植物線蟲分子鑒定研究進展

卓 侃, 廖金鈴,2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學植物線蟲研究室,廣州 510642;2.廣東生態(tài)工程職業(yè)學院,廣州 510520)

植物線蟲分子鑒定研究進展

卓 侃1, 廖金鈴1,2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學植物線蟲研究室,廣州 510642;2.廣東生態(tài)工程職業(yè)學院,廣州 510520)

植物線蟲可危害農(nóng)作物和林木,對它們的準確鑒定是防治植物線蟲病害的基礎。由于植物線蟲很小,而且在形態(tài)上種間常有覆蓋,而種內(nèi)有較大的變異,僅依據(jù)形態(tài)特征很難鑒定。分子鑒定技術給植物線蟲的檢測和鑒定提供了快速、精確、可靠的方法。文章綜述了植物線蟲分子的DNA提取、分子鑒定靶標序列的選擇及分子鑒定方法等方面的研究進展及現(xiàn)狀,以促進對植物線蟲分子鑒定更深入的研究。

植物線蟲; 分子鑒定; DNA; PCR

線蟲動物門是動物界中最大的門之一,線蟲數(shù)量龐大,種類繁多,生活方式多樣。其中,有許多種類是寄生植物的,這些線蟲稱為植物線蟲。目前,正式報道了約4 100種植物線蟲[1],它們已成為危害農(nóng)林生產(chǎn)和食品安全的一個重要因素[2]。據(jù)估計,每年因植物線蟲的危害可導致800億美元的損失[3],因此植物線蟲的防治已成為生產(chǎn)上的一項重要工作?？咕€蟲植物品種的選擇和作物輪作的方法是防治植物線蟲的重要手段,這些方法的應用是建立在植物線蟲準確鑒定的基礎上。另外,由于不同線蟲對殺線蟲劑敏感性可能不同,或某些線蟲對某些藥劑會產(chǎn)生抗藥性,所以在使用化學防治前,最好也要了解清楚植物線蟲的種類。人們一般是依據(jù)形態(tài)對植物線蟲進行鑒定。然而,植物線蟲非常小,體長一般在0.3～2 mm[4],而且通常植物線蟲種間形態(tài)有覆蓋,而種內(nèi)卻有較大的變異,這給人們鑒定帶來很大的困難。近年來,隨著一些線蟲分類學家的退休,同時年輕的科研工作者對線蟲形態(tài)分類的興趣逐漸減弱,專業(yè)從事線蟲形態(tài)分類鑒定的科研工作者越來越少[5]。因此,迫切要求一些新的線蟲鑒定技術的發(fā)明和使用。

同工酶電泳技術是鑒定植物線蟲的方法之一。通常,種內(nèi)的酶譜帶一致,而種間則有不同,通過分析譜帶類型即可進行種的判定。該技術最早在20世紀70年代初應用于幾種常見根結(jié)線蟲(Meloidogyne sp p.)的鑒定[6]。雖然該技術在其他一些線蟲,如大豆孢囊線蟲(Heterodera glycines)、三形莖線蟲(Ditylenchus triformis)和燕麥真滑刃線蟲(Aphelenchus avenae)上也有過研究[6],但目前同工酶譜分析只有在根結(jié)線蟲中得到較好的應用。究其原因,主要是由于某些蛋白只能在線蟲特定的階段才會表達,因此同工酶的提取對蟲態(tài)有嚴格的要求,一般只能選用年輕的雌蟲。除了根結(jié)線蟲,其他植物線蟲的年輕雌蟲相對較難獲得。然而,線蟲的DNA通常不會隨著線蟲蟲態(tài)或環(huán)境的變化而出現(xiàn)變化,隨著分子生物學技術的發(fā)展,基于DNA的線蟲鑒定技術得到迅速發(fā)展。本文綜合國內(nèi)外大量文獻并結(jié)合本實驗室的研究結(jié)果對植物線蟲分子鑒定技術的進展和研究近況進行概括和綜述,以期為我國植物線蟲分子鑒定技術研究提供參考信息。

1 DNA的提取

分子鑒定的第一步是線蟲模板DNA的準備。植物線蟲DNA的提取方法目前已經(jīng)比較成熟。早期通常對大量的活體線蟲進行DNA提取,采用的方法一般是常規(guī)的酚氯仿抽提法[7]。然而,由于大多數(shù)植物線蟲難以進行大量純化培養(yǎng),且從自然界中分離到的線蟲經(jīng)常為混合種群,因此少量線蟲,特別是單條線蟲的DNA提取越來越受到人們的重視。通常通過蟲體的裂解、蛋白酶K處理及短暫的高溫處理等步驟即可獲得可進一步用于PCR的單條線蟲DNA[8- 12]。

上述線蟲的DNA提取首先要將線蟲從土壤或病組織中分離出來,需要花費一定的時間。為了加快線蟲的檢測速度,近年人們研究了直接從含線蟲的土壤或病組織中提取DNA,只要該模板中含有少量靶標線蟲的DNA,就可以通過進一步的PCR將靶標線蟲檢測出來。該方法最大的限制因素是從土壤或植物組織中抽提的DNA中會存在多種抑制因子,如腐殖酸、酚類化合物、蛋白和多糖等[1314],這些抑制因子可能會影響下一步的PCR。然而,目前隨著DNA提取方法和試劑的不斷改進,這些抑制因子的影響已基本可以被克服,越來越多的成功例子被報道。例如：Atkins等[15]利用土壤DNA提取試劑盒直接提取含假根結(jié)線蟲(Nacobbus)的土壤總DNA,并利用PCR方法成功地從該模板中檢測到假根結(jié)線蟲;Yan等[16]提取含落選短體線蟲(Pratylenchus neglectus)和桑尼短體線蟲(P.thornei)的土壤DNA,并用PVP柱純化該DNA,最后成功地檢測到這兩種短體線蟲;Min等[17]用實時熒光定量PCR方法從含南方根結(jié)線蟲(M.incognita)的沙壤土DNA中檢測到南方根結(jié)線蟲;Sayed Abdul Rahman等[14]提取了含根結(jié)線蟲的香蕉根DNA,并用PCR方法從中檢測到根結(jié)線蟲;Hu等[18]提取了單個根結(jié)的DNA,并利用多重PCR的方法從單個根結(jié)DNA中成功地鑒定了南方根結(jié)線蟲、象耳豆根結(jié)線蟲(M.enterolobii)和爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica);Peng等[19]提取了被相似穿孔線蟲(Radopholus similis)侵染的香蕉、紅掌和柑橘的根DNA,并利用環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術從這些DNA中成功檢測到相似穿孔線蟲。

植物線蟲的DNA除了可以從活體線蟲中提取,也可以從一些固定的標本中提取。一些研究表明可以從保存在福爾馬林或甘油中幾天甚至幾年的線蟲標本中提取DNA[20-23]。Rubtsova等[23]甚至報道從固定超過10年的長針線蟲(Longidorus sp.)中提取出DNA,并以此DNA為模板,準確地擴增了28S r RNA的D2區(qū)序列。從固定的線蟲標本中提取DNA,對人們分析一些稀有種類具有較大的幫助。

2 DNA靶標序列的選擇

理想的用于鑒定物種的DNA靶標序列通常是在種內(nèi)保守,而在種間變異大,并容易被擴增。在植物線蟲中,核糖體DNA(r DNA)是最常用來做鑒定的靶標序列,r DNA是線蟲中最早被鑒定的序列之一,且該區(qū)段是多拷貝序列,容易擴增。其中,核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)是使用最多的區(qū)段[24-26]。ITS可以很好地用于一些植物線蟲屬下種的區(qū)分和鑒定,比如傘滑刃線蟲屬(Bursaphelenchus)、孢囊線蟲屬(Heterodera)、莖線蟲屬(Ditylenchus)、半穿刺線蟲屬(Tylenchulus)和隱皮線蟲屬(Cryphodera)等[27-31]。然而,ITS序列也不是在所有植物線蟲屬中均可用來區(qū)分種。在根結(jié)線蟲屬中,幾個常見的種如南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲(M.arenaria),它們彼此之間的ITS序列非常保守[7,24,32],根本無法用ITS序列來區(qū)分。而在短體線蟲屬中,ITS序列在一些種內(nèi)變異很大[33-35],例如玉米短體線蟲(P.zeae)和落選短體線蟲種內(nèi)變異分別達到8%和6%,明顯高于短體線蟲咖啡物種復合體的種間差異,因此單用ITS序列來鑒定短體線蟲有時可能會出錯。除了ITS,r DNA中的18S r RNA基因和28S r RNA基因中的D2D3區(qū)也在植物線蟲的分類鑒定中有較廣范的使用。相對于ITS,18S r RNA和28S r RNA更為保守,因此它們在區(qū)分屬或?qū)偕戏诸愲A元時可能更為好用。當然,在某些墊刃類線蟲或長針類線蟲中,D2D3也可以用來區(qū)分種[36-37]。另外,r DNA中的間隔基因區(qū)(IGS)也在少數(shù)植物線蟲種的鑒定中被使用,如Petersen和Vrain[38]依靠IGS序列鑒定了3個在歐洲重要的根結(jié)線蟲種。

線粒體DNA(mt DNA)是許多動物分類鑒定的重要靶標,尤其是mtDNA的CO I基因。mtDNA作為植物線蟲鑒定的分子靶標的研究相對起步較晚,也較少。目前,COⅡ/rrn L之間的序列在一些根結(jié)線蟲種的鑒定方面起到重要的作用[11,3941]。此外, CO I基因也被用來分析傘滑刃線蟲屬松材組和劍線蟲屬(Xiphinema)美洲組線蟲的系統(tǒng)發(fā)育[4243]。

除了r DNA和mt DNA,其他一些看家基因甚至效應蛋白基因也被嘗試用來鑒定植物線蟲。例如：主要精子蛋白基因(major sperm protein,msp)被用來區(qū)分穿刺短體線蟲(P.penetrans)和斯克里布納短體線蟲(P.scribneri)[44];熱激蛋白90基因(Hsp 90)被用來區(qū)分和研究一些根結(jié)線蟲、孢囊線蟲和短體線蟲的系統(tǒng)關系[45];肌動蛋白基因(actin)被用來區(qū)分孢囊線蟲屬、球孢囊線蟲屬(Globodera)和根結(jié)線蟲屬[46];一個分支酸變位酶(chorismate mutase)基因被用來區(qū)分幾個球孢囊線蟲[47];β-1,4-內(nèi)切葡聚糖基因(β-1,4-endoglucanase gene)被用來鑒定桑尼短體線蟲[48]。這些基因在植物線蟲的鑒定中是否能發(fā)揮更重要的作用有待今后更多的研究驗證。

3 分子鑒定技術與方法

植物線蟲分子鑒定的技術方法不少,大多數(shù)是在PCR的基礎上發(fā)展起來的。比如基于多態(tài)性分析的一些分子標記方法：包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性(RAPD)和擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)。另外像PCR后測序比對、利用特異性引物擴增、qPCR等技術是近年來應用較多的技術。此外,還有一些具有發(fā)展?jié)摿Φ姆椒?如DNA微陣列雜交技術。下面介紹幾種在植物線蟲鑒定中目前應用較多、比較重要的方法。

3.1 PCR-RFLP

RFLP技術是利用DNA的特定序列能被限制性內(nèi)切酶識別并切割的特點,用限制性內(nèi)切酶去切割不同物種的DNA,由于不同物種的核苷酸序列不同,酶切后會產(chǎn)生不同大小與數(shù)量的片段,再通過電泳進行判斷。早期人們用限制性內(nèi)切酶直接酶切植物線蟲的總DNA,如Curran等[49]用Eco RⅠ對4種常見的根結(jié)線蟲總DNA進行酶切。雖然不同種的DNA酶切片段會不同,但由于總DNA太大,酶切出來的片段一般也大,而且多,導致這些片段在電泳膠上密集出現(xiàn)而連成一片,很難辨別,往往需要進一步的Southern印跡雜交才有可能判斷,因此不利于鑒定。鑒于此,后來人們先用通用引物去擴增不同物種的同一個分子區(qū)段,然后再用限制性內(nèi)切酶去酶切該區(qū)段,就可以通過電泳獲得清晰的RFLP圖譜。通常同一物種RFLP圖譜相同,而不同種則不同。在植物線蟲中,較多的是先擴增ITS區(qū),然后用5～6種限制性內(nèi)切酶對ITS區(qū)進行酶切,獲得各個種的ITS-RFLP圖譜?，F(xiàn)在超過50種的傘滑刃線蟲屬線蟲和超過45種的孢囊線蟲屬線蟲已建立了ITS-RFLP圖譜[50-51],RFLP圖譜已成為這些線蟲鑒定的一個重要依據(jù)。在根結(jié)線蟲中,RFLP方法可以很好地區(qū)分南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲。用引物對C2F3和1108先擴增COⅡ/rrn L之間的序列,兩者均產(chǎn)生大約1.7 kb的序列,再用Hin f I進行酶切,南方根結(jié)線蟲可以產(chǎn)生1.4 kb和0.3 kb兩條帶,而爪哇根結(jié)線蟲則不能被酶切[39]。然而,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)植物線蟲r DNA-ITS和mt DNA存在異質(zhì)性,即種內(nèi)不同個體間甚至個體內(nèi)部在相同區(qū)段存在DNA序列的變異,如果恰好在選用的酶切位點處發(fā)生變異,就會導致PCR-RFLP圖譜產(chǎn)生種內(nèi)差異[51-52]。例如,在孢囊線蟲屬中,至少已發(fā)現(xiàn)6種孢囊線蟲存在ITS異質(zhì)性而使某種酶的酶切譜帶出現(xiàn)2種或2種以上的現(xiàn)象[28,51]。因此,使用RFLP技術鑒定植物線蟲種需要注意序列異質(zhì)性的問題。

3.2 測序比對

直接測序比對的方法是鑒定物種的一個有效方法。在植物線蟲中,通常擴增r DNA的ITS或D2D3序列,或mt DNA的CO I或COⅡ等基因,然后進行測序,再在Gen Bank中進行BLAST比對。1993年,Ferris等[53]最早對孢囊線蟲的ITS區(qū)進行了測序。目前,越來越多的植物線蟲鑒定靶標序列被測定并儲存在GenBank中,而且測序費用也在不斷下降,因此直接測序比對的方法已在植物線蟲鑒定中得到越來越廣泛的應用,該方法必然是今后植物線蟲鑒定的最重要手段之一。

3.3 基于物種特異性引物的PCR擴增

隨著測序技術的飛速發(fā)展,獲得了越來越多的植物線蟲序列。通過序列的比對,人們可以設計出特異性引物來擴增靶標線蟲的靶標序列,然后通過電泳比較擴增條帶的有無及大小即可鑒定靶標線蟲。當然,有一些特異性引物是從早期的多態(tài)性分析分子標記技術,如RAPD技術基礎上發(fā)展來的,我們通常稱之為序列特異性擴增區(qū)(sequence characterized amplified region,SCAR)標記。換言之, SCAR標記就是將目標RAPD片段進行克隆并對其末端測序,根據(jù)RAPD片段兩端序列設計特異引物,對基因DNA片段再進行PCR特異擴增。一個好的SCAR標記可以快速檢測大量個體,結(jié)果穩(wěn)定性好,重現(xiàn)性高,比如Zijlstra和Donkers-Venne[54]在RAPD基礎上設計的用來區(qū)分3種常見根結(jié)線蟲(南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲)的SCAR標記(Finc/Rinc、Fjav/Rjav和Far/Rar)一直受到人們的青睞及使用。相對于測序比對,利用特異性引物的PCR擴增(或稱特異性PCR擴增)方法更快速、簡單、直觀,因此得到廣泛的應用。鑒定孢囊線蟲、根結(jié)線蟲和短體線蟲的一些物種特異性引物可參考幾本專著[28,5556]。

在特異性PCR擴增基礎上發(fā)展起來的雙重PCR(duplex PCR)或多重PCR(multiplex PCR)技術也是植物線蟲鑒定的一種重要方法。雙重PCR或多重PCR是利用兩對或兩對以上的引物在單個PCR反應中擴增出多個核苷酸片段,以達到同時檢測多個物種的目的。多重PCR的概念是在1988年提出的[57],此后被廣泛應用在物種的鑒定上。該技術也不斷被用于植物線蟲的檢測和鑒定,比如對一些常見根結(jié)線蟲種的鑒定,Hu等[18]用4對引物同時鑒定南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲;Kiewnick等[58]同時使用3對引物鑒定3種常見的根結(jié)線蟲——南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲。另外對松材線蟲(B.x ylophilus)及其近似種的區(qū)分和鑒定,如Jiang等[59]用2對引物鑒定松材線蟲;Zhuo等[60]用5條引物同時鑒定3種松材組線蟲——松材線蟲、擬松材線蟲(B.mucronatus)和豆傘滑刃線蟲(B.doui)。還有對短體線蟲一些近似種的區(qū)分和鑒定,如Wang等[61]用2對引物區(qū)分甘蔗上的兩個近似種——擬玉米短體線蟲(P.parazeae)和玉米短體線蟲(P.zeae)。多重PCR可以加快檢測的速度,但如果在一個反應體系中存在一對以上的引物,那引物相互間可能會互相干擾,導致PCR反應體系不穩(wěn)定,因此多重PCR反應體系通常需要花費較多的時間進行優(yōu)化[62]。

3.4 實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,最后還可通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。與傳統(tǒng)PCR相比,qPCR反應更快、更靈敏,可對整個PCR進程進行實時監(jiān)測,另外不僅可定性,還可定量。因此,該技術從發(fā)明以來,在臨床疾病診斷和植物病害診斷等領域得到快速發(fā)展。qPCR在植物線蟲的檢測中,通常有SYBR GreenⅠ法和Taq Man探針法。由于qPCR整個檢測過程通常只需要0.5～2 h,因此其在檢疫部門得到廣泛的應用。國內(nèi)外有大量的研究報道利用qPCR技術檢測松材線蟲[63-67]。另外,一些重要的植物病原線蟲,如馬鈴薯白線蟲(G.pallida)和甜菜孢囊線蟲(H. schachtii)[68]、馬鈴薯金線蟲(G.rostochiensis)和南方根結(jié)線蟲[69]等,也有用qPCR進行快速檢測的報道。結(jié)合多重PCR技術,人們還發(fā)明了多重qPCR技術同時檢測幾種線蟲,例如在一個qPCR體系中同時檢測哥倫比亞根結(jié)線蟲(M.chitwoodi)和偽根結(jié)線蟲(M.fallax)[70]及同時檢測3種球孢囊線蟲——馬鈴薯金線蟲、馬鈴薯白線蟲和煙草球孢囊線蟲(G.tabacum)[71]。

此外,我們還可利用qPCR測定土壤中的線蟲密度。由于qPCR反應中切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例,因此根據(jù)PCR反應液的熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量,從而計算出線蟲的數(shù)量。近年來,該方法在土壤線蟲的定量研究中越來越受到重視,如Yan等對土壤中落選短體線蟲和桑尼短體線蟲的定量[16,72];宋志強等對土壤中南方根結(jié)線蟲的定量[73]。

3.5 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是于2000年發(fā)明的一種DNA擴增技術[74]。該技術能在60～65℃的等溫條件下,短時間(一般不超過1 h)內(nèi)進行核酸擴增;使用一對外部引物和一對內(nèi)部引物,識別靶標序列上6個不同的區(qū)域,因此對靶標序列具有高度的特異性;擴增產(chǎn)物的檢測方法多樣,除了可電泳檢測,也可在反應體系中加入染料,根據(jù)顏色的變化直接用肉眼觀察,還可利用濁度儀檢測擴增產(chǎn)物的混濁度。與傳統(tǒng)PCR相比,LAMP不需要昂貴的PCR儀,也不需要跑電泳,因此具有簡便、快速、精確、特異和低價的特點。該技術目前廣泛應用于病原物的檢測,在植物病原真菌和細菌的檢測方面已有一些應用[7576]。在植物線蟲學領域,近年來也有一些成功的例子,包括對松材線蟲、根結(jié)線蟲和相似穿孔線蟲的檢測[19,7779]?？偟膩砜?LAMP技術是一個相對比較新且具有一定實用性的分子檢測技術。目前LAMP技術在植物線蟲領域應用還較少,值得今后進一步研究。

4 DNA條形碼

DNA條形碼(DNA barcoding)是一個相對較新的概念,是2003年Hebert提出來的,即利用一段短的標準DNA序列作為標記來實現(xiàn)快速、準確的物種鑒定,就像超市利用條形碼掃描區(qū)分成千上萬種不同的商品[80]。通常拿來作條形碼的DNA片段需要滿足幾個條件：(1)在種間有足夠的差異;(2)不要太長,以便擴增;(3)兩端序列保守,容易設計通用引物[81]。mt DNA比r DNA進化更快,有足夠的差異去區(qū)分近緣種,其中mtCO I基因大約為650 bp,較好地符合上述條件,因此常被當做動物鑒定的條形碼[80,82-84]。在線蟲中,已有研究發(fā)現(xiàn)mtCO I基因可以作為海洋自由生活線蟲的DNA條形碼[85],然而植物線蟲的mtDNA研究還很少。在植物線蟲中研究較多的幾個r DNA片段,如ITS、D2D3和18S r RNA,有的在一些植物線蟲屬中變異太大,有的又太保守,Subbotin等[86]認為種內(nèi)變異、旁系同源拷貝或無法區(qū)分最近形成的物種等因素部分限制了r DNA的使用。因此,不同的植物線蟲類群也許需要不同的DNA條形碼,或者需要多個基因片段作為條形碼?？傊?植物線蟲的DNA條形碼研究才剛起步,需要獲得更多的序列以便更深入的研究。

5 問題與展望

植物線蟲分子鑒定起步相對較晚,目前已經(jīng)獲得序列的植物線蟲種類還較少,因此當前還不可能完全依賴分子手段來對植物線蟲進行鑒定。此外,根據(jù)目前的研究,在植物線蟲鑒定中常用的r DNAITS序列在某些線蟲中變異大[33-35],而在某些線蟲中又很保守[7,24,32],因此針對不同的線蟲類群,需要在研究足夠多序列的前提下,了解清楚序列的種內(nèi)變異及種間變異的范圍,才能更好地選擇合適的鑒定靶標。當前,分子手段已經(jīng)給植物線蟲的檢測和鑒定提供了快速、精確、可靠的方法。尤其對一些生產(chǎn)上重要種類的快速檢測,以及區(qū)分一些形態(tài)上十分相似的近緣種,分子鑒定給我們帶來了極大的幫助。近年在形態(tài)學基礎上,結(jié)合分子手段鑒定了一些僅從形態(tài)上不好確定的新種,如與鱗球莖線蟲(D.dipsaci)形態(tài)相似的巨大莖線蟲(D.gigas)[29],與咖啡短體線蟲(P.coffeae)形態(tài)基本難以區(qū)分的斯派吉爾短體線蟲(P.speijeri)[87],與玉米短體線蟲形態(tài)相近的擬玉米短體線蟲[61]。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展及更多的植物線蟲序列被測定,可能會有更簡單、方便、可靠的分子鑒定方法被發(fā)明。不論是現(xiàn)在,還是將來,分子鑒定方法都是植物線蟲鑒定的一個有力工具。

[1] Decraemer W,Geraert E.Ectoparasitic nematodes[M]∥Perry R N,Moens M.Plant Nematology.Wallingford,Oxfordshire：CAB International,2006：153-184.

[2] Nicol J M,Turner S J,Coyne D L,et al.Current nematode threats to world agriculture[M]∥Jones J T,Gheysen G, Fenoll C.Genomics and molecular genetics of plant-nematode interactions.Heidelberg：Springer,2011：21-44.

[3] Jones J T,Haegeman A,Danchin E G,et al.Top 10 plantparasitic nematodes in molecular plant pathology[J].Molecular Plant Pathology,2013,14(9)：946-961.

[4] 馮志新.植物線蟲學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2001.

[5] Coomans A.Present status and future of nematode systematics[J]. Nematology,2002,4(5)：573-582.

[6] Dickson D,Sasser J,Huisingh D.Comparative disc-electrophoretic protein analyses of selected Meloidogyne,Ditylenchus,Heterodera and Aphelenchus spp.[J].Journal of Nematology,1970,2(4)：286-293.

[7] Blok V C,Phillips M S,Fargette M.Comparison of sequences fromthe ribosomal DNA intergenic region of Meloidogyne mayaguensis and other major tropical root-knot Nematodes[J].Journal of Nematology,1997,29(1)：16-22.

[8] Williamson V M,Caswell-Chen E P,Westerdahl B B,et al.A PCR assay to identify and distinguish single juveniles of Meloidogyne hapla and M.chitwoodi[J].Journal of Nematology, 1997,29(1)：9-15.

[9] Adam M A M,Phillips M S,Blok V C.Molecular diagnostic key for identification of single juveniles of seven common and economically important species of root-knot nematode(Meloidogyne spp.)[J].Plant Pathology,2007,56(1)：190-197.

[10]Mundo-Ocampo M,Troccoli A,Subbotin S A,et al.Synonymy of Afenestrata with Heterodera supported by phylogenetics with molecular and morphological characterisation of H.koreana comb.n.and H.orientalis comb.n.(Tylenchida：Heteroderidae)[J].Nematology,2008,10(5)：611-632.

[11]卓侃,胡茂秀,廖金鈴,等.廣東省和海南省象耳豆根結(jié)線蟲的鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報,2008,27(2)：193-197.

[12]王江嶺,張建成,顧建鋒.單條線蟲DNA提取方法[J].植物檢疫,2011,25(2)：32-35.

[13]Porteous L A,Armstrong J L.A simple mini-method to extract DNA directly from soil for use with polymerase chain reaction amplification[J].Current Microbiology,1993,27(2)：115-118.

[14]Sayed Abdul Rahman S A,Mohamed Z,Othman R Y,et al.In planta PCR-based detection of early infection of plant-parasitic nematodes in the roots：A step towards the understanding of infection and plant defence[J].European Journal of Plant Pathology,2010,128：343-351.

[15]Atkins S D,Manzanilla-López R H,Franco J,et al.A molecular diagnostic method for detecting Nacobbus in soil and in potato tubers[J].Nematology,2005,7(2)：193-202.

[16]Yan G P,Smiley R W.Detection and discrimination of Pratylenchus neglectus and P.thornei in DNA extracts from soil[J]. Plant Disease,2008,92(11)：1480-1487.

[17]Min Y Y,Toyota K,Goto K,et al.Development of a direct quantitative detection method for Meloidogyne incognita in sandy soils and its application to sweet potato cultivated fields in Tokushima prefecture,Japan[J].Nematology,2010,13 (1)：95-102.

[18]Hu M X,Zhuo K,Liao J L.Multiplex PCR for the simultaneous identification and detection of Meloidogyne incognita,M. enterolobii,and M.javanica using DNA extracted directly from individual galls[J].Phytopathology,2011,101(11)：1270-1277.

[19]Peng H,Peng D L,Hu X Q,et al.Loop-mediated isothermal amplification for rapid and precise detection of the burrowing nematode,Radopholus similis,directly from diseased plant tissues[J].Nematology,2012,14(8)：977-986.

[20]De Giorgi C,Sialer M F,Lamberti F.Formalin-induced infidelity in PCR-amplified DNA fragments[J].Molecular and Cellular Probes,1994,8(6)：459-462.

[21]Thomas W K,Vida J T,Frisse L M,et al.DNA sequences from formalin-fixed nematodes：integrating molecular and morphological approaches to taxonomy[J].Journal of Nematology,1997,29(3)：250-254.

[22]Bhadury P,Austen M C,Bilton D T,et al.Combined morphological and molecular analysis of individual nematodes through short-term preservation in formalin[J].Molecular Ecology Notes,2005,5(40)：965-968.

[23]Rubtsova T V,Moens M,Subbotin S A.PCR amplification of a r RNA gene fragment from formalin-fixed and glycerine-embedded nematodes from permanent slides[J].Russian Journal of Nematology,2005,13(2)：137-140.

[24]Powers T O,Todd T C,Burnell A M,et al.The rDNA internal transcribed spacer region as a taxonomic marker for nematodes[J].Journal of Nematology,1997,29(4)：441-450.

[25]Gasser R B,Newton S E.Genomic and genetic research on bursate nematodes：Significance,implications and prospects[J]. International Journal for Parasitology,2000,30：509-534.

[26]Subbotin S A,Vierstraete A,De Ley P,et al.Phylogenetic relationships within the cyst-forming nematodes(Nematoda, Heteroderidae)based on analysis of sequences from the ITS regions of ribosomal DNA[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2001,21：1-16.

[27]Kai M,Braasch H,Gu J F,et al.Variation in ITS and 28S rRNA of Bursaphelenchus species(Nematoda：Parasitaphelenchidae)[M]∥Mota M M,Vieira P.Pine wilt disease：A worldwide threat to forest ecosystems.Heidelberg：Springer, 2008：151-164.

[28]Subbotin S A,Mundo-Ocampo M,Baldwin J G.Systematics of cyst nematodes(Nematoda：Heteroderinae)[M]∥Hunt D J, Perry R N.Nematology monographs and perspectives 8B.Leiden,Netherlands：Brill,2010.

[29]Vovlasa N,Troccolia A,Palomares-Rius J E,et al.Ditylenchus gigas n.sp.parasitizing broad bean：a new stem nematode singled out from the Ditylenchus dipsaci species complex using a polyphasic approach with molecular phylogeny[J].Plant Pathology,2011,60：762-775.

[30]Maafi Z T,Amani M,Stanley J D,et al.Description of Tylenchulus musicola sp.n.(Nematoda：Tylenchulidae)from banana in Iran with molecular phylogeny and characterisation of species of Tylenchulus Cobb,1913[J].Nematology,2012,14：353-369.

[31]Zhuo K,Wang H H,Ye W,et al.Cryphodera sinensis n.sp. (Nematoda：Heteroderidae),a non-cyst-forming parasitic nematode from the root of ramie Boehmeria nivea in China[J]. Journal of Helminthology,2014,88：468-480.

[32]Zijlstra C,Lever A E M,Uenk BJ,et al.Differences between ITS regions of isolates of the root-knot nematodes Meloidogyne hapla and M.chitwoodi[J].Phytopathology,1995,85：1231-1237.

[33]Waeyenberge L,Ryss A,Moens M,et al.Molecular charac-terisation of 18 Pratylenchus species using r DNA restriction fragment length polymorphism[J].Nematology,2000,2(2)：135-142.

[34]Waeyenberge L,Viaene N,Moens M,et al.Species-specific duplex PCR for the detection of Pratylenchus penetrans[J]. Nematology,2009,11(6)：847-857.

[35]De Luca F,Reyes A,Troccoli A,et al.Molecular variability and phylogenetic relationships among different species and populations of Pratylenchus(Nematoda：Pratylenchidae)as inferred from the analysis of the ITS r DNA[J].European Journal of Plant Pathology,2011,130(3)：415-426.

[36]He Y,Subbotin S A,Rubtsova T V,et al.A molecular phylogenetic approach to Longidoridae(Nematoda：Dorylaimida) [J].Nematology,2005,7(1)：111-124.

[37]Subbotin S A,Sturhan D,Chizhov V N,et al.Phylogenetic analysis of Tylenchida Thorne,1949 as inferred from D2 and D3 expansion fragments of the 28S r RNA gene sequences[J]. Nematology,2006,8(3)：455-474.

[38]Petersen D J,Vrain T C.Rapid identification of Meloidogyne chitwoodi,M.hapla,and M.fallax using PCR primers to amplify their ribosomal intergenic spacer[J].Fundamental and Applied Nematology,1996,19(6)：601-605.

[39]Powers T O,Harris T S.A polymerase chain reaction method for identification of five major Meloidogyne species[J].Journal of Nematology,1993,25(1)：1-6.

[40]Powers T O,Mullin P G,Harris T S.Incorporating molecular identification of Meloidogyne spp.into a large-scale regional nematode survey[J].Journal of Nematology,2005,37(2)：226-235.

[41]卓侃,胡茂秀,王宏洪,等.高爾夫果嶺草坪草上禾本科根結(jié)線蟲的鑒定[J].草業(yè)學報,2011,20(1)：253-256.

[42]Kanzaki N,Futai K.A PCR primer set for determination of the phylogenetic relationship of Bursaphelenchus species within the xylophilus group[J].Nematology,2002,4(1)：35-41.

[43]Lazarova S S,Malloch G,Oliveira C M G,et al.Ribosomal and mitochondrial DNA analyses of Xiphinema americanum-group populations[J].Journal of Nematology,2006,38(4)：404-410.

[44]Setterquist R A,Smith G K,Jones R,et al.Diagnostic probes targeting the major sperm protein gene that may be useful in the molecular identification of nematodes[J].Journal of Nematology,1996,28：414-421.

[45]Skantar A M,Carta L K.Molecular characterization and phylogenetic evaluation of the hsp 90 gene from selected nematodes [J].Journal of Nematology,2004,36(4)：466-480.

[46]Kovaleva E S,Subbotin S A,Masler E P,et al.Molecular characterization of the actin gene from cyst nematodes in comparison with those from other nematodes[J].Comparative Parasitology,2005,72(1)：39-49.

[47]Chronis D,Chen S Y,Skantar A M,et al.A new chorismate mutase gene identified from Globodera ellingtonae and its utility as a molecular diagnostic marker[J].European Journal of Plant Pathology,2014,139(2)：245-252.

[48]Mokrini F,Waeyenberge L,Viaene N,et al.Theβ-1,4-endoglucanase gene is suitable for the molecular quantification of the root-lesion nematode,Pratylenchus thornei[J].Nematology,2014,16(7)：789-796.

[49]Curran J,McClure M A,Webster J M.Genotypic differentiation of Meloidogyne populations by detection of restriction fragment length difference in total DNA[J].Journal of Nematology,1986,18(1)：83-86.

[50]卓侃,王宏洪,李迅東,等.中國2種傘滑刃屬線蟲記述(線蟲門：寄生滑刃科)[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報,2011,30(3)：305-311.

[51]卓侃,宋漢達,王宏洪,等.旱稻孢囊線蟲在廣西的發(fā)生及其rDNA-ITS異質(zhì)性分析[J].中國水稻科學,2014,28(1)：78-84.

[52]Burgermeister W,Braasch H,Metge K,et al.ITS-RFLP analysis,an efficient tool for differentiation of Bursaphelenchus species[J].Nematology,2009,11(5)：649-668.

[53]Ferris V R.The future of nematode systematics[J].Fundamental and Applied Nematology,1994,17(2)：97-101.

[54]Zijlstra C,Donkers-Venne D T H M,Fargette M.Identification of Meloidogyne incognita,M.javanica and M.arenaria using sequence characterised amplified region(SCAR)based PCR assays[J].Nematology,2000,2(8)：847-853.

[55]Perry R N,Moens M,Starr J L.Root-knot nematodes[M]. New York：CABI Publishing,2009.

[56]Castillo P,Vovlas N.Pratylenchus(Nematoda：Pratylenchidae)：diagnosis,biology,pathogenicity and management[M]. Leiden：Brill,2007.

[57]Chamberlain J S,Gibbs R A,Ranier J E,et al.Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification[J].Nucleic Acids Research,1988,16 (23)：11141-11156.

[58]Kiewnick S,Wolf S,Willareth M,et al.Identification of the tropical root-knot nematode species Meloidogyne incognita, M.javanica and M.arenaria using a multiplex PCR assay[J]. Nematology,2013,15(7)：891-894.

[59]Jiang L Q,Zheng J W,Waeyenberge L,et al.Duplex PCR based identification of Bursaphelenchus xylophilus(Steiner& Buhrer,1934)Nickel,1970[J].Russian Journal of Nematology,2005,13(2)：115-121.

[60]Zhuo K,Luo M,Cui R Q,et al.A multiplex one-step PCR method for the simultaneous identification of Bursaphelenchus xylophilus,B.mucronatus and B.doui-three species within the xylophilus group[J].Forest Pathology,2011,41：66-69.

[61]Wang H H,Zhuo K,Ye W,et al.Morphological and molecular characterisation of Pratylenchus parazeae n.sp.(Nematoda：Pratylenchidae)parasitizing sugarcane in China[J].European Journal of Plant Pathology,2015,143(1)：173-191.

[62]Shen Z Y,Qu W B,Wang W,et al.MPprimer：A program for reliable multiplex PCR primer design[J].BMC Bioinformatics,2010,11：143.

[63]Cao A X,Liu X Z,Zhu S F,et al.Detection of the pinewood nematode,Bursaphelenchus xylophilus,using a real-time polymerase chain reaction assay[J].Phytopathology,2005,95(5)：104-133.

[64]王金成,季鐳,楊秀麗,等.松材線蟲Taq Man探針實時熒光PCR診斷[J].植物病理學報,2006,36(3)：281-284.

[65]Fran?ois C,Castagnone C,Boonham N,et al.Satellite DNA as a target for Taq Man real-time PCR detection of the pinewood nematode,Bursaphelenchus xylophilus[J].Molecular Plant Pathology,2007,8(6)：803-809.

[66]Takeuchi Y,Futai K.Diagnosis and quantification of the pine wood nematode,Bursaphelenchus xylophilus(Steiner&Buhner),in wood of Pinus thunbergii with real-time PCR[J]. Nematological Research,2009,39(1)：9-16.

[67]Huang L,Ye J R,Wu X Q,et al.Detection of pine wood nematode using a real-time PCR assay to target the DNA topoisomerase I gene[J].European Journal of Plant Pathology, 2010,127(1)：89-98.

[68]Madania M,Subbotina S A,Moens M.Quantitative detection of the potato cyst nematode,Globodera pallida,and the beet cyst nematode,Heterodera schachtii,using real-time PCR with SYBR Green I dye[J].Molecular and Cellular Probes, 2005,19：81-86.

[69]Toyota K,Shirakashi T,Sato E,et al.Development of a realtime PCR method for the potato-cyst nematode Globodera rostochiensis and the root-knot nematode Meloidogyne incognita [J].Soil Science&Plant Nutrition,2008,54(1)：72-76.

[70]Zijlstra C,van Hoof R A.A multiplex real-time polymerase chain reaction(Taq Man)assay for the simultaneous detection of Meloidogyne chitwoodi and M.fallax[J].Phytopathology, 2006,96(11)：1255-1262.

[71]Madania M,Warda L J,De Boera S H.Multiplex real-time polymerase chain reaction for identifying potato cyst nematodes,Globodera pallida and Globodera rostochiensis,and the tobacco cyst nematode,Globodera tabacum[J].Canadian Journal of Plant Pathology,2008,30(4)：554-564.

[72]Yan G,Smiley R W,Okubara P A,et al.Detection and discrimination of Pratylenchus neglectus and P.thornei in DNA extracts from soil[J].Plant Disease,2008,92(11)：1480-1487.

[73]宋志強,王暄,林宇,等.土壤中南方根結(jié)線蟲的實時熒光PCR檢測和定量[J].植物保護學報,2013,40(3)：255-260.

[74]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research, 2000,28：E63.

[75]Dai T T,Lu C C,Lu J,et al.Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Phytophthora sojae[J].FEMS Microbiology Letters,2012,334：27-34.

[76]Harper S J,Ward L I,Clover G R G.Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications[J].Phytopathology,2010,100：1282-1288.

[77]Kikuchi T,Aikawa T,Oeda Y,et al.A rapid and precise diagnostic method for detecting the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus by loop-mediated isothermal amplification [J].Phytopathology,2009,99：1365-1369.

[78]Niu J H,Guo Q X,Jian H,et al.Rapid detection of Meloidogyne spp.by LAMP assay in soil and roots[J].Crop Protection,2011,30：1063-1069.

[79]Niu J H,Jian H,Guo Q X,et al.Evaluation of loop-mediated isothermal amplification(LAMP)assays based on 5S r DNAIGS2 regions for detecting Meloidogyne enterolobii[J].Plant Pathology,2012,61：809-819.

[80]Hebert P D N,Cywinska A,Ball S L.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proceedings of the Royal Society of London.Series B：Biological Sciences,2003,270(1512)：313-321.

[81]Nega A.Review on nematode molecular diagnostics：from bands to barcodes[J].Journal of Biology,Agriculture and Healthcare,2014, 4(27)：129-153.

[82]Hebert P D N,Ratnasingham S,de Waard J R.Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].Proceedings of the Royal Society of London.Series B：Biological Sciences,2003,270(S1)：S96-S99.

[83]Hebert P D N,Penton E H,Burns J M,et al.Ten species in one：DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004,101(41)：14812-14817.

[84]Hebert P D N,Stoeckle M Y,Zemlak T S,et al.Identification of birds through DNA barcodes[J].PLoS Biology,2004,2 (10)：e312.

[85]Derycke S,Vanaverbeke J,Rigaux A,et al.Exploring the use of cytochrome oxidase c subunit 1(COI)for DNA barcoding of freeliving marine nematodes[J].PLoS ONE,2010,5(10)：e13716.

[86]Subbotin S A,Ragsdale E J,Mullens T,et al.A phylogenetic framework for root lesion nematodes of the genus Pratylenchus (Nematoda)：Evidence from 18S and D2-D3 expansion segments of 28S ribosomal RNA genes and morphological characters[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2008,48(2)：491-505.

[87]De Luca F,Troccoli A,Duncan L W,et al.Pratylenchusspeijeri n.sp.(Nematoda：Pratylenchidae),a new root-lesion nematode pest of plantain in West Africa[J].Nematology,2012, 14(8)：987-1004.

(責任編輯：田 喆)

Advances in molecular identification of plant nematodes

Zhuo Kan1, Liao Jinling1,2

(1.Laboratory of Plant Nematology,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 2.Guangdong Vocational College of Ecological Engineering,Guangzhou 510520,China)

Plant nematodes can damage crops and trees.The accurate identification of plant nematodes is the basis for the control of plant nematode diseases.It is very challenging to identify plant nematode species only based on morphology,because plant nematodes are microscopic in size,and some morphological characters may have interspecific overlapping or intraspecific variability.Molecular techniques provide a fast,accurate and reliable method for the detection and identification of plant nematodes.For promoting the deep study on molecular identification of plant nematodes,this paper summarized research progresses in and current research status on DNA extraction of plant nematodes,target sequences for identifying plant nematodes and the main molecular identification methods for plant nematodes.

plant nematode; molecular identification; DNA; PCR

S 432.45

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.001

2014-10-06

2014-10-13

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201103018)

*通信作者 E-mail：jlliao@scau.edu.cn