青蒿素和樺木酸阻斷脂多糖誘導(dǎo)小鼠血管新生及組織增殖

高倩，吳佩，何疆，曾慶平

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510405；2.廣東省第二中醫(yī)院，廣州 510095）

青蒿素和樺木酸阻斷脂多糖誘導(dǎo)小鼠血管新生及組織增殖

高倩1，吳佩2，何疆1，曾慶平1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510405；2.廣東省第二中醫(yī)院，廣州 510095）

炎癥與腫瘤之間關(guān)系密切，促炎細(xì)胞因子是腫瘤微環(huán)境（niche）的重要組成部分[1]。以細(xì)菌性炎癥為例，由幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）引起的胃黏膜上皮細(xì)胞感染可導(dǎo)致慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤和胃癌[2]。為此，國際癌癥研究理事會(huì)（IARC）于1994年將幽門螺桿菌確定為Ⅰ類致癌劑[3]。然而，迄今為止對(duì)于幽門螺桿菌如何通過慢性炎癥誘發(fā)胃癌的分子病理機(jī)制尚不清楚。

幽門螺桿菌屬于革蘭陰性細(xì)菌，其外膜含有脂多糖（LPS），可結(jié)合細(xì)胞表面Toll樣受體4（TLR4）[4]。TLR4不僅分布在胃上皮細(xì)胞表面，也存在于胃癌細(xì)胞表面。有研究指出，幽門螺桿菌與大腸桿菌的LPS可循LPS-TLR4途徑促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長[5]。因此，有人認(rèn)為幽門螺桿菌的LPS可能是誘發(fā)慢性胃炎乃至胃癌的重要因素[6]。

膠原Ⅱ-完全弗氏佐劑（CⅡ-CFA）誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)滑膜炎的組織病理學(xué)圖譜顯示，滑膜組織呈現(xiàn)類似腫瘤的血管新生與組織增殖特征，并伴有淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象[7]。巧合的是，CFA就含有結(jié)核分枝桿菌LPS成分。既然滑膜炎伴隨腫瘤樣增殖，那么抗腫瘤藥物就能阻斷此過程。以往研究證明，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑植醇[8]以及免疫抑制劑西羅莫司[9]和抗瘧藥青蒿素[10]既具有抗腫瘤作用，也表現(xiàn)滑膜炎治療效果，提示滑膜炎的血管新生與組織增殖可以模擬腫瘤樣病變的早期過程。在前期工作中，我們根據(jù)滑膜炎發(fā)病過程中促炎細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)、一氧化氮（NO）爆發(fā)、缺氧、血管新生和組織增殖等觀察結(jié)果，提出了“炎癥激發(fā)NO驅(qū)動(dòng)缺氧致瘤”假說，試圖揭示炎癥誘發(fā)腫瘤的中間環(huán)節(jié)[11]。隨后，有人提供了支持該假說的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，即缺氧可促進(jìn)快速生長的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞，因?yàn)樗芗せ頓NA損傷緊急修復(fù)機(jī)制，促進(jìn)基因突變、抑制細(xì)胞凋亡和啟動(dòng)血管新生[12]。

本實(shí)驗(yàn)擬利用LPS及含LPS的CFA建立小鼠皮下組織及滑膜腫瘤樣增殖模型，并對(duì)致瘤相關(guān)生理病理變化進(jìn)行形態(tài)學(xué)（表型描述及炎癥分級(jí)）與組織化學(xué)（血管新生與組織增殖及淋巴細(xì)胞浸潤）鑒定，依時(shí)測(cè)定NO、血氧飽和度（SpO2）和3-硝基酪氨酸（3NT）的血清濃度，對(duì)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的表達(dá)水平進(jìn)行免疫組化分析，以探討LPS促進(jìn)腫瘤樣增殖的分子機(jī)制。同時(shí)，基于上述測(cè)定指標(biāo)，初步評(píng)價(jià)青蒿素和樺木酸單用及合用抑制腫瘤樣增殖的早期防控效果。

1 材料

1.1 試劑與藥品

LPS、CFA、樺木酸、NG-甲基-L-精氨酸（LNMMA）（Sigma公司）。硝普鈉（SNP，北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限公司）。青蒿琥酯（桂林南藥股份有限公司）。NO 測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。小鼠3NT ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）?？笻IF-1α、VEGF、iNOS一抗及酶標(biāo)二抗（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科）。

1.2 儀器

MIAS顯微圖像分析系統(tǒng)（北京炳洋科技有限公司）。MK3 酶標(biāo)儀[美國熱電（上海）科技儀器有限公司]。MD300C 指甲式脈搏血氧儀（北京超思電子技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SPF級(jí)昆明小鼠，雄性，4周齡，18～22 g（廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK粵2008-0020）。本實(shí)驗(yàn)涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：SPF-2011007）。

2 方法

2.1 滑膜腫瘤樣增殖模型

CFA造模組：用500 μg·mL-1CFA注射后腿踝關(guān)節(jié)腔，每只200 μL，1周后再注射1次；LPS造模組：用100 μg·mL-1LPS按每只每天200 μL 注射后腿踝關(guān)節(jié)腔，注射1周；SNP模擬造模組：用100 μg·mL-1SNP 按每只每天200 μL注射后腿踝關(guān)節(jié)腔，注射1周；L-NMMA干擾造模組：在注射相應(yīng)造模試劑的同時(shí)，用500 μg·mL-1L-NMMA溶液按每只每天200 μL注射后腿踝關(guān)節(jié)腔，共兩周。每組5只小鼠。

2.2 皮下組織腫瘤樣增殖模型

小鼠背部剃毛，用手術(shù)線綁扎皮膚使其隆起，分為CⅡ-CFA/CFA造模組：每只用1 mg·mL-1CⅡ-CFA 或2 mg·mL-1CFA注射200 μL，1周后再注射1次；SNP模擬造模組：每只用10、50或100 mg·mL-1SNP 每天注射200 μL，連續(xù)注射兩周；CⅡ-CFA/CFA+SNP復(fù)合造模組；用100 μg·mL-1SNP每只每天注射200 μL，連續(xù)注射兩周，同時(shí)每只用1 mg·mL-1CⅡ-CFA或2 mg·mL-1CFA注射200 μL，1周后再注射1次。每組5只小鼠。

2.3 腿部炎癥分級(jí)

采用0～4分制：0=正常；1=一趾或多趾紅腫；2=自踝關(guān)節(jié)至中爪（跗骨）發(fā)紅并中度腫脹；3=自踝關(guān)節(jié)至中跗骨關(guān)節(jié)發(fā)紅并重度腫脹；4=踝、爪、趾全部紅腫，關(guān)節(jié)變形和僵硬。

2.4 治療方案及給藥方式

LPS造模組及SNP造模組的治療是在造模第4天用青蒿琥酯關(guān)節(jié)腔注射或皮下注射、樺木酸灌胃或關(guān)節(jié)腔注射或皮下注射、青蒿琥酯與樺木酸合用，用藥兩周；CFA造模組的治療是從造模第2天開始治療，用藥兩周。灌胃給藥每只每天500 μL，注射給藥每只每天200 μL。

2.5 NO、SpO2和3NT測(cè)定

血清NO測(cè)定按測(cè)試盒說明書操作，SpO2采用血氧儀測(cè)量，將小鼠后腿插入橡膠孔道，松開夾子，按面板上開關(guān)按鈕，從顯示屏直接讀取數(shù)據(jù)。3NT測(cè)定樣本分別取自血清和注射部位（后腿）肌肉，測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法，按說明書操作，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出實(shí)際含量或濃度。

2.6 病理學(xué)分析

將福爾馬林固定和石蠟包埋的關(guān)節(jié)組織（含滑膜及軟骨）切成3 μm薄片，用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蒸餾水洗滌。經(jīng)蘇木精染色后，用體積分?jǐn)?shù)分別為1%酸性乙醇分化、1%氨水返藍(lán)、95%乙醇沖洗。用伊紅染色后，經(jīng)梯度乙醇脫水和二甲苯清洗，用含二甲苯的封片液封片。在顯微鏡下觀察并拍攝組化染色切片的滑膜增殖、滑膜下組織纖維化、淋巴細(xì)胞浸潤等病理變化。

2.7 免疫組化分析

將福爾馬林固定的關(guān)節(jié)組織（含滑膜及軟骨）進(jìn)行免疫組化分析。將石蠟切片與3% H2O2在室溫下共育，抑制內(nèi)源性過氧化物酶。用煮沸的檸檬酸修片、磷酸緩沖液（PBS）洗滌、2%牛血清白蛋白（BSA）封片后，與1∶100稀釋的一抗在37℃下保溫1 h。將玻片用PBS洗滌，與生物素化二抗在37℃下保溫20 min。用PBS洗滌，與二氨基聯(lián)苯胺（DAB）保溫1～5 min。經(jīng)沖洗、蘇木精復(fù)染、脫水、清洗和封片后，用 MIAS顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測(cè)，由下式計(jì)算結(jié)果：免疫組化強(qiáng)度=陽性目標(biāo)總面積/統(tǒng)計(jì)場總面積（面密度）×陽性目標(biāo)的陽性單位。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 小鼠皮下組織增殖誘導(dǎo)及模擬的形態(tài)學(xué)觀察

為了觀察滑膜炎誘導(dǎo)劑CⅡ-CFA/CFA及其模擬劑SNP促進(jìn)皮下組織增殖的效果，利用不同濃度及不同組合的CⅡ-CFA/CFA或SNP，在小鼠背部綁扎后的隆起部位進(jìn)行肌肉注射，其皮下組織的外觀形態(tài)見圖1。

從圖1可見，各造模組均出現(xiàn)不同程度的實(shí)體增殖，其中CFA造模組的瘤狀增殖明顯，未出現(xiàn)組織壞死現(xiàn)象（圖1A、B、C）；CⅡ-CFA/CFA造模組可觀察到局部小面積壞死結(jié)痂（圖1E、G）；SNP + CⅡ-CFA/CFA造模組則有大面積壞死或全部壞死，瘤狀塊偏小（圖1F、H）。對(duì)照小鼠的上皮組織為一平整薄片，無增殖現(xiàn)象（圖1D）。

3.2 小鼠皮下組織增殖誘導(dǎo)及模擬的病理學(xué)分析

為了從細(xì)胞水平上進(jìn)一步確認(rèn)上述皮下組織的瘤狀增殖形態(tài)，對(duì)來自不同造模組增殖組織的切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和病理學(xué)分析，結(jié)果見圖2。

從圖2可見，對(duì)照組皮膚的表皮、真皮及皮下組織結(jié)構(gòu)正常，肌肉深部組織為疏松的結(jié)締組織，未見炎細(xì)胞浸潤及毛細(xì)血管擴(kuò)張充血（圖2D）。在SNP模型中，低濃度組的肌肉深部見纖維組織和毛細(xì)血管輕度增殖（圖2A）；中濃度組見纖維組織輕度增殖，但出現(xiàn)大量毛細(xì)血管增殖并擴(kuò)張充血（圖2B）；高濃度組的肌肉深層纖維組織及組織細(xì)胞、毛細(xì)血管明顯增殖，大量中性粒細(xì)胞浸潤，并有一處大的膿腫壞死灶形成（圖2C）。在CⅡ-CFA和CFA模型中，均出現(xiàn)纖維組織和毛細(xì)血管增殖及中性粒細(xì)胞浸潤，但CFA組的血管增殖明顯并擴(kuò)張充血（圖2E、F），而CⅡ-CFA組則出現(xiàn)大面積壞死（圖2G、H）。

3.3 內(nèi)外源NO對(duì)組織供氧狀況的影響

由形態(tài)學(xué)和病理學(xué)結(jié)果可知，CⅡ-CFA/CFA 可誘導(dǎo)血管新生和組織增殖，而SNP可模擬CⅡ-CFA/CFA的上述作用。前期研究已證明，CⅡ-CFA/CFA可誘導(dǎo)NO合成（內(nèi)源NO），而SNP可釋放SNP（外源NO），由此產(chǎn)生的過量NO能引起關(guān)節(jié)滑膜缺氧[8,12]。為了闡明內(nèi)外源NO濃度與皮下組織供氧狀況的關(guān)系，測(cè)定了各組不同處理小鼠的血清NO濃度和增殖部位的SpO2，結(jié)果見表1。

表1數(shù)據(jù)顯示，SNP、CⅡ-CFA/CFA 均使NO升高，由高到低依次為CFA>CⅡ-CFA>SNP + CFA>100 μg·mL-1SNP>10 μg·mL-1SNP>SNP+CⅡ-CFA>50 μg·mL-1SNP。高濃度SNP、CⅡ-CFA/CFA均使SpO2降低，由低到高排列為CFA>SNP+CFA>SNP（100 μg·mL-1）>SNP+CⅡ-CFA>CⅡ-CFA>SNP（50 μg·mL-1）>SNP（10 μg·mL-1）。對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，得出相關(guān)系數(shù)=－0.7440，0.02

由于合用或單用的注射量都是200 μL，故合用時(shí)CII-CFA或CFA的用量減半，而CII-CFA或CFA誘導(dǎo)的NO多于SNP誘導(dǎo)的NO，所以出現(xiàn)合用組NO含量低于單獨(dú)用藥組的現(xiàn)象。

3.4 小鼠滑膜增殖誘導(dǎo)及阻遏的形態(tài)學(xué)及病理學(xué)

比較為了直接觀察LPS對(duì)腫瘤樣增殖的誘導(dǎo)作用，用100 μg·mL-1LPS注射小鼠后腿踝關(guān)節(jié)，連續(xù)注射3 d后分析其滑膜組織的外觀形態(tài)及組織病變，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，對(duì)照組的關(guān)節(jié)形態(tài)及滑膜顯微結(jié)構(gòu)均正常（圖3A、a）。經(jīng)LPS注射后，小鼠關(guān)節(jié)也像注射CⅡ-CFA/CFA那樣出現(xiàn)紅腫，但炎癥程度僅為2級(jí)（圖3B）。病理分析結(jié)果顯示，LPS注射小鼠的滑膜輕度增殖，并出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤（圖3b）。LPS注射小鼠的血清NO 升高，滑膜SpO2則降低，但同時(shí)注射L-NMMA后，NO明顯下降，SpO2則相應(yīng)回升，結(jié)果見表2。經(jīng)LPS注射后，NO與SpO2成負(fù)相關(guān)，結(jié)果與CⅡ-CFA/CFA造模一致。對(duì)血管新生基因表達(dá)水平的分析表明，LPS造模組與對(duì)照組比較，HIF-1α、VEGF表達(dá)上調(diào)近10倍，iNOS表達(dá)上調(diào)約7倍。LNMMA處理使HIF-1α、VEGF、iNOS表達(dá)全部下調(diào)（表3）。

3.5 NO對(duì)蛋白質(zhì)硝化的影響

蛋白質(zhì)硝化的主要產(chǎn)物是3NT，而催化這一反應(yīng)的是NO與超氧陰離子作用產(chǎn)生的過氧化亞硝酸陰離子（ONOO－）。為了探討CⅡ-CFA/CFA激發(fā)的過量NO對(duì)蛋白質(zhì)硝化的影響以及SNP的模擬及L-NMMA的阻遏，測(cè)定了不同處理小鼠血清3NT濃度，結(jié)果見圖4。

從以上結(jié)果可知，CⅡ-CFA/CFA處理組的3NT濃度比對(duì)照（圖4A）均有不同程度提高（圖4B、C），提示免疫激活誘生的NO和O2

－可通過ONOO－促進(jìn)蛋白質(zhì)硝化。若同時(shí)注射CⅡ-CFA/CFA與LNMMA，CⅡ-CFA+L-NMMA處理組的3NT濃度與圖4B中CⅡ-CFA處理比較未見降低（圖4D），CFA + L-NMMA處理組的3NT濃度則比圖4C中CFA處理明顯降低（圖4E）。若SNP單用或與CⅡ-CFA/CFA聯(lián)用，其3NT濃度均較低，與對(duì)照相比差異不顯著（圖4F、G、H），表明SNP不能導(dǎo)致蛋白質(zhì)硝化，原因可能是它只釋放NO但并不誘生O2－，故不能產(chǎn)生ONOO－。

以上測(cè)定結(jié)果均來自血液樣本，為了在肌肉組織中驗(yàn)證NO與蛋白質(zhì)硝基化的動(dòng)態(tài)關(guān)系，對(duì)每日注射LPS的小鼠血清中NO與后腿注射部位肌肉中3NT進(jìn)行了較長時(shí)間的跟蹤測(cè)定。結(jié)果表明，NO與3NT同步變化，即蛋白質(zhì)硝基化程度隨NO含量的升降而波動(dòng)。在LPS注射后3 d測(cè)得的NO與3NT最高，隨后逐漸降低，至14 d時(shí)雙雙降至對(duì)照水平（圖5）。

以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，蛋白質(zhì)硝基化程度與NO成正比，而NO取決于iNOS被TNF-α、IL-1等促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)表達(dá)的程度[12]。因此，免疫激活介導(dǎo)的炎癥可導(dǎo)致蛋白質(zhì)硝基化，但尚不清楚多次注射LPS后NO與3NT下降的原因，推測(cè)可能與多次注射誘導(dǎo)抗LPS抗體的中和作用有關(guān)。

3.6 青蒿琥酯和樺木酸對(duì)NO驅(qū)動(dòng)缺氧的影響

采用LPS或CFA造模，其中LPS連續(xù)注射3 d后開始給藥，CFA注射后第2天開始給藥，均采用關(guān)節(jié)腔直接注射給藥。用藥兩周后分別測(cè)定關(guān)節(jié)部位SpO2及血清NO，結(jié)果見表4和圖6。

從表4和圖6可見，SpO2與NO反相關(guān)，LPS與CFA造模組兩指標(biāo)與對(duì)照組比較差異極顯著，CFA模型的缺氧程度更甚。從造模組的治療效果來看，青蒿琥酯與樺木酸單用及合用，SpO2都明顯升高，NO明顯降低，與造模組比較差異顯著。LPS模型治療組顯示兩藥合用緩解缺氧的效果更好，而CFA模型治療組單用與合用效果無差異。

3.7 青蒿琥酯和樺木酸對(duì)滑膜腫瘤樣增殖的影響

為了確定青蒿琥酯、樺木酸抑制腫瘤樣增殖的效果，對(duì)LPS模型治療組及CFA模型治療組小鼠分別進(jìn)行了病理學(xué)分析，結(jié)果見圖 7。結(jié)果表明，模型小鼠滑膜組織大量增殖，出現(xiàn)血管新生，炎癥細(xì)胞浸潤，嗜酸粒細(xì)胞（EOS）多見。青蒿琥酯與樺木酸單用或者合用治療后，增殖程度減輕，炎癥細(xì)胞少見，合用效果優(yōu)于單用。

為了深入研究青蒿琥酯與樺木酸抑制滑膜組織腫瘤樣增殖的機(jī)制，對(duì)各組小鼠滑膜細(xì)胞中HIF-1α、VEGF和iNOS等血管形成相關(guān)因子的表達(dá)水平進(jìn)行了免疫組化分析，結(jié)果見表5。

表5所示結(jié)果表明，LPS與CFA造模組HIF-1α、VEGF、iNOS大幅度上調(diào)，與對(duì)照比較差異極顯著。經(jīng)青蒿琥酯和樺木酸治療后，HIF-1α、VEGF、iNOS出現(xiàn)不同程度下調(diào)。LPS模型中，HIF-1α下調(diào)程度由高到低為：樺木酸與青蒿琥酯合用>樺木酸單用>青蒿琥酯單用，VEGF與iNOS下調(diào)程度依次為：樺木酸單用>合用>青蒿琥酯單用；CFA模型中，HIF-1α與iNOS下調(diào)程度依次為：青蒿琥酯單用>合用>樺木酸單用，VEGF下調(diào)程度依次為：合用>青蒿琥酯單用>樺木酸單用。

4 討論

LPS是革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分，其化學(xué)本質(zhì)是磷脂多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，其類脂質(zhì) A對(duì)宿主有毒性，稱為內(nèi)毒素（endotoxin）。內(nèi)毒素可激活人體內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，如TNFα、IL-6、IL-1等促炎細(xì)胞因子[13]，同時(shí)還能誘導(dǎo)iNOS高表達(dá)產(chǎn)生大量NO，引起一系列病理反應(yīng)[14]。以往研究還表明，內(nèi)毒素休克病人體內(nèi)的NO水平顯著升高[15]。LPS或LPS/干擾素-γ（IFN-γ）是NO合成的強(qiáng)力誘導(dǎo)劑[16]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的過量NO源于iNOS的過表達(dá)。因此，LPS介導(dǎo)炎癥的后果之一就是NO爆發(fā)。

NO有“雙刃劍”之稱，其作用取決于它的來源及其濃度。一方面，由神經(jīng)元NOS（nNOS）及血管內(nèi)皮細(xì)胞NOS（eNOS）合成的適量NO，通過激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC），導(dǎo)致環(huán)尿苷酸（cGMP）水平提高，促進(jìn)cGMP依賴性蛋白激酶活化和離子通道開放，發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管調(diào)節(jié)等重要生理功能[17]。另一方面，受內(nèi)毒素、TNFα、IL-1、IL-2等刺激，由iNOS合成的過量NO 既擔(dān)負(fù)著殺滅病原體的重任，也是引起某些疾病如敗血癥、感染性休克、多臟器功能衰竭的重要介質(zhì)[18]。

NO爆發(fā)可造成生物組織、細(xì)胞和分子的自我損傷，其機(jī)制包括：① NO可跨膜進(jìn)入線粒體內(nèi)結(jié)合細(xì)胞色素C氧化酶（復(fù)合物Ⅳ），抑制呼吸鏈功能，導(dǎo)致代謝性缺氧[19]。氧分壓與滑膜炎之間存在直接相關(guān)性，缺氧是滑膜炎的驅(qū)動(dòng)因素之一[20]。② NO能與O2－結(jié)合形成ONOO－，而后者又可與H+形成不穩(wěn)定的過氧化亞硝酸（ONOOH），并很快分解成活性氮產(chǎn)物NO2－和活性氧產(chǎn)物OH－等。這些強(qiáng)氧化劑的過量產(chǎn)生可導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸的化學(xué)修飾，如酪氨酸3-硝基化、半胱氨酸S-硝基化等。大鼠胎糞誘導(dǎo)肺損傷時(shí)，肺組織的iNOS表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致3NT含量升高[21]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，NO與3NT之間呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，NO水平越高，3NT含量也越高。

在缺氧條件下，HIF-1α與VEGF表達(dá)均被上調(diào)，血管形成過程被啟動(dòng)[22]，可促進(jìn)血管新生、細(xì)胞黏附和侵襲[23]。血管新生還會(huì)影響體內(nèi)的代謝活動(dòng)，尤其是有氧分解與無氧分解的轉(zhuǎn)換。例如，血管新生前后血清中的乳酸含量出現(xiàn)先升后降的變化[8,12]。至于組織增殖的發(fā)生機(jī)制，目前還不清楚。最新證據(jù)顯示，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）中 DNA甲基化模式的改變可能誘發(fā)腫瘤樣病變，即iPSC相關(guān)的腫瘤起源可能受表觀遺傳模式控制[24]。

青蒿琥酯具有抗腫瘤作用，也有一定的免疫抑制作用，并顯示抑制新生血管形成[25]。青蒿琥酯通過下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)，能有效抑制新生血管生長[26]。青蒿琥酯對(duì)慢性髓樣白血病小鼠腫瘤的影響包括降低VEGF表達(dá)水平和抑制腫瘤生長速率[27]。青蒿琥酯對(duì)LPS或LPS合并干擾素誘導(dǎo)的NO合成均有明顯的抑制作用，其抑制作用具有特定的量效關(guān)系[28]。青蒿琥酯通過結(jié)合NOS的血紅素輔基抑制NO合成，從而阻斷NO介導(dǎo)的血管新生作用[29]。本實(shí)驗(yàn)制備的腫瘤樣增殖模型是基于NO驅(qū)動(dòng)缺氧誘導(dǎo)的血管新生和組織增殖，因而青蒿琥酯是首選的針對(duì)性治療藥物。

樺木酸的抗腫瘤活性最初是在黑色素瘤細(xì)胞中確定的，后來的研究顯示樺木酸對(duì)兒童惡性腦瘤細(xì)胞及多種神經(jīng)瘤細(xì)胞均有抑制作用[30-31]。樺木酸在1.25～10 μg·mL-1內(nèi)，能顯著提高正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO生成水平，但劑量過大（20 μg·mL-1）則抑制NO生成[32]。樺木酸可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS 產(chǎn)生大量NO，這可能是其增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抑菌、抗病毒的作用機(jī)制之一[33]。在分子水平上，樺木酸可抑制缺氧響應(yīng)因子HIF-1α的轉(zhuǎn)錄，后者再通過抑制STAT3和HIF-1α與VEGF基因啟動(dòng)子的結(jié)合抑制血管生成[34-35]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，樺木酸可下調(diào)HIF-1α、VEGF、iNOS表達(dá)，通過減少NO的產(chǎn)生發(fā)揮抗缺氧誘導(dǎo)作用。

由此可見，青蒿琥酯與樺木酸的作用機(jī)制不完全相同，前者通過抑制NOS活性直接切斷NO來源，后者可抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制HIF-1α與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合來減少新生血管形成。本實(shí)驗(yàn)表明，青蒿琥酯和樺木酸可以不同程度地改善NO誘導(dǎo)爆發(fā)性缺氧導(dǎo)致的滑膜腫瘤樣增殖和炎癥細(xì)胞浸潤，聯(lián)用比單用的效果更佳，其聯(lián)合治療方案值得開展臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)。此外，NO供體化合物SNP 可以模擬腫瘤樣增殖，而NO合成抑制劑L-NMMA則阻斷腫瘤樣增殖。這從另一個(gè)側(cè)面證實(shí)過量NO驅(qū)動(dòng)的缺氧效應(yīng)可能是腫瘤發(fā)生的重要啟動(dòng)因素之一。

摘編自《中國藥學(xué)雜志》2015年第4期：330～338頁，圖、表、參考文獻(xiàn)已省略。