磁性納米多孔復(fù)合材料的致突變?cè)囼?yàn)研究

黃義鴻 朱偉民 王大平

·短篇論著·

磁性納米多孔復(fù)合材料的致突變?cè)囼?yàn)研究

黃義鴻 朱偉民 王大平

目的 從遺傳毒理學(xué)方面了解并評(píng)價(jià)磁性納米多孔復(fù)合(Nano-HA/PLLA/Fe2O3)材料的生物相容性, 從而為其在移植肌腱固定的臨床運(yùn)用提供依據(jù)。方法 用Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復(fù)合界面固定材料制備混懸液, 進(jìn)行Ames致突變?cè)囼?yàn), 以檢測(cè)其對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌的致突變比值(實(shí)驗(yàn)組回變菌落數(shù)/陰性對(duì)照組回變菌落數(shù))。結(jié)果 4個(gè)菌株在各個(gè)受試濃度待測(cè)液在加S9與不加S9的情況下, 致突變比值即實(shí)驗(yàn)組回變菌落數(shù)與陰性對(duì)照組回變菌落數(shù)的比值(Rt/Rc)均<2.0, 而陽(yáng)性對(duì)照組致突變比值則均>2.0。結(jié)論 Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復(fù)合界面固定材料不引起鼠傷寒沙門(mén)菌的回復(fù)突變數(shù)增加, 說(shuō)明此材料無(wú)致基因突變性。

磁性納米多孔復(fù)合材料；致突變?cè)囼?yàn)

本研究通過(guò)低溫快速成型儀將Nano-HA、PLLA、Fe2O3這三種材料復(fù)合制備得到Nano-HA/PLLA/Fe2O3支架材料,并參照國(guó)內(nèi)外對(duì)生物材料評(píng)價(jià)方面的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn), 擬通過(guò)Ames試驗(yàn)從遺傳毒理性方面來(lái)評(píng)價(jià)此Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復(fù)合界面固定材料的生物相容性, 從而為其運(yùn)用于前交叉韌帶重建術(shù)中移植肌腱界面固定的臨床應(yīng)用提供安全性依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)所用的Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復(fù)合界面固定材料由深圳市第二人民醫(yī)院組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院聯(lián)合研制, 立方體(25 mm× 25 mm×25 mm)。Nano-HA/PLLA/Fe2O3材料先用紫外線照射30 min, 經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS液)浸泡、清洗, 75%乙醇浸泡消毒后干燥備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 取Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復(fù)合界面固定材料, 按重量比以2.5%羥甲基纖維素鈉溶液配成5 mg/ml, 0.5 mg/ml及0.01 mg/ml三種不同濃度的混懸液受試。菌種采用由美國(guó)Ames實(shí)驗(yàn)室提供并由湖南省疾病控制中心繁殖保存的鼠傷寒沙門(mén)菌組氨酸缺陷型菌株(TA-97、TA-98、TA-100和TA-102), 經(jīng)性狀鑒定合格后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復(fù)合界面固定材料是用于人體內(nèi)植入的, 植入人體后肝細(xì)胞微粒體酶系(S9)就有可能誘變HA(假如HA有誘變作用), 而細(xì)胞體內(nèi)無(wú)此酶, 為了使實(shí)驗(yàn)條件更接近體內(nèi)環(huán)境, 將培養(yǎng)板分為活化實(shí)驗(yàn)組(加S9溶液)和非活化實(shí)驗(yàn)組(不加S9溶液)。大鼠肝臟微粒體酶系(S9)由多氨聯(lián)苯誘導(dǎo), 制成肝勻漿后-80℃冰箱內(nèi)保存,使用時(shí)用2-氨基芴測(cè)定其活力。實(shí)驗(yàn)用柔毛霉素(濃度為25 μg/0.1 ml)作為菌株培養(yǎng)時(shí)的直接致突變活性指示(不加S9), 2-氨基芴(50 μg/0.1 ml)作為菌株的間接致突變活性指示(加S9)；以疊氮化鈉(5 μg/0.1 ml)作為陽(yáng)性對(duì)照, 以同樣體積生理鹽水作為陰性對(duì)照。每個(gè)菌種的各個(gè)劑量組均各設(shè)3個(gè)平行皿。

通過(guò)平板滲入法將不同濃度組混懸液與菌株在最低營(yíng)養(yǎng)板上混合培養(yǎng), 經(jīng)37℃培養(yǎng)48 h后, 分別進(jìn)行觀察回變菌落數(shù)結(jié)果。每組取其3個(gè)平行培養(yǎng)皿的平均回變菌落數(shù), 依據(jù)出現(xiàn)的致突變比值(如下式計(jì)算)檢測(cè)Nano-HA材料制品中是否存在誘變物質(zhì)。

致突變比值(MR)= 實(shí)驗(yàn)組回變菌落數(shù)(Rt)/ 陰性對(duì)照組回變菌落數(shù)(Rc)

2 結(jié)果

4個(gè)菌株在各個(gè)受試濃度待測(cè)液在加S9與不加S9的情況下, 致突變比值即實(shí)驗(yàn)組回變菌落數(shù)與陰性對(duì)照組回變菌落數(shù)的比值(Rt/Rc)均<2.0, 而陽(yáng)性對(duì)照組致突變比值則均>2.0, 據(jù)此可以認(rèn)為Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復(fù)合界面固定材料在Ames試驗(yàn)中無(wú)致突變性。

3 討論

生物相容性是指材料與人體之間相互作用產(chǎn)生各種復(fù)雜的生物、物理、化學(xué)反應(yīng), 以及人體對(duì)這些反應(yīng)的忍受程度［1,2］。根據(jù)ISO10993標(biāo)準(zhǔn)的要求, 生物醫(yī)學(xué)材料長(zhǎng)期接觸人體或植入人體內(nèi)組織、血液應(yīng)進(jìn)行潛在的遺傳毒性方面的生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)。Ames試驗(yàn)是由美國(guó)的B.N.Ames在1975年建立的鼠傷寒沙門(mén)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn), 是一種已被公認(rèn)并廣泛開(kāi)展的致突變鑒定方法。此方法能夠在短期內(nèi)檢測(cè)醫(yī)用材料有無(wú)致突變性。

本實(shí)驗(yàn)將Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復(fù)合界面固定材料浸提液與各標(biāo)準(zhǔn)菌液混合后在最低營(yíng)養(yǎng)板上培養(yǎng), 依據(jù)出現(xiàn)的回變菌落數(shù)及致突變比值來(lái)判斷復(fù)合人工骨是否存在誘變物質(zhì)。考慮到材料是用于植入人體的, 為使實(shí)驗(yàn)條件更接近體內(nèi)環(huán)境, 以排除人體肝細(xì)胞微粒體酶系(S9)可能造成的激活誘變作用(間接誘變), 使得實(shí)驗(yàn)更具可信度, 作者在實(shí)驗(yàn)中對(duì)把材料浸提液的檢測(cè)分為S9(+)組和S9(-)組, 觀察用S9誘發(fā)后回變菌落數(shù)有無(wú)增加。另外, 在操作及觀察結(jié)果過(guò)程中注意嚴(yán)格無(wú)菌操作以排除雜菌污染, 進(jìn)而保證本試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示, 各菌株在各濃度待測(cè)液組中回變菌落平均數(shù)均未超過(guò)其相應(yīng)陰性對(duì)照組回變菌落平均數(shù)的2倍(MR<2), 顯示該材料在有、無(wú)S9的情況下均無(wú)誘變活性；而陽(yáng)性對(duì)照組各菌株回變菌落平均數(shù)均超過(guò)其相應(yīng)陰性對(duì)照組回變菌落平均數(shù)的2倍以上(MR>2), 證實(shí)鼠傷寒沙門(mén)菌的組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株對(duì)受試物的檢測(cè)有效。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明此Nano-HA人工骨材料無(wú)遺傳毒性作用, 其用于體內(nèi)植入是安全的, 這為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

［1］ 郝和平.醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施指南.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2002:81-135.

［2］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局.生物材料和醫(yī)療器材生物學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)要求.北京:人民衛(wèi)生出版社, 1997:502-523.

Research of mutagenicity test for magnetic nanometer perforated composite materials

HUANG Yihong, ZHU Wei-min, WANG Da-ping.Department of Rheumatology, Shenzhen City the Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, China

Objective To understand and evaluate the biocompatibility of magnetic nanometer perforated composite materials (Nano-HA/PLLA/Fe2O3) by genetic toxicology, in order to provide reference for its clinical application in tendon transplantion fixation.Methods Suspension was made by Nano-HA/PLLA/Fe2O3magnetic nanometer composite interface fixation material for Ames mutagenicity test, in order to detect its mutagenicity ratio (number of revertant bacterial colony in research group/number of revertant bacterial colony in negative control group) for salmonella typhimurium.Results All the 4 strains in different tested concentrations with or without S9 had mutagenicity ratio as number of revertant bacterial colony in experimental group/number of revertant bacterial colony in control group (Rt/Rc) <2.0, while the ratio with positive control group was >2.0.Conclusion Nano-HA/PLLA/Fe2O3magnetic nanometer composite interface fixation material will not induce increasing number of revertant mutation, which suggests this material contains no mutagenicity.

Magnetic nanometer perforated composite material; Mutagenicity test

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.17.017

2015-02-04］

深圳市科技研發(fā)資金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：CXZZ 20130321152713220)；廣東省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：B2012320)；廣東省教育廳育才項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2012LYM_0120)

518035 深圳市第二人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科