèi)細(xì)胞中具有強(qiáng)克隆集落形成能力和增殖能力的腫瘤細(xì)胞接種于乳鼠皮下，提高致瘤成功率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：接種PC3細(xì)胞乳鼠成瘤率為100%，在接種2~15 d移植瘤穩(wěn)定而快速增長(zhǎng)，移植瘤經(jīng)剝離后病理切片HE染色觀察有大片彌漫性分布的癌細(xì)胞，且有典型的病理學(xué)不規(guī)則核分裂相存在，病理學(xué)上診斷為腫瘤組織，免疫組織化學(xué)染色后前列腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133表達(dá)水平呈強(qiáng)陽(yáng)性，表明本實(shí)驗(yàn)成功建立了乳鼠移植瘤模型.

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用出生2 d乳鼠成功構(gòu)建了動(dòng)物移植瘤模型，由于剛出生乳鼠的免疫細(xì)胞在個(gè)體發(fā)育的早期對(duì)抗原易形成耐受性，因此易于移植瘤的成活和生長(zhǎng)，同時(shí)正常的免疫機(jī)體環(huán)境也模擬了臨床上腫瘤發(fā)生的微環(huán)境.此外，乳鼠移植瘤模型能夠體現(xiàn)宿主免疫監(jiān)控移植瘤這一過(guò)程，模擬臨床腫瘤發(fā)生.且這一模型具有成瘤率高、易于存活、生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是一種比較理想的移植瘤動(dòng)物模型.

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(責(zé)任編輯俞詩(shī)源)

E-mail:zengjy@nwnu.edu.cn

*通訊聯(lián)系人，男，研究員，博士.主要研究方向?yàn)樘禺愋院怂徇m配體的篩選和干細(xì)胞的分化阻斷.

E-mail:lshiqi@126.com

Establishment of the prostate cancer xenograft

model in neonatal mice

ZENG Jia-yu1,ZHANG Hong1,YUAN Hong-xia2,NIU Tong1,LIAO Shi-qi2

(1.College of Life Sciences,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,Gansu,China;

2.Laboratory of Molecular Biology,Gansu Academy of Medical Sciences,Lanzhou 730050,Gansu,China)

Abstract:To establishment prostate cancer cell(PC3) xenograft model in neonatal mice,PC3 cell strain is culture in vitro and perform the soft agar assay to screen the PC3 cells for their ability wihch can form colonies in soft agar.After passaged by conventional methods,the cells which in logarithmic growth phase are collect,and then make into single-cell suspension with cell density of 2×107mL-1.0.1 mL single-cell suspension is injected subcutaneously into the cross point of neck and fore limb in 2 d newborn neonatal mice.The growth characteristics of transplanting PC3 in mice are observed and the tumor properties are identified by histopathology and immunohistochemistry in neonatal mice subcutaneous.Results show there is no adverse reactions in neonatal mice after the injection.The mice subcutaneous swelling and solid bean-like pallet can be felt in 1~6 d,the tumor become large and the naked eye can be observed significant oncogenesis in 7~15 d.But there are signs of tumor regression in 16~21 d.Pathological HE staining indicates that the mass of oncogenesis are tumor tissue and immunohistochemical staining shows the tumor tissue expression of CD133 strong positive.

Key words:PC3;soft agar colony formation;neonatal mice xenograft;tumor tissue隨著腫瘤起源問(wèn)題研究的不斷深入，腫瘤的治療實(shí)驗(yàn)也開(kāi)始迅速發(fā)展.動(dòng)物移植瘤模型是腫瘤實(shí)驗(yàn)研究中一項(xiàng)非常重要的手段,因此，建立理想的動(dòng)物移植瘤模型對(duì)研究各種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移能力及分子機(jī)制調(diào)控有極其重要的意義[1].可移植腫瘤動(dòng)物模型是目前應(yīng)用最為廣泛的腫瘤研究模型[2]，常見(jiàn)的移植瘤動(dòng)物模型有裸鼠移植瘤模型[3]、環(huán)磷酰胺(CTX)免疫抑制小鼠模型[4]以及正常BALC/c小鼠[5]模型.有研究顯示[6-7]，理想的移植瘤動(dòng)物模型中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)為免疫功能正常、成瘤后動(dòng)物有一定成活期的近交系.乳鼠作為一種機(jī)體免疫功能尚未發(fā)育完全的小鼠，具有在移植瘤初期對(duì)抗原易形成耐受性的特點(diǎn)，常被廣泛應(yīng)用于病原體的致病性和毒理學(xué)研究，特別在藥品監(jiān)測(cè)和相關(guān)特殊科研中[8-10]，但以乳鼠作為移植瘤模型未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道.因此，本實(shí)驗(yàn)擬以出生2 d左右的乳鼠做為移植瘤模型動(dòng)物，皮下注射PC3細(xì)胞構(gòu)建動(dòng)物移植瘤模型，旨在為腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究提供新的模型動(dòng)物.

中圖分類(lèi)號(hào)：R-332

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-988Ⅹ(2015)02-0073-05

作者簡(jiǎn)介：曾家豫(1962—)，男，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，教授，博士.主要研究方向?yàn)榉肿用笇W(xué)和酶的固定化.