細胞基因組“維穩(wěn)”的DNA修復(fù)機制
——2015年諾貝爾化學(xué)獎介紹

孔璐，丁衛(wèi)

（首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京100069）

細胞基因組“維穩(wěn)”的DNA修復(fù)機制
——2015年諾貝爾化學(xué)獎介紹

孔璐，丁衛(wèi)

（首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京100069）

適逢2015年的金秋十月國慶假期，10月7日北京時間下午5點45分，從瑞典皇家科學(xué)院傳來消息：本年度的諾貝爾化學(xué)獎授予了托馬斯·林道爾（瑞典）、保羅·莫德里奇（美國）和阿奇茲·桑賈爾（美國/土耳其），以表彰他們對細胞DNA 修復(fù)機制研究所作出的杰出貢獻。3人將平均分享總值969000美元的獎金（圖1）。

1 獲獎?wù)吆喗?/h2>

林道爾（Lindahl，1938～）生于瑞典首都斯德哥爾摩。1967和1970年分別獲得卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院（KarolinskaInstitutet）的博士（Ph.D）和醫(yī)學(xué)博士（M.D.）。隨后赴美國普林斯頓大學(xué)和洛克菲勒大學(xué)從事博士后研究。1978年任瑞典哥德堡大學(xué)（University of Gothen-burg）藥物化學(xué)系教授。1986年至今擔(dān)任英國弗朗西絲克里克研究所（Francis Crick Institute）研究員和克萊爾霍爾癌癥研究室（Cancer Research UK at Clare HallLaboratory）的負責(zé)人。博士后期間，林道爾開始關(guān)注機體DNA穩(wěn)定性的維持及其相關(guān)機制問題[1]：面對細胞基因組數(shù)以千計的損傷頻率，生命的持續(xù)必然需要有一套不可或缺的DNA分子修復(fù)系統(tǒng)[2]。在后續(xù)35年的研究中，林道爾先后發(fā)現(xiàn)并鑒定了一系列DNA修復(fù)蛋白[3]。還在研究B淋巴細胞被EB病毒（Epstein-Barr virus）感染后DNA的改變時，首次鑒定出轉(zhuǎn)化的淋巴細胞中存在二倍閉環(huán)病毒DNA[4]。1986年，林道爾通過總結(jié)在克萊爾實驗室的工作，逐漸揭示出“堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）”分子機制的全部過程以及其中糖苷酶（glycosylases）的重要作用[5]。1996年，林道爾成功地在體外實驗中對人體內(nèi)的這種DNA修復(fù)機制進行了重構(gòu)和確認。他同時指出，BER修復(fù)機制并不能完全保證細胞內(nèi)DNA分子豁免損傷的出現(xiàn)和累積[6]，從而激勵了研究者對其他機制的探索和發(fā)現(xiàn)。

莫德里奇（Modrich，1946～）出生于美國新墨西哥州。1973年在斯坦福大學(xué)獲得博士（Ph.D）學(xué)位?，F(xiàn)任美國杜克大學(xué)（Duke University）醫(yī)學(xué)院的生物化學(xué)教授，以及霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所（Howard HughesMedical Institute，HHMI）的研究員。莫德里奇的研究興趣集中在作用于DNA的酶類，包括DNA連接酶、DNA聚合酶以及限制性內(nèi)切酶等。20世紀70年代末，莫德里奇的研究重點轉(zhuǎn)移到一種稱為Dam 的DNA甲基化酶。Dam可對DNA進行甲基化修飾，幫助特定的限制性內(nèi)切酶對DNA分子特定位點的識別和切割。通過與哈佛大學(xué)的分子生物學(xué)家馬修·梅賽爾森（Matthew Meselson）[7]的密切合作，他們于1976年發(fā)現(xiàn)了細菌DNA修復(fù)中的“限制－修飾”現(xiàn)象。通過構(gòu)建一種攜帶數(shù)個堿基配對錯誤的DNA病毒，同時利用Dam對其DNA分子鏈進行甲基化修飾。在受這些病毒感染的細菌中，只有缺乏甲基化的DNA分子鏈可得到修正[8]。表明對配對錯誤的修正是DNA復(fù)制時的一種自然過程，而未甲基化充當(dāng)了其過程中的參考模板。莫德里奇的研究還發(fā)現(xiàn)MutS和MutL基因的同源缺失可以成為遺傳性非息肉結(jié)直腸癌發(fā)病的主要原因之一，其基因失活可直接導(dǎo)致腫瘤逃逸細胞凋亡并產(chǎn)生化療耐藥。經(jīng)此后多年的系統(tǒng)性研究，隨著多種參與分子的克隆，“錯配修復(fù)機制（mismatch repair，MMS）”得到確認。20世紀80年代末，這一復(fù)雜的分子修復(fù)機制最終在試管中得到細致的重現(xiàn)[9]。

桑賈爾（Sancar，1946～）出生于土耳其的薩烏爾。在伊斯坦布爾的醫(yī)學(xué)院畢業(yè)后，就讀于美國得克薩斯大學(xué)達拉斯分校（University of Texas，Dallas），并且于1977年獲得Ph.D學(xué)位?，F(xiàn)任美國北卡羅來納大學(xué)教堂山分校（University of North Carolina，ChapelHill）醫(yī)學(xué)院的生物化學(xué)與生物物理學(xué)系教授。1973年，桑賈爾開始嘗試破解一個神奇現(xiàn)象：藍色光照可使經(jīng)致命劑量紫外線照射的細菌復(fù)活[10]。在他1976年的博士畢業(yè)論文中，記載了DNA紫外線損傷修復(fù)酶——光修復(fù)酶（photolyase）基因的成功克隆和表達[11]。隨后在耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的實驗室工作中，在3種對紫外線敏感度不同的細菌中，UVRA、UVRB 和UVRC等不同的變異體被發(fā)現(xiàn)，進一步證明了光修復(fù)酶對紫外線所致DNA損傷的特異識別和修復(fù)功能，經(jīng)過在受損片段上下游的2次切割，其中涉及12～13個核苷酸的片段可被移除。1983年，桑賈爾在發(fā)表了相關(guān)研究成果之后[12]，于北卡羅來納大學(xué)受聘生物化學(xué)副教授，繼續(xù)完成了“核苷酸切除修復(fù)（nucleotideexcision repair，NER）”機制的最終闡釋[13]。

2 DNA損傷的修復(fù)機制

人類基因組中，DNA作為遺傳信息的載體含約30億個堿基對。細胞可通過半保留復(fù)制方式將DNA的堿基序列傳遞至子代。不論是在自然界環(huán)境中還是生物體內(nèi)，除了DNA復(fù)制過程中的堿基錯配及DNA分子本身的熱不穩(wěn)定性等因素以外，誘發(fā)DNA損傷的因素很多，如輻射、化學(xué)毒物、藥物及病毒感染，以及機體代謝過程中所產(chǎn)生的自由基等有毒活性物質(zhì)等等。這些因素的作用后果也因損傷的程度不同而表現(xiàn)出異常，包括單鏈斷裂或單堿基破壞、大范圍破壞或DNA交聯(lián)、鳥嘌呤的O6甲基化、堿基錯配的發(fā)生或DNA雙鏈分子的斷裂等等（圖2）[14]。DNA損傷不僅可以造成DNA復(fù)制或者轉(zhuǎn)錄的障礙，也可能直接導(dǎo)致基因突變的發(fā)生。針對不同的DNA 損傷類型，細胞內(nèi)存在多種DNA修復(fù)系統(tǒng)。已發(fā)現(xiàn)的類別因其機制不同主要分為：堿基切除修復(fù)（BER）系統(tǒng)、錯配修復(fù)系統(tǒng)（MMR）、核苷酸切除修復(fù)（NER）系統(tǒng)、直接修復(fù)（direct repair，DR）、重組修復(fù)所包括的同源重組（homologous recombination，HR）和非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）等等。

1）堿基切除修復(fù)機制：BER被認為是真核細胞較為普遍的修復(fù)方式。20世紀70年代，人們多數(shù)認為由于DNA聚合酶同時具有校驗功能，因而復(fù)制過程是非常忠實且合成產(chǎn)物也是極其穩(wěn)定的。即使如此，包括林道爾等在內(nèi)的研究人員提出復(fù)制這一復(fù)雜過程中難免存在堿基的錯配問題，并且進而產(chǎn)生以一定速率累積增加的突變。隨著糖苷酶的發(fā)現(xiàn)，BER修復(fù)系統(tǒng)及其工作機制終獲得解析。在該系統(tǒng)中，糖苷酶能夠識別受損的堿基，水解DNA分子的糖苷鍵，從而在核酸鏈的骨架上產(chǎn)生一個無嘌呤或嘧啶的位點（apurinic/apyrimidinic site，AP位點）[15]。在AP位點上，AP核酸內(nèi)切酶水解5’-糖苷-磷酸鍵；AP核酸外切酶作用于其3’端下游；移去包括AP位點核苷酸在內(nèi)的小片段DNA；再由DNA聚合酶Ⅰ根據(jù)未損傷的互補模板合成新的修復(fù)片段；最終由DNA連接酶連接新修復(fù)的DNA鏈（圖2）。

2）錯配修復(fù)機制：MMS從某種意義上可以看成是BER的一種特殊形式。復(fù)制錯誤可導(dǎo)致新合成的鏈與模板間產(chǎn)生堿基錯誤配對，莫德里奇很早就意識到這一問題。在研究中發(fā)現(xiàn)并成功克隆了大腸桿菌（E. coli）錯配修復(fù)系統(tǒng)中的3個關(guān)鍵分子（MutS、MutH和MutL）。該修復(fù)系統(tǒng)專用于校正新合成的DNA，因新DNA鏈GATC序列中的A未甲基化。MutS和MutL可識別錯配的堿基，MutH負責(zé)在GATC的G位點切開非甲基化的子鏈。真核生物中錯配修復(fù)機制與大腸桿菌的修復(fù)模式非常相似。人類基因中存在與MutS高度同源的MSH2、MSH6和MSH3等。錯配修復(fù)系統(tǒng)的分子機制也常常被用來部分介導(dǎo)DNA損傷后的細胞應(yīng)激反應(yīng)。

3）核苷酸切除修復(fù)機制：NER識別DNA雙螺旋的構(gòu)象改變而非特定堿基的損傷，這種桑賈爾在光修復(fù)系統(tǒng)研究中的發(fā)現(xiàn)與BER的情況頗為不同，可分為全基因組型和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)型2種。大腸桿菌的NER主要由4種蛋白UvrA、UvrB、UvrC和UvrD組成。UvrA識別DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)變形；UvrB負責(zé)解鏈，募集核酸內(nèi)切酶UvrC，在錯配位點上下游數(shù)個堿基的位置上將DNA鏈切開；UvrC在損傷部位的兩側(cè)切斷DNA鏈；UvrD去除兩個切點間的DNA片段；DNA聚合酶合成新鏈填補空隙；連接酶將新片段與原DNA連接。真核生物的NER機制與原核相仿，然而過程更為復(fù)雜；人NER修復(fù)系統(tǒng)的XPA、XPC、XPD、XPF和XPG等基因與常染色體隱性遺傳病著色性干皮?。▁eroderma pigmentosum，XP）存在關(guān)聯(lián)。

4）其他重要的DNA 修復(fù)機制：重組修復(fù)（recombinational repair）是可以發(fā)生在DNA的雙鏈或雙鏈中的一條鏈發(fā)生斷裂時。在DNA復(fù)制過程中，由于損傷部位失去模板作用，造成互補的DNA鏈不能合成，形成缺口。這時從親代DNA的對應(yīng)部位可提供幫助將缺口進行填充，以產(chǎn)生完整的子代DNA；直接修復(fù)主要用于去除O6甲基化的鳥嘌呤并完成后續(xù)的堿基修復(fù)置換與DNA連接，其中O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶［O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT］是發(fā)揮決定性作用的修復(fù)酶，其功能異常與以神經(jīng)多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastomamultiforma，GBM）為代表的許多腫瘤的進展及預(yù)后關(guān)系密切；跨損傷DNA合成（trans-lesion DNA synthesis，TLS）是另一較新發(fā)現(xiàn)的DNA 修復(fù)機制，以應(yīng)對無錯損傷旁路（error-free lesion bypass）及易錯損傷旁路（error-prone lesion bypass）所導(dǎo)致DNA 損傷及其誘導(dǎo)的突變。以上述多種類型為例的各種DNA修復(fù)機制協(xié)同工作，在維護細胞基因組的穩(wěn)定性以及DNA序列高保真性傳遞核傳代中發(fā)揮著極其重要和難以替代的作用。

3 高通量測序和組學(xué)分析背景下的DNA修復(fù)機制研究及其與疾病和醫(yī)藥的聯(lián)系

修復(fù)系統(tǒng)的存在保證了物種遺傳的穩(wěn)定性，對降低修復(fù)缺陷相關(guān)疾病的發(fā)病率有十分重要的意義。雖然細胞總是會千方百計地維持基因組的穩(wěn)定性或控制其只完成既定分化程序所允許的改變，然而在環(huán)境和刺激因素的作用下，錯誤總是存在并且隨時發(fā)生。當(dāng)DNA堿基的錯誤未能得到糾正并且被累積，突變由此產(chǎn)生。廣泛和大量的基因突變是腫瘤發(fā)生的根源。3位科學(xué)家很早就意識到基因組的不穩(wěn)定性與癌癥之間的密切關(guān)系，無論是在癌癥的發(fā)生還是在抗癌藥物的治療過程中，幾種修復(fù)系統(tǒng)的作用是相互聯(lián)系和復(fù)雜交叉在一起的，如圖3所示。這充分提示了，與過去研究DNA損傷修復(fù)的經(jīng)典策略不同，利用高通量測序和組學(xué)研究技術(shù)在全基因組水平的綜合分析將為這一領(lǐng)域的進展帶來前所未有的突破機遇，同時將大大加深對包括腫瘤在內(nèi)的人類復(fù)雜疾病的病理認識，特別是在解析基因由環(huán)境因素所累積的變異方面。

桑賈爾的研究團隊發(fā)現(xiàn)致癌藥物環(huán)丁烷嘧啶二聚體（cyclobutane pyrimidine dimmers，CPDs）和化療藥物雙氫順鉑（cisplatin 1，2-d，GpG）共同作用下，NER修復(fù)機制使得DNA分子經(jīng)過兩次切割可清除24～32個損傷的堿基，他們將這一過程中的6個關(guān)鍵修復(fù)因子（XRPA，XPA，XPC，TFIIH，XPG和XPF-ERCC1）一一純化，用于分離DNA片段進行深度測序，以便在離體實驗中進一步分析和闡明人類切除修復(fù)的細節(jié)機制。特別需要指出的是，他們從輻射后的正常人類成纖維細胞及突變細胞系DNA分離得到與轉(zhuǎn)錄因子TFIIH緊密結(jié)合的含有30個堿基的復(fù)合體，進行了深入的高通量測序和基因組學(xué)分析（圖3），成功地繪制出NER修復(fù)及轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)的人類全基因組圖譜[16]，并以此為例，建立了一套穩(wěn)定的方法和流程，將這項技術(shù)命名為XR-seq（Excision Repair-Sequencing）。另一個此類基于染色質(zhì)免疫沉淀和高通量測序的鑒定DNA易損位點的方案稱為SPI-Seq（single-strand DNA (ssDNA)-associated protein immunoprecipitationfollowed by sequencing）[17]。該方法以裂殖酵母為模式生物，可檢測結(jié)合單鏈DNA的Rad52等修復(fù)蛋白的基因組分布，用于揭示其結(jié)合單鏈DNA的序列特異性。將HO內(nèi)切酶識別序列引入基因組作為標簽，驗證出SPI-Seq能檢測到Rad52在HO誘發(fā)的DNA雙鏈斷裂處單鏈DNA上的特異分布，研究中還檢測到了基因組中以較低頻率發(fā)生的內(nèi)源HO識別序列上的雙鏈斷裂位點。同時在幾個基因組低穩(wěn)定性的裂殖酵母突變體中利用該項技術(shù)還發(fā)現(xiàn)了在野生型菌體中所不易觀察到的DNA易損位點。美國麻省總醫(yī)院的研究團隊在去年也開發(fā)了在基因組范圍內(nèi)檢測CRISPR脫靶效應(yīng)的新方法GUIDE-seq（genome-wide unbiased identification of DSBsevaluated by sequencing），除了可用于基因編輯工具的作用和效果評價，在DNA損傷修復(fù)和癌癥研究領(lǐng)域也同樣具有廣闊的應(yīng)用前景。與此同時，充分發(fā)展和利用高敏感性的熒光PCR技術(shù)也可以為定量分析、發(fā)現(xiàn)和驗證特定基因變異對DNA修復(fù)機制的影響和細胞基因組穩(wěn)定性后果等提供重要的支持[18]。

在諾貝爾評審委員會對2015年度化學(xué)獎的評論中特別提到了3位科學(xué)家的工作將為癌癥的治療突破帶來鼓舞和希望。而事實上，一些研究人員已經(jīng)在努力嘗試根據(jù)各種DNA修復(fù)機制中的不同靶點分子設(shè)計開發(fā)新型的抗癌藥物，在更有效阻止癌細胞生長的同時，避免和減少傳統(tǒng)化療過程中出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象。例如，即將完成多種臨床試驗的PARP-1［Poly(ADP-ribose) polymerase 1］抑制劑AZD2281（olaparib）等[19]。除腫瘤外，各種由致病性病毒引起的各種感染性疾病，以及環(huán)境輻射與化學(xué)品暴露所致的健康和遺傳問題，都可能從該化學(xué)獎的直接成果和思路提示中獲益。然而我們必須也認識到：1）DNA修復(fù)機制的研究進展歷經(jīng)了全球許多勤奮和有天賦的科學(xué)家長達數(shù)十年的艱苦努力，值得表彰的學(xué)者應(yīng)該還有很多。2）人類試圖戰(zhàn)勝腫瘤這一惡性疾病的努力一直在繼續(xù)，然而至今尚未能獲得令人滿意的戰(zhàn)果，本年度諾貝爾化學(xué)獎固然使得癌癥的研究者和臨床工作者再次振奮希望，但我們理應(yīng)意識到疾病本身的復(fù)雜性和后續(xù)工作的艱巨。

摘編自《首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》2015年36卷第5期：823-828頁，圖、參考文獻已省略。